La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo."— Transcript della presentazione:

1 L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo di: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC) (CAS-4c) Giorgio Bonaga

2 RICHIAMO DI CHIMICA AUTODISSOCIAZIONE DELLACQUA H3O+H3O+ - OH ? H2OH2OH2OH2O

3 Nellacqua pura è molto piccola la percentuale di molecole dissociate in ioni ossonio e ioni ossidrile, secondo lequilibrio: H 2 O + H 2 O H 3 O OH A 25°C, la costante di equilibrio è espressa dalla: K dis = = 1, Il valore della costante di equilibrio conferma che lequilibrio è decisamente spostato verso sinistra, tanto che il termine relativo alla concentrazione dellacqua allequilibrio ([H2O] eq ), - pari alla concentrazione iniziale dellacqua ([H2O] iniz ) meno la frazione x di molecole dacqua che si dissociano ([H2O] iniz – x) - in realtà si può equiparare alla concentrazione iniziale dellacqua ([H2O] eq = [H2O] iniz ), perché lapprossimazione è ininfluente. Tenendo conto che la concentrazione iniziale di 1 litro di acqua pura è, a temperatura costante, una costante: [H 2 O] iniz = = = = 55,55 mol/litro [H 3 O + ]. [ - OH] [H 2 O] iniz numero moli volume peso acqua mol wt. 1 litro 1000 g 18 1 l Giorgio Bonaga

4 La K dis può essere espressa da una nuova costante, detta prodotto ionico dellacqua : K W = = K dis = 1, ,55 = In considerazione del fatto che da ogni molecola dacqua dissociata si produce uno ione ossonio e uno ione ossidrile, è ovvio che la concentrazione di queste due specie ioniche è la medesima: Si può scrivere che: = K W = grammo-ioni/l A 25°C, in un litro dacqua pura (volume costante) sono presenti (1/ ) grammo-ioni (grammo-moli) ossonio e (1/ ) grammo-ioni (grammo- moli) ossidrile soluzione neutra soluzione acida soluzione basica Essendo una reazione endotermica la dissociazione dellacqua - nel rispetto del principio di Le Chatelier - aumenta allaumentare della temperatura e pertanto la neutralità, a temperature superiori a 25°C, si raggiunge con concentrazioni degli ioni ossonio e ossidrile leggermente superiori a grammo-moli/litro.. [ H 2 O] iniz [H 3 O + ] = [ - OH] [H 3 O + ] > [ - OH] [H 3 O + ] < [ - OH] [H 3 O + ] = [ - OH] [H 3 O + ]. [ - OH] Giorgio Bonaga

5 pH e pOH (pH = pondus hydrogenii = potenziale dellidrogeno) (pOH = pondus oxidrilii = potenziale dellossidrile) Lordine di grandezza estremamente piccolo delle concentrazioni degli ioni ossonio ed ossidrile suggerisce lintroduzione di un operatore matematico che consenta una percezione immediata del carattere neutro, acido e basico delle soluzioni ed anche un calcolo più rapido nelle applicazioni quantitative di questi concetti. Questo operatore è il logaritmo negativo in base dieci (- log) che, come tutti i logaritmi, esprime lesponente da dare alla base per ottenere il numero. Concettualmente lintroduzione del logaritmo capovolge lobiettivo del calcolo matematico delle concentrazioni delle soluzioni. Infatti, se la simbologia [H3O + ] = indica che sono presento grammo-ioni H 3 O + in 1 litro di soluzione, il –log [H 3 O + ] = pH = - log = 6 individua invece lesponente che bisogna dare alla base 10 per ottenere in quanti litri di soluzione è presente 1 grammo-ione H 3 O +, ovvero 10 6 litri. Il pH, pertanto, non definisce la concentrazione degli ioni ossonio della soluzione, ma invece la diluizione di una soluzione che contiene 1 grammo-ione di H 3 O +. Il discorso è del tutto analogo per il pOH. Giorgio Bonaga

6 Il cologaritmo in base dieci (-log) converte la concentrazione ( volume costante e soluto variabile ) in diluizione ( soluto costante e volume variabile ), ovvero esprime in quanti litri ( diluizione ) di acqua pura è presente 1 grammo-ione ossonio (o ossidrile) anziché quanti grammo-ioni di ossonio (o di ossidrile) sono presenti in 1 litro dacqua pura ( concentrazione ). 1/ (10 -7 ) grammo-ioni H 3 O + in 10 0 litri dacqua pura (CONCENTRAZIONE) - log Giorgio Bonaga 10 0 grammo-ione H 3 O + in (10 7 ) litri dacqua pura (DILUIZIONE)

7 Giorgio Bonaga

8 Giorgio Bonaga Dal momento che nellacqua pura [H 3 O + ] = [ - OH] = è intuitivo che nellacqua pura: pH = pOH = 7 ed anche che: pH + pOH = 14da cui:pOH = 14 – pHe pH = 14 - pOH Dal concetto stesso di pH si può dedurre che esso varia nellintervallo 0-14 per soluzioni 1N, ma anche che il pH può assumere valori inferiori a 0 e superiori a 14 in soluzioni di concentrazione > 1N ESEMPIO Qual è il pH di una soluzione 10 N di HCl ? Essendo lHCl un acido forte completamente dissociato, la N della soluzione fornisce direttamente la concentrazione di ioni ossonio: [H 3 O + ] = 10 = 10 1 pH = - log 10 1 = -1 (è presente un grammo-ione H 3 O + in litro = 1/10 litro = 100 ml)

9 Giorgio Bonaga [H 3 O + ]pH[ - OH]pOH

10 pka e pkb Per il calcolo del pH di soluzioni di acidi e basi deboli non è sufficiente conoscere la loro concentrazione iniziale, in quanto non sono completamente dissociati in soluzione acquosa. Per determinare quale concentrazione assumeranno gli ioni H 3 O + (o - OH) è quindi necessario conoscere anche la loro costante di dissociazione. 1) Per un generico acido monoprotico HA, l'equilibrio di dissociazione è: HA + H 2 O H 3 O + + A - La costante di equilibrio, detta costante di dissociazione acida (o kappa acida), è: ka = Analogamente al pH, anche la costante di dissociazione acida può essere convertita nella diluizione di ioni ossonio in soluzione, utilizzando il logaritmo negativo in base 10 della ka: pka = – log ka Più elevato è il valore del pka maggiore è la diluizione degli ioni ossonio, ovvero più elevato è il pka minore è la forza dellacido. Giorgio Bonaga [H 3 O + ]. [A - ] [HA]

11 Per gli acidi deboli poliprotici ci sono tante costanti di dissociazione quanti sono gli atomi di idrogeno dissociabili: costante di prima dissociazione (ka I ), costante di seconda dissociazione (ka II ), ecc., dalle quali si possono calcolare le corrispondenti pka I, pka II, ecc. H 2 SO 3 + H 2 O H 3 O + + HSO3 - ka I = = 1, HSO H 2 O H 3 O + + SO 3 -- ka II = = 1, Naturalmente l'acido cede più facilmente il primo protone H +, mentre il secondo protone H +, che deve staccarsi da uno ione negativo, è trattenuto con maggiore forza. Il primo equilibrio di dissociazione è quindi più spostato verso destra del secondo. È questo un comportamento generale: tutti gli acidi deboli poliprotici mostrano valori decrescenti delle ka successive alla prima e pertanto anche valori crescenti dei pka. Giorgio Bonaga [H 3 O + ]. [HSO3 - ] [H 2 SO 3 ] [H 3 O + ]. [SO3 -- ] [HSO3 - ]

12 2) Per una generica base monossidrilica BOH, l'equilibrio di dissociazione è: BOH B OH La costante di equilibrio, detta costante di dissociazione basica (o kappa basica), è: kb = Anche la costante di dissociazione basica può essere convertita nella diluizione di ioni ossidrile in soluzione, utilizzando il logaritmo negativo in base 10 della kb: pkb = – log kb Più elevato è il valore del pkb maggiore è la diluizione degli ioni ossidrile, ovvero più elevato è il pkb minore è la forza della base. Giorgio Bonaga [B + ]. [ - OH] [BOH] Per le basi deboli poliossidriliche ci sono tante costanti di dissociazione quanti sono gli ossidrili dissociabili: costante di prima dissociazione (kb I ), costante di seconda dissociazione (kb II ), ecc., dalle quali si possono calcolare le corrispondenti pkb I, pkb II, ecc. Naturalmente la base cede più facilmente il primo ossidrile - OH, mentre il secondo ossidrile - OH, che deve staccarsi da uno ione positivo, è trattenuto con maggiore forza. È questo un comportamento generale: tutti le basi deboli poliossidriliche mostrano valori decrescenti delle kb successive alla prima e pertanto anche valori crescenti dei pkb.

13 C) CROMATOGRAFIA IONICA 1) CROMATOGRAFIA DI SCAMBIO IONICO (Ion Exchange Chromatography = IEC) 1. GENERALITA È idonea alla separazione di composti ionici o ionizzabili (acidi e basi organiche) che possono interagire con gruppi ionici. FASE STAZIONARIA: polimeri o silice funzionalizzata a cui sono legati gruppi carichi: anioni sulfonil- (-SO 3 - ) o carbossil- (–COO - ) come scambiatori di cationi; cationi dialchilammino- (-NHR 2 + ) o trialchilammino- (-NR 3 + ) come scambiatori di anioni. FASE MOBILE: contiene un controione di carica opposta al gruppo ionico della superficie, in uno stato di equilibrio per effetto della formazione di una coppia ionica. Lo scambio dipende dal pH della fase mobile, dalla forza ionica (selettività) degli ioni fissati sulla fase stazionaria e dalla forza ionica dello ione della fase mobile che con essi si scambia, dallattività (concentrazione) dello ione della fase mobile, dalla temperatura. Giorgio Bonaga

14 SCAMBIATORE CATIONICO: anioni sulfonil- H+H+ Na + Rb + K+K+ Li + Giorgio Bonaga

15 fase stazionaria silice scambiatrice (anionica) fase mobile (ionica) CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI SCAMBIO IONICO Scambio cationico + + Na +K+K Giorgio Bonaga Si O O S O - O O S O O S + Cs

16 SCAMBIATORE ANIONICO: cationi trimetilammino- HO - Cl - Giorgio Bonaga

17 fase mobile (ionica) fase stazionaria silice scambiatrice (cationica) CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI SCAMBIO IONICO Scambio anionico + - OH - CN - Cl - CN Giorgio Bonaga Si R R N+N+ R R R N+N+ R R R N+N+ R

18 EQUILIBRI IONICI NELLA IEC X + (sol) + Y + - O 3 S-FS X + - O 3 S-FS + Y + (sol) K d = = k [X + - O 3 S-FS] [Y + (sol) ] [X + (sol) ] [Y + - O 3 S-FS] VMVM VSVS X - (sol) + Y - + NR 3 -FS X - + NR 3 -FS + Y - (sol) K d = = k [X - + NR 3 -FS][Y - (sol) ] [X - (sol) ][Y - + NR 3 -FS] VMVM VSVS scambio anionico scambio cationico La costante di equilibrio di distribuzione K d (o coefficiente di distribuzione ) determina il valore del fattore di capacità k di uno ione e quindi il suo t R. Giorgio Bonaga

19 ORDINE DI SELETTIVITA La K d è condizionata dal tipo di scambiatore e dallattitudine dei due ioni a scambiarsi. Per un particolare scambiatore entrano in gioco due fattori: 1. lo ione che viene fissato 2. il controione che viene spostato Lattitudine dei cationi e degli anioni ad essere fissati sui gruppi carichi della fase stazionaria è direttamente proporzionale al valore della loro K d. Per i cationi e gli anioni si può indicare il rispettivo ordini di selettività : scambio cationico: Ba ++ >Ca ++ >Ni ++ >Cu ++ >Mg ++ >Ag + >Rb + >Cs + >K + >NH 4 + >Na + >H + >Li + E facile comprendere che Na + sposta Li + dalla fase stazionaria, ma non viceversa. O meglio, affinchè Li + sposti Na + in modo significativo occorre aumentare l attività (cioè la concentrazione ionica) di Li + nella soluzione, in modo che lequilibrio, per mantenere costante il valore della K d, si sposti verso destra. scambio anionico: HSO 4 - >ClO 3 - >NO 3 - >ClO 2 - >ClO - >Br - >CN - >HSO 3 - >NO 2 - >Cl - >HCO 3 - > HCOO - >RCOO - >HO - >F - Giorgio Bonaga

20 I fattori che intervengono nello scambio ionico sono: 1. la posizione nellordine di selettività dello ione da fissare nella fase stazionaria; 2. la posizione nellordine di selettività degli ioni da spostare nella fase mobile; 3. le attività (concentrazioni ioniche) dello ione da fissare e degli ioni da spostare; 4. lo ione della fase mobile deve occupare una posizione nellordine di selettività non troppo lontano da quelle degli ioni da spostare. Dopo aver fissato sullo scambiatore Na + e K + si può eluire con una soluzione di Li + Cl - ad opportuna concentrazione. Avviene lo scambio ionico e i due ioni da separare eluiscono con t R differenti: t R K + > t R Na + (in base alla loro posizione nella scala di selettività). Giorgio Bonaga Dopo aver fissato sullo scambiatore Ni ++ e Ba ++, leluizione con una soluzione di Li + Cl - non riuscirebbe a separare i due ioni, perché sono troppo lontani da Li + nella scala della selettività (bisognerebbe eluire con un grande volume di fase mobile e per un tempo lungo). In questo caso si deve usare una fase mobile dotata di maggiore capacità eluente, ad esempio MgCl 2.

21 2. FASE STAZIONARIA Vi sono vari tipi di fasi stazionarie: a) POLIMERI Sono resine ottenute da copolimeri reticolati di stirene-divinilbenzene (8%) sulle quali vengono fissati i gruppi ionogeni positivi e negativi. La reticolazione ha lo scopo di rendere il polimero insolubile nei solventi e di conferirgli una stabilità strutturale alle pressioni di esercizio della colonna, in modo da non restringere troppo la dimensione dei pori. Il diametro delle particelle non deve essere superiore a 10 m per ottimizzare il diametro dei pori. b) SILICE Viene utilizzata silice porosa e silice pellicolare. b1) Silice porosa Costituita da particelle sferiche o irregolari, viene funzionalizzata per silanizzazione allo scopo di fissare le catene ionogene sui gruppi silanolici e sulla superficie dei pori. -CH 2 -CH 2 -COO - carbossietil- (debolmente acido) -CH 2 -CH 2 -SO 3 - sulfoniletil- (fortemente acido) Giorgio Bonaga scambio cationico

22 -CH 2 -CH 2 -NH 3 + amminoetil- (debolmente basico) -CH 2 -CH 2 -N(CH 3 ) 3 - trimetilamminoetil- (fortemente basico) Giorgio Bonaga scambio anionico b2) Silice pellicolare Costituita da particelle sferiche più grandi, viene funzionalizzata solo sulla superficie esterna allo scopo di fissare le catene ionogene soltanto sui gruppi silanolici. PROPRIETA SILICE POROSA SILICE PELLICOLARE RESINA S-DVB diametro ( m) capacita di scambio (meq/g)0,5-2,00,01-0,13-5 rigidità strutturalemolto buonaeccellentescarsa forma delle particellesferica o irregolaresferica pressione di eserciziomolto altabassaalta efficienzaaltamodestabassa tecnica di impaccamentoslurrya seccoslurry intervallo di pH velocità di rigenerazionemediaaltabassa

23 La silice porosa è il materiale che consente le migliori separazioni perché riassume una serie di proprietà idonee a questo tipo di cromatografia: ha una buona capacità di scambio; è resistente alle elevate pressioni di esercizio; ha elevata efficienza; ha una buona capacità di rigenerazione; ha però un limitato intervallo di pH di esercizio (2-8); ha anche un costo elevato, sebbene inferiore a quello dei polimeri. In ogni caso la porosità ideale è quella che non ritarda troppo lo scambio tra la fase stazionaria e la fase mobile allinterno dei pori, porosità che richiede particelle con un diametro non superiore a 10 m. Giorgio Bonaga poro piccoloporo grande + d = 10 m

24 3. FASE MOBILE Le principali caratteristiche della fase mobile sono: a) EFFETTO TAMPONE Le specie ioniche che stanno alla base dello scambio ionico possono derivare da elettroliti forti (sostanze inorganiche) e da elettroliti deboli (sostanze organiche). Lacido acetico e lacido formico, ad esempio, possono essere dissociati o no in funzione del pH. Proprio per garantire che i soluti siano nella forma ionica, la fase mobile deve contenere un componente con capacità tamponante. Naturalmente per lo scambio anionico la fase mobile deve avere valori elevati di pH, mentre per lo scambio cationico deve avere valori sufficientemente bassi di pH. In pratica, la fase mobile deve avere un pH di almeno una unità superiore al pka del soluto nello scambio anionico e di almeno una unità inferiore al pka del soluto nello scambio cationico. ESEMPIO acido acetico: pka = 4,75la fase mobile deve avere pH = 5,75 ione ammonio: pka = 9,0 la fase mobile deve avere pH = 8,0 Giorgio Bonaga

25 Si immagini di dover separare il sistema CH 3 COOH/CH3COO - (pka=4,75) e HCOOH/HCOO - (pka=3,5) con uno scambiatore anionico. a 4,75 3,5 lacido formico si dissocia e lo ione formiato viene trattenuto, mentre lacido acetico, non dissociato, eluisce. a pH > 7,0 entrambi gli acidi sono dissociati e vengono trattenuti in modo differente dalla fase stazionaria (lacido formico è più trattenuto, in base alla scala di selettività). laumento di pH della fase mobile fa aumentare la dissociazione dei soluti nello scambio anionico, pertanto aumentano i loro tempi di ritenzione; la diminuzione di pH della fase mobile produce leffetto contrario la diminuzione di pH della fase mobile fa aumentare la dissociazione dei soluti nello scambio cationico, pertanto aumentano i loro tempi di ritenzione; laumento di pH della fase mobile produce leffetto contrario I tempi di ritenzione dei soluti sono inversamente proporzionali alla concentrazione della soluzione tampone perché se è vero che i soluti del tampone mantengono costante il pH della fase mobile, è anche vero che essi stessi sono degli ioni che entrano in competizione con i soluti nello scambio ionico. Nello scambio anionico è la concentrazione dellanione del tampone ad essere competitivo, nello scambio cationico è competitivo il catione del tampone. Giorgio Bonaga

26 Quando il pH della fase mobile è minore di 2 o maggiore di 8, la silice non è più utilizzabile e bisogna ricorrere a fasi stazionarie costituite da polimeri. Il pH della fase mobile incide anche sulla scelta delle catene ionogene: mentre i gruppi sulfonile (-SO 3 - ) possono dare scambio cationico anche a pH nettamente acido perché hanno scarsa attitudine a protonarsi, i gruppi carbossile (-COO - ) danno scambio cationico soltanto a pH neutro o basico, proprio per la loro facilità a protonarsi. Giorgio Bonaga TAMPONEpkapH fosfato pka (I) pka (II) pka (III) 2,1 7,2 12,3 1,1 – 3,1 6,2 – 8,2 11,3 – 13,3 citrato pka (I) pka (II) pka (III) 3,1 4,7 5,4 3,1 – 4,1 3,7 – 5,7 4,4 – 6,4 formiato3,82,8 – 4,8 acetato4,83,8 – 5,8 tris(idrossimetil)-amminometano8,37,3 – 9,3 borato9,28,2 – 10,2 dietilammina10,59,5 – 11,5

27 Giorgio Bonaga CLASSI SEPARABILI PER IEC CLASSEpka ammidi 0-1 pirroli 0,3 solfossidi alifatici1,5 tiazoli1-3 ammine aromatiche4-7 amminoacidi (-COOH)2-4 amminoacidi (-NH 2 )6-12 acidi carbossilici4-5 tioli aromatici6,5 tioli alchilici10,5 fenoli10-12 ammine alifatiche9-11 carbazoli12

28 Giorgio Bonaga pirroloammidetiazolosolfossido alifatico ammina aromaticaamminoacidoacido carbossilicotiolo aromatico tiolo alifaticofenoloammina alifatica carbazolo

29 b) EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE SALINA Per modificare i t R dei soluti, senza modificare il pH della fase mobile, si può aggiungere un sale (es.: NaNO 3 ). La concentrazione di questo sale, per effetto dellazione competitiva degli ioni di cui è formato sullo scambio ionico, è unaltra variabile che agisce sui t R dei soluti. laumento della concentrazione salina, a parità di pH, determina la diminuzione della capacità della fase stazionaria di trattenere i soluti, pertanto si ha una riduzione dei loro t R ; la diminuzione della concentrazione salina, a parità di pH, determina un aumento della capacità della fase stazionaria di trattenere i soluti, pertanto si ha una aumento dei loro t R. Giorgio Bonaga NaNO 3 (molarità) 0,10,51, Ritenzione relativa 0

30 a) EFFETTO DEI SOLVENTI ORGANICI NELLA FASE MOBILE Laggiunta di solventi organici alla fase mobile non ha alcun effetto sui t R di cationi metallici e anioni inorganici, ma modifica sensibilmente i t R di cationi e anioni organici perché influenza le interazioni tra i soluti e la fase stazionaria e tra i soluti e la fase mobile. Uno scambiatore a base di silice funzionalizzata con tetralchilammonio, ad esempio, può dare sia scambio anionico che adsorbimento di molecole o ioni organici contenenti gruppi alchilici, per interazione idrofobica tra le catene alchiliche. Aggiungendo alla fase mobile un solvente organico le interazioni idrofobiche che stanno alla base dellassorbimento vengono inibite. Giorgio Bonaga Si adsorbimentoscambio anionico Si R R N+N+ R

31 4. DETECTOR NELLA IEC a) RIVELATORI ELETTROCHIMICI Poiché lo scopo della cromatografia ionica è la separazione e la determinazione di specie ioniche, il rivelatore più idoneo è quello conduttometrico, che misura la conduttanza della soluzione effluente. Le più moderne celle conduttometriche, con acquisizione digitale, permettono un ampio intervallo operativo senza necessità di variare manualmente il range di lavoro, entro un intervallo dinamico di rivelazione conduttimetrica molto esteso (da 0,1 nanosecondi a 15 millisecondi). Il trattamento del segnale digitale, comandato da microprocessore, rileva automaticamente le concentrazioni alte e basse dei soluti nel corso dell'esecuzione della medesima serie. Un aspetto importante è l'accuratezza del controllo della temperatura, che si realizza con sistemi di controllo integrati della colonna e del rivelatore. La cella può essere riscaldata in modo indipendente dagli altri componenti del cromatografo tra 35° e 55°C, per assicurare la massima accuratezza nel controllo di temperatura, eliminando in questo modo qualunque deriva dovuta a variazioni ambientali di temperatura. In altri casi, per assicurare una temperatura omogenea durante l'intero corso dell'analisi, il rivelatore viene inserito nel vano portacolonna, termostatato da 30° a 60°C. Giorgio Bonaga

32 b) RIVELATORI SPETTROFOTOMETRICI In genere i cromatografi ionici possono essere configurati con un qualsiasi rivelatore ottico tra quelli messi a disposizione dal mercato. Ad esempio, uno spettrofotometro a diode array (DAD) a matrice di 1024 fotodiodi ad alta risoluzione, caratterizzato da basso rumore di fondo e bassa deriva oppure un rivelatore UV-VIS con lampade al deuterio e al tungsteno per operare nel range nm. L'uso di questi rivelatori è utile nella rivelazione di specie con cromoforo nell'UV, come ad esempio il nitrato, ma soprattutto trovano applicazioni in metodi, anche ufficiali, che prevedono la derivatizzazione post-colonna. c) RIVELATORI MS Lo spettrometro di massa con ionizzazione a pressione atmosferica ( Atmospheric Pressure Ionization = API) si è rivelato un insostituibile rivelatore per la cromatografia liquida in generale e per la cromatografia ionica in particolare, grazie alla capacità di risolvere problemi analitici non superabili con le tecniche di rivelazione elettrochimica o spettrofotometrica. Sono disponibili sul mercato sistemi dedicati IC-MS, gestiti con un unico software. L'uso della soppressione a membrana prima dell'interfaccia API permette di modificare il pH della soluzione da analizzare ottimizzando così la fase di ionizzazione per elettrospray. Giorgio Bonaga

33 La scelta dello spettrometro di massa come rivelatore per IC si basa sul principio di mettere a disposizione un rivelatore affidabile, robusto e di facile utilizzazione, anche per operatori non esperti. Per ottimizzare la sensibilità strumentale loperatore deve agire solo su due parametri: 1) la temperatura del probe dellelettrospray, in funzione del flusso e della composizione dell'eluente, ; 2) il potenziale della sorgente. Un aumento del potenziale della sorgente produce una maggiore frammentazione delle molecole per effetto di collisioni indotte, generando frammenti diagnostici che aumentano la specificità dell'analisi e possono dare informazioni strutturali aggiuntive per lidentificazione dei soluti. Dal punto di vista spettrometrico la caratteristica più importante è la possibilità di ottimizzare la risposta dell'analizzatore nell'intervallo di masse basse, tipiche degli ioni inorganici. Questa tecnica detta ELMO ( Enhanced Low Mass Option ) permette di estendere il mass range al di sotto di m/z 19, con un aumento della sensibilità di 350 volte per lo ione m/z 18 e con una limitata perdita di risposta alle masse più alte. Questa opzione si ottiene mediante una modifica dell'hardware, ovvero con l'introduzione di una lente RF esapolare da 5 mm e di due generatori di radiofrequenza separati. Giorgio Bonaga

34 IEC di un vino bianco (solfiti) Colonna analitica: 200 mm x 4 mm i.d., IonPac AS12A Precolonna: 50 mm x 4 mm i.d., IonPac AG12A Elettrolita di trasporto: NaOH 0,1 M Flusso: 1,0 ml/min Sample Loop: 20 l. Giorgio Bonaga SO ,0 9 6,0 9,0 12,0 min

35 IEC di un farmaco (analgesico, antinfiammatorio) Colonna analitica: scambiatore anionico Fase mobile: acquosa a pH 5,5 Rivelatore: UV a 254 nm Giorgio Bonaga 0 7 5,0 10 min caffeina fenacetina acetanilide

36 Giorgio Bonaga 2) CROMATOGRAFIA IONICA CON SOPPRESSIONE (Suppressed Ion Chromatography = SIC) 1. SOPPRESSIONE A COLONNA La colonna analitica viene collegata ad una seconda colonna ( colonna di soppressione ) che elimina il contributo alla conducibilità dovuto alla fase mobile (solventi, tampone, sali), così che la conducibilità sia soltanto quella dei soluti che sono stati separati, anche se presenti in piccole concentrazioni. a)SOPPRESSIONE DI ANIONI Se la fase mobile fosse costituita da NaOH (o NaHCO 3 ), la fase stazionaria da una resina a scambio anionico e il campione da separare contenesse NaF, NaCl e NaBr, quali sarebbero i passaggi logici nella colonna analitica ? 1. la colonna viene saturata con gli anioni – OH (o HCO3 - ) della fase mobile; 2. caricando il campione la resina scambia gli – OH con gli ioni F -, Cl - e Br - ; 3. al passaggio della fase mobile (eluizione) gli ioni F -, Cl - e Br - si scambiano nuovamente con gli ioni – OH della fase mobile ed eluiscono in questo ordine, nel rispetto della scala di selettività; 4. alluscita dalla colonna si ha la seguente composizione: fase mobile: NaOH (o NaHCO 3 ) soluti separati: NaF, NaCl, NaBr

37 Giorgio Bonaga La composizione delleluato richiede alcune considerazioni: la concentrazione e la conducibilità della fase mobile (NaOH o NaHCO 3 ) è molto elevata mentre le concentrazioni e le conducibilità dei soluti sono talmente basse che non produrrebbero variazioni significative dei segnali del detector, con enorme riduzione della sensibilità strumentale. Questo limite può essere superato collocando tra la colonna analitica e il detector una colonna a scambio cationico saturata di ioni H + (HCl). Gli ioni H + vengono scambiati con gli ioni Na + sia perché sono meno trattenuti dalla fase stazionaria (in accordo con la scala di selettività), sia perché reagiscono con gli ioni – OH (o HCO 3 - ) con formazione di H 2 O (o H 2 CO 3 = H 2 O+CO 2 ). Alluscita dalla colonna di soppressione si ha la seguente composizione: fase mobile: H 2 O (o H 2 O + CO 2 ) soluti separati: HF, HCl, HBr Il risultato netto è che le nuove specie della fase mobile hanno una conducibilità minima, mentre le nuove specie dei soluti sono acidi con valori di ka che producono una conducibilità elevata. Naturalmente la colonna di soppressione si esaurisce e va rigenerata con una soluzione di HCl prima di essere reimpiegata.

38 Giorgio Bonaga b) SOPPRESSIONE DI CATIONI Se la fase mobile fosse costituita da HCl (o H 2 SO 4 ), la fase stazionaria da una resina a scambio cationico e il campione da separare contenesse LiCl, NaCl e KCl, quali sarebbero i passaggi logici nella colonna analitica ? 1. la colonna viene saturata con gli anioni H + della fase mobile; 2. caricando il campione la resina scambia gli H + con gli ioni Li +, Na - +e K + ; 3. al passaggio della fase mobile (eluizione) gli ioni Li +, Na -+ e K + si scambiano nuovamente con gli ioni H + della fase mobile ed eluiscono in questo ordine, nel rispetto della scala di selettività; 4. alluscita dalla colonna si ha la seguente composizione: fase mobile: HCl (o H 2 SO 4 ) soluti separati: LiCl, NaCl, KCl La composizione delleluato richiede alcune considerazioni: la concentrazione e la conducibilità della fase mobile (HCl o H 2 SO 4 ) è molto elevata mentre le concentrazioni e le conducibilità dei soluti sono talmente basse che non produrrebbero variazioni significative dei segnali del detector, con enorme riduzione della sensibilità strumentale.

39 Giorgio Bonaga Questo limite può essere superato collocando tra la colonna analitica e il detector una colonna a scambio anionico saturata di ioni – OH (NaOH). Gli ioni - OH vengono scambiati con gli ioni Cl - perché sono meno trattenuti dalla fase stazionaria (in accordo con la scala di selettività), sia perché reagiscono con gli ioni H + con formazione di H 2 O. Alluscita dalla colonna di soppressione si ha la seguente composizione: fase mobile: H 2 O soluti separati: LiOH, NaOH, KOH Il risultato netto è che le nuove specie della fase mobile hanno una conducibilità minima, mentre le nuove specie dei soluti sono basi con valori di kb che producono una conducibilità elevata. Naturalmente la colonna di soppressione si esaurisce e va rigenerata con una soluzione di NaOH prima di essere reimpiegata. Nel caso della cromatografia ionica di metalli di transizione la soppressione produce degli idrossidi non dissociati o insolubili [Ni(OH) 2, Cu(OH) 2, ecc.] e pertanto anziché un detector conduttometrico si utilizza un rivelatore spettrofotometrico, previo trattamento della soluzione del campione - prima delleluizione in colonna analitica - con un indicatore metallocromico [ad es.: sale monosodico del 4-(2-piridilazo) resorcinolo o PAR] in grado di formare i cromofori necessari alla rivelazione UV-VIS. PAR

40 Giorgio Bonaga SOPPRESSORE A COLONNA colonna analitica colonna di soppressione pompa cella conducimetrica fase mobile campione

41 Giorgio Bonaga 2. SOPPRESSIONE A FIBRA CAVA Il limite della colonna di soppressione è che si esaurisce e la sua rigenerazione non consente un processo in continuo. Unalternativa è la soppressione a fibra cava, cioè una fibra cilindrica nel cui canale interno passa la soluzione eluente proveniente dalla colonna analitica e allesterno, in controcorrente, viene fatta fluire la soluzione che deve provvedere alla soppressione degli ioni della fase mobile. a) SOPPRESSIONE DI ANIONI La fibra è permeabile ai cationi Na + (in uscita) della fase mobile NaOH e H + (in entrata) della soluzione di soppressione di HCl. Il risultato netto è la conversione degli ioni – OH della fase mobile in H 2 O e dei soluti NaF, NaCl e NaBr nei corrispondenti acidi HF, HCl e HBr. b) SOPPRESSIONE DI CATIONI La fibra è permeabile agli anioni Cl - (in uscita) della fase mobile HCl e - OH (in entrata) della soluzione di soppressione di NaOH. Il risultato netto è la conversione degli ioni + H della fase mobile in H 2 O e dei soluti LiCl, NaCl e KCl nei corrispondenti idrossidi LiOH, NaOH e KOH. Il limite della fibra cava è la limitata superficie della fibra, dovuta al fatto che per evitare lallargamento dei picchi il diametro del canale interno devessere ridotto.

42 Giorgio Bonaga FIBRA CAVA eluente soluzione di soppressione scambio cationico o scambio anionico scambio cationico o scambio anionico fibra permeabile a cationi o anioni canale interno della fibra

43 HBr HCl H 2 O HF NaBr NaCl NaOH NaF H+H+ H+H+ H2OH2O H2OH2O H2OH2O H2OH2O Na + H+H+ H+H+ Cl – H+H+ H+H+ Cl - H + Cl - H + Cl - H + Cl - Na + Cl - Na + Cl - NaOH Na + - OH SOPPRESSORE A FIBRA - ANIONI - OH F - Cl - Br - Giorgio Bonaga

44 SOPPRESSORE A FIBRA - CATIONI KOH NaOH H 2 O LiOH KCl NaCl HCl LiCl - OH H2OH2O H2OH2O H2OH2O H2OH2O Cl - - OH Na + - OH Na + - OH Na + - OH Na + - OH Na + Cl - Na + Cl - HCl Cl - H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ - OH Li + Na + K + Giorgio Bonaga

45 c) SOPPRESSIONE A MEMBRANA È una soppressione che opera secondo gli stessi principi del soppressore a fibra cava, ma la permeabilità ai cationi o agli anioni è dovuta ad una membrana semipermeabile. Il soppressore a membrana è costituito da una camera laminare con tre schermi metallici scambiatori alternati con due membrane di scambio (struttura a sandwich). Il soppressore a membrana non soltanto consente di operare in continuo, ma la maggiore superficie di contatto tra la soluzione di soppressione e la soluzione eluente, consente una soppressione più completa. membrana di scambio ionico schermo scambiatore

46 soppressore HCl SOPPRESSORE A MEMBRANA COLONNA DETECTOR NaBr NaCl NaOH NaF HBr HCl H 2 O HF H+H+ H+H+ Na + Cl - Giorgio Bonaga Na + ELETTRODO Na + flusso eluente

47 SIC di acidi organici liberi Giorgio Bonaga SO min maleico malonico lattico formico acetico propionico

48 SIC di amminoacidi liberi di un mangime Giorgio Bonaga min Asp Thr Ser Glu Gly Ala Val Cys Met Phe Ile Leu Tyr His Lys Arg

49 Giorgio Bonaga 3) CROMATOGRAFIA DI COPPIA IONICA (Ion Pair Chromatography = IPC) È una tecnica cromatografica nella quale viene soppressa la ionizzazione di soluti ionizzabili e le specie che si ottengono, dotate di carattere lipofilo, vengono separate su fase inversa. 1. PREMESSA Se un soluto con proprietà ioniche (elettrolita debole) viene eluito con una opportuna fase mobile, produce un picco cromatografico caratteristico, in funzione del pH della fase mobile, come risultato del suo equilibrio di protonazione. La prima frazione del soluto che eluisce è quella ionizzata, dunque poco trattenuta dalla fase inversa (non polare), mentre la seconda frazione è quella indissociata, affine alla fase inversa. Nel caso di un acido carbossilico: R-COOH R-COO - + H + a pH basico: prevale R-COO - il picco ha un t R molto basso a pH acido (< pka): prevale R-COOH il picco ha un t R più alto pH basicopH acido

50 Giorgio Bonaga Il risultato netto è un picco molto allargato e non risolto. Per evitare la formazione di specie indesiderate nella separazione di elettroliti deboli si può utilizzare un tampone che stabilizza il pH di esercizio. Naturalmente nel caso di elettroliti forti non soltanto il tampone non funziona, ma non si può neppure abbassare o alzare il pH della fase mobile fuori dallintervallo di pH (2-8) entro il quale la silice funzionalizzata è stabile. 2. TECNICA IPC Il problema si può risolvere aggiungendo alla fase mobile un elettrolita costituito da uno ione ( accoppiatore ionico ) di dimensioni sufficientemente grandi e con carica opposta allo ione che si vuole sopprimere. Dal momento che il solvente organico della fase mobile produce un abbassamento della costante dielettrica, ci sono le condizioni affinché si formi una coppia ionica che, in un certo senso, si comporta come un soluto indissociato. tRtR R-COO - R-COOH

51 Giorgio Bonaga ACCOPPIATORI PER CATIONI CATIONI ACCOPPIATORI PER ANIONI ANIONI ione percloratotutti ione tetrabutilammonio (TBA)tutti dodecilsolfato di sodio (SDS) ammine protonate tetrafenilborato di sodio (STPB)tutti

52 Si - Giorgio Bonaga O R C O-O- N+N+ O R C O H Gli accoppiatori ionici del tipo SDS, che sono costituiti da una catena alchilica media, interagiscono con le catene alchiliche della silice funzionalizzata con C18 e la fase inversa diviene così uno scambiatore ionico per la presenza del gruppo –O-SO 3 -. Si

53 Giorgio Bonaga fase mobile fase stazionaria porosa D) CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE DIMENSIONALE (Size Exclusion Chromatography) D) CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE DIMENSIONALE (Size Exclusion Chromatography) Utilizzando colonne impaccate con fase stazionaria costituita da materiale poroso a dimensione controllata dei pori, i soluti si possono separare in base alla loro dimensioni molecolari.

54 1. TEORIA GENERALE DELLA ESCLUSIONE DIMENSIONALE Il volume interno di una colonna di esclusione si può così suddividere: Giorgio Bonaga 1. volume della fase mobile che non occupa i pori (V 0 ) 2. volume della fase stazionaria a) volume strutturale non disponibile per i soluti (V st ) b) volume totale dei pori occupati dalla fase mobile (V p ) V st VpVp mgmg m mpmp

55 Giorgio Bonaga Le 3 molecole: piccola dimensione (m p ), media dimensione (m m ) e grande dimensione (m g ) hanno destini diversi. La m p penetra completamente i pori, la m m li penetra parzialmente e la m g ne viene esclusa. La domanda è: qual è il volume a disposizione dei soluti che attraversano la colonna ? È intuitivo che il volume è diverso in funzione della dimensione della molecola: m p = V 0 + V p m m = V 0 + V p /x (V p /x = parte di Vp) m g = V 0 È possibile definire un coefficiente di distribuzione K che rappresenta la frazione di volume dei pori disponibile per le molecole di un determinato soluto A: K = (da cui V A = K. Vp) dove V A = volume dei pori accessibile alle molecole del soluto A Possiamo stabilire il valore di K in funzione della dimensione molecolare dei soluti: VAVA VpVp

56 Giorgio Bonaga m p K = 1 m g K = 0 m m 0 < K < 1 Il volume totale a disposizione delle molecole dei soluti, corrispondente al volume di ritenzione V R, sarà: V R = V 0 + V A ovvero : V R = V 0 + K. Vp per:K = 0V R = V 0 esclusione totale K = 1V R = V 0 + V p permeazione totale 0 > K > 1V 0 < V R < V 0 + V p permeazione parziale Si può anche affermare che lintervallo di volume necessario per eluire tutti i soluti è compreso tra V 0 e V 0 + V p (corrispondente allintervallo del coefficiente di distribuzione K compreso tra 0 e 1) ed è pertanto necessario che la colonna sia molto efficiente. In conclusione, maggiore è il valore di K maggiore è la penetrazione e la permanenza delle molecole di soluto nei pori e, dunque, più elevato è il suo t R.

57 Giorgio Bonaga Possiamo diagrammare i pesi molecolari dei soluti in funzione del volume di ritenzione V R, ovvero tracciare una curva di taratura (o di calibrazione): Riportando su un cromatogramma teorico una miscela di soluti con valori differenti di K si può concludere che il soluto con K = 1 è escluso, il soluto con K = 1 è permeato totalmente e il soluto con K = 0,5 è permeato al 50% V0V0 VpVp intervallo operativo di mol wt permeazione totale: K=1 esclusione totale: K=0 permeazione selettiva: 0

58 Giorgio Bonaga V0V0 VpVp intervallo operativo di mol wt permeazione totale: K=1 esclusione totale: K=0 permeazione selettiva: 0

59 Giorgio Bonaga I due asintoti della curva di taratura corrispondono a due limiti: quello della permeazione nulla (o esclusione totale) corrispondente a K = 0 e quello della permeazione totale (o esclusione nulla) corrispondente a K = 1. È ovvio che il tratto analiticamente utile della curva di taratura ( intervallo operativo dei pesi molecolari dei soluti ) è quello lineare, cioè quello compreso tra K = 0 e K = 1. I solventi utilizzati come fase mobile nella cromatografia di esclusione sono costituiti da molecole a basso peso molecolare, con K = 1, cioè con il più elevato t R. Essi, pertanto, eluiscono quando sono già eluiti tutti i soluti. Questa è la principale differenza tra la SEC e le altre tecniche di separazione cromatografica. Il compito del solvente è esclusivamente quello di essere un buon solvente dei soluti che devono essere separati, oltre ad essere inerte verso la fase stazionaria. Lefficienza di una colonna per cromatografia di esclusione dimensionale dipende da: a) Lunghezza della colonna È evidente che lallungamento della colonna produce un aumento della sua efficienza, ma nel caso della SEC è più efficace connettere 2 colonne differenti ( cromatografia bimodale ) piuttosto che 1 colonna più lunga.

60 Giorgio Bonaga b) Struttura della fase stazionaria Se la fase stazionaria è costituita da materiale con diametro piccolo dei pori il tratto lineare della curva di taratura si sposta verso il basso e interesserà soluti di piccole dimensioni. Se la fase stazionaria è costituita da materiale con diametro grande dei pori il tratto lineare si sposta verso lalto e interesserà i soluti di grandi dimensioni A A: pori più grandi (intervallo operativo per mol wt elevati) B: pori più piccoli (intervallo operativo per mol wt meno elevati) mol wt B V R (ml)

61 Giorgio Bonaga Alla maggiore o minore omogeneità della dimensione dei pori, invece, è correlata la pendenza della curva di taratura: langolo del tratto lineare è proporzionale alla disomogeneità dei pori. È ovvio che minore è la pendenza del tratto lineare e maggiore è lefficienza e la selettività della colonna, naturalmente se i soluti hanno dimensioni comprese nel tratto lineare A A: pori omogenei (alta selettività) B: pori disomogenei (bassa selettività) mol wt B V R (ml)

62 Giorgio Bonaga Se prendiamo in considerazione le curve di taratura di fasi stazionarie diverse si può notare che, seppure con andamenti diversi, lincremento della dimensione dei pori sposta il tratto lineare delle curve di taratura verso lalto (cioè verso pesi molecolari maggiori), sia con materiale polimerico sia con gel si silice Å 500 Å 400 Å 300 Å 200 Å 100 Å V R (ml) CURVE DI TARATURA DI POLIMERI 600 Å

63 Giorgio Bonaga ,6 2,0 2,4 2,8 3,2 CURVE DI TARATURA DI GEL DI SILICE 125 Å 300 Å 500 Å 1000 Å V R (ml) Un problema concreto è quello della scelta della porosità più idonea alla separazione di due soluti di peso molecolare diverso. Tracciamo le curve di taratura di tre impaccamenti A, B e C di porosità diversa e individuiamo qual è quello più idoneo a separare il soluto 1 (~ 10 4 ) e il soluto 2 (~ 10 3 ).

64 Giorgio Bonaga V0V0 VpVp A mol wt VRVR B C V A V B V C Mentre con gli impaccamenti A e C i pesi molecolari sono fuori dal tatto lineare della curva, con limpaccamento B sono compresi. Inoltre, la differenza dei volumi di ritenzione dellimpaccamento B ( V B ) è maggiore di quella A ( V A ) e di quella C ( V C ) e pertanto la separazione sarà migliore. soluto 1 soluto 2

65 Giorgio Bonaga Dal punto di vista pratico conviene fare una cromatografia di screening con una colonna che ha una curva di taratura a pendenza elevata, cioè una curva il cui tratto lineare comprende un intervallo ampio di pesi molecolari. Individuato lintervallo reale in cui rientrano i pesi molecolari dei soluti da nalizzare si potrà procedere utilizzando una colonna più selettiva, cioè con una curva di taratura a bassa pendenza del tratto lineare.

66 Giorgio Bonaga 2. CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE BIMODALE Collegando due colonne impaccate con materiale a differente dimensione dei pori si amplia lintervallo di pesi molecolari che rientrano nel tratto lineare della curva di taratura. 2. CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE BIMODALE Collegando due colonne impaccate con materiale a differente dimensione dei pori si amplia lintervallo di pesi molecolari che rientrano nel tratto lineare della curva di taratura. colonna 1 pori grandi colonna 2 pori piccoli

67 Giorgio Bonaga Ognuna delle due colonne esercita la sua funzione in un proprio intervallo di pesi molecolari e lattraversamento dei soluti in una colonna non ha alcuna influenza sullaltra, perché i diversi soluti subiranno esclusione totale o permeazione totale. Normalmente la prima colonna è quella meno selettiva, cioè impaccata con materiale a dimensione dei pori maggiore. È evidente che se ogni singola colonna consente la separazione di 2 ordini di grandezza di pesi molecolari, laccoppiamento di due colonne consentirà la separazione di 4 ordini di grandezza di pesi molecolari. Ognuna delle due colonne esercita la sua funzione in un proprio intervallo di pesi molecolari e lattraversamento dei soluti in una colonna non ha alcuna influenza sullaltra, perché i diversi soluti subiranno esclusione totale o permeazione totale. Normalmente la prima colonna è quella meno selettiva, cioè impaccata con materiale a dimensione dei pori maggiore. È evidente che se ogni singola colonna consente la separazione di 2 ordini di grandezza di pesi molecolari, laccoppiamento di due colonne consentirà la separazione di 4 ordini di grandezza di pesi molecolari mol wt A B A B V R (ml)

68 Giorgio Bonaga 0 10 min min CROMATOGRAFIA CON 1 COLONNA CON DIAMETRO DEI PORI = 60 Å CROMATOGRAFIA CON 2 COLONNE CON DIAMETRO DEI PORI = 60 Å = polistirene = polistirene = diottilftalato = dibutilftalato = dietilftalato = dimetilftalato = benzene (solvente) 78

69 3. FASE STAZIONARIA Le fasi stazionarie nella cromatografia di esclusione dimensionale possono essere costituite da: Materiali rigidi, materiali semirigidi, materiali soft MATERIALI RIGIDI Viene utilizzata gel di silice o silice vetrosa in granuli, con diametro compreso tra m e diametro dei pori compreso tra Å. La silice ha le seguenti proprietà: sopporta alte pressioni senza variare di volume; è compatibile con fasi mobili acquose e organiche; è compatibile con una temperatura di esercizio di 60-80°C; è idonea alla separazione di soluti polari; è instabile a pH > 8 perché si scioglie nella fase mobile; può dare interazioni (adsorbimento e scambio ionico) con i soluti. Per eliminare i fenomeni di adsorbimento si può funzionalizzare la silice con TMCS (trimeticlorosilano), ovvero si convertono i gruppi silanolici nei loro trimetilsiliderivati. Per eliminare lo scambio ionico dovuto allacidità dei gruppi silanolici (pH 9) si può aggiungere alla fase mobile una sale donatore di anioni e cationi ai siti attivi della silice (ad es. una soluzione 0,1-0,01 M di tetrabutilammoniodiidrogenofosfato ). 3. FASE STAZIONARIA Le fasi stazionarie nella cromatografia di esclusione dimensionale possono essere costituite da: Materiali rigidi, materiali semirigidi, materiali soft MATERIALI RIGIDI Viene utilizzata gel di silice o silice vetrosa in granuli, con diametro compreso tra m e diametro dei pori compreso tra Å. La silice ha le seguenti proprietà: sopporta alte pressioni senza variare di volume; è compatibile con fasi mobili acquose e organiche; è compatibile con una temperatura di esercizio di 60-80°C; è idonea alla separazione di soluti polari; è instabile a pH > 8 perché si scioglie nella fase mobile; può dare interazioni (adsorbimento e scambio ionico) con i soluti. Per eliminare i fenomeni di adsorbimento si può funzionalizzare la silice con TMCS (trimeticlorosilano), ovvero si convertono i gruppi silanolici nei loro trimetilsiliderivati. Per eliminare lo scambio ionico dovuto allacidità dei gruppi silanolici (pH 9) si può aggiungere alla fase mobile una sale donatore di anioni e cationi ai siti attivi della silice (ad es. una soluzione 0,1-0,01 M di tetrabutilammoniodiidrogenofosfato ).

70 3.2. MATERIALI SEMIRIGIDI Vengono utilizzati copolimeri stirene/divinilbenzene (PS-DVB), ma questi materiali variano il loro volume in funzione della pressione a cui sono sottoposti. La loro porosità può essere modulata variando lentità della reticolazione, che è direttamente proporzionale alla percentuale di divinilbenzene (dal 2 al 12%, comunemente 8%). Non essendo bagnabile il copolimero non può consentire la Gel Permeation Chromatography, la tecnica che utilizza una fase mobile acquosa. I solventi più utilizzati in associazione con questi materiali sono: THF, toluene, cloroformio e decaidronaftalene MATERIALI SOFT Vengono utilizzati polisaccaridi (amido, poliagarosio, ecc.) che però hanno linconveniente di subire una notevole riduzione di volume a pressioni elevate. Il loro utilizzo comporta una pressione di esercizio non superiore a 10 atmosfere, ottenuta con pompe peristaltiche MATERIALI SEMIRIGIDI Vengono utilizzati copolimeri stirene/divinilbenzene (PS-DVB), ma questi materiali variano il loro volume in funzione della pressione a cui sono sottoposti. La loro porosità può essere modulata variando lentità della reticolazione, che è direttamente proporzionale alla percentuale di divinilbenzene (dal 2 al 12%, comunemente 8%). Non essendo bagnabile il copolimero non può consentire la Gel Permeation Chromatography, la tecnica che utilizza una fase mobile acquosa. I solventi più utilizzati in associazione con questi materiali sono: THF, toluene, cloroformio e decaidronaftalene MATERIALI SOFT Vengono utilizzati polisaccaridi (amido, poliagarosio, ecc.) che però hanno linconveniente di subire una notevole riduzione di volume a pressioni elevate. Il loro utilizzo comporta una pressione di esercizio non superiore a 10 atmosfere, ottenuta con pompe peristaltiche.

71 4. FASE MOBILE La fase mobile deve possedere alcuni requisiti: buon solvente dei soluti da nalizzare; compatibilità con la fase stazionaria ( bagnabilità ) inerzia verso la fase stazionaria I buoni solventi di una fase mobile impiegata nella SEC devono solvatare fortemente i soluti, in modo da ridurre al massimo il V R. In base al tipo di fase stazionaria e di fase mobile la SEC può essere così classificata: 4. FASE MOBILE La fase mobile deve possedere alcuni requisiti: buon solvente dei soluti da nalizzare; compatibilità con la fase stazionaria ( bagnabilità ) inerzia verso la fase stazionaria I buoni solventi di una fase mobile impiegata nella SEC devono solvatare fortemente i soluti, in modo da ridurre al massimo il V R. In base al tipo di fase stazionaria e di fase mobile la SEC può essere così classificata: TIPO DI SECFASE STAZIONARIAFASE MOBILE Gel Permeation Chromatography (GPC) silice copolimeri organica Gel Filtration Chromatography (GFC) silice acquosa

72 5. TEMPERATURA La separazione dei soluti ad alto peso molecolare, cioè ad elevata viscosità, richiede un incremento di temperatura proprio per ridurre leccessiva viscosità della miscela da analizzare. Nella SEC si opera alla temperatura di 60-80°C, compatibilmente con il solvente utilizzato come fase mobile, perché comunque bisogna operare ad una temperatura inferiore di 30-40°C a quella di ebollizione del solvente. Il materiale di riempimento più idoneo è la silice, anche perché laumento della sua solubilità nella fase mobile allaumentare della temperatura può essere ovviato predisponendo una precolonna di silice mantenuta alla stessa temperatura desercizio. In questo modo la fase mobile si satura di silice nella precolonna, garantendo linalterabilità della silice della colonna analitica. 5. TEMPERATURA La separazione dei soluti ad alto peso molecolare, cioè ad elevata viscosità, richiede un incremento di temperatura proprio per ridurre leccessiva viscosità della miscela da analizzare. Nella SEC si opera alla temperatura di 60-80°C, compatibilmente con il solvente utilizzato come fase mobile, perché comunque bisogna operare ad una temperatura inferiore di 30-40°C a quella di ebollizione del solvente. Il materiale di riempimento più idoneo è la silice, anche perché laumento della sua solubilità nella fase mobile allaumentare della temperatura può essere ovviato predisponendo una precolonna di silice mantenuta alla stessa temperatura desercizio. In questo modo la fase mobile si satura di silice nella precolonna, garantendo linalterabilità della silice della colonna analitica. precolonna silice, 60-80°C colonna silice, 60-80°C

73 Giorgio Bonaga composti organici additivi per polimeri plasticizzanti resine epossidiche 6. IMPIEGHI DELLA SEC Le sostanze che possono essere separate con la SEC e i relativi intervalli di peso molecolare sono indicati nello schema. 6. IMPIEGHI DELLA SEC Le sostanze che possono essere separate con la SEC e i relativi intervalli di peso molecolare sono indicati nello schema. mol wt resine epossidiche resine fenoliche peptidi proteine globulari enzimi

74 Giorgio Bonaga 1.fibrinogeno immunoglobulina albunina fibrinogeno immunoglobulina albunina ESEMPIO Separazione di proteine del plasma umano. ESEMPIO Separazione di proteine del plasma umano

75 Giorgio Bonaga Colonna: copolimero S/DVB, pori 60 Å Fase mobile: THF Flusso: 1 ml/min Colonna: copolimero S/DVB, pori 60 Å Fase mobile: THF Flusso: 1 ml/min 1.n -dodecilbenzene218 2.n -ottilbenzene190 3.n -esilbenzene162 4.n -butilbenzene134 5.n -propilbenezene120 6.etilbenzene106 7.toluene 92 8.benzene (solvente) 78 1.n -dodecilbenzene218 2.n -ottilbenzene190 3.n -esilbenzene162 4.n -butilbenzene134 5.n -propilbenezene120 6.etilbenzene106 7.toluene 92 8.benzene (solvente) min ESEMPIO Separazione di alchilbenzeni. ESEMPIO Separazione di alchilbenzeni.

76 ALTRE COMATOGRAFIE E) CROMATOGRAFIA DI AFFINITA ( Affinity Chromatography = AC ) È utilizzata per isolare composti biologicamente e/o chimicamente nobili, di costo elevato, il cui recupero è economicamente vantaggioso. È una tecnica cromatografica molto utilizzata nella separazione degli enzimi, perché sfrutta la specificità delle interazioni enzima/substrato. La colonna viene preparata con materiale fisicamente e chimicamente inerte ( matrix ), attivato con degli spaziatori flessibili ( spacer arm ), sui quali vengono immobilizzati dei ligandi ( ligand ), cioè dei siti attivi verso un enzima. Gli spaziatori hanno la funzione di evitare limpedimento sterico tra i siti attivi e le molecole di enzima. Giorgio Bonaga matrix (agarosio) ligand spacer arm (Br-CN)

77 A+B C Giorgio Bonaga AFFINITA A B C Facendo eluire una miscela di enzimi, soltanto quello in grado di interagire (affinità) con i ligandi viene trattenuto, mentre gli altri eluiscono molto rapidamente. In un secondo tempo si fa fluire una fase mobile in grado di dissociare il complesso enzima/substrato, in genere variando il pH o la forza ionica della fase mobile.

78 F) CROMATOGRAFIA LIQUIDA CHIRALE ( Chiral Liquid Chromatography = CLC ) Ha lo scopo di separare le miscele di enantiomeri (R e S), cioè isomeri che hanno le stesse proprietà chimiche e fisiche, ma diversa attività ottica (antipodi ottici). La cromatografia liquida chirale si può realizzare in due modi: 1. FASE STAZIONARIA CHIRALE La fase stazionaria di silice viene funzionalizzata con gruppi contenenti centri chirali che determinano una enantioselettività dovuta alla formazione di addotti diasteroisomerici non permanenti. Lenantoseparazione avviene se i due enantiomeri differiscono nel numero di punti di attacco al centro chirale. Le interazioni temporanee sono: 1. legami a idrogeno; 2. interazioni dipolo-dipolo; 3. interazioni di orbitali (p-p o d-metalli). Giorgio Bonaga

79 Le tre interazioni che governano la stereoselettività sono note come regola dei tre punti di Dalgliesh. Si ottiene la separazione se uno dei due enantiomeri è ritenuto dalle tre interazioni e laltro soltanto da due. ESEMPIO Per ottenere la separazione di una miscela di enantiomeri R e S di alcuni amminoacidi (valina, alanina, treonina) si funzionalizza una fase stazionaria di silice con: Giorgio Bonaga (S)-N-(1-feniletil)-urea

80 Gli enantiomeri R eluiscono prima perché formano soltanto 2 interazioni temporanee con i centri chirali S, mentre gli enantiomeri S ne realizzano 3. Giorgio Bonaga R R R S S S treonina alanina valina min

81 2. FASE MOBILE CHIRALE Alla fase mobile viene aggiunto un componente chirale, in grado di interagire (per complessazione, addizione, condensazione ) in modo diverso con i due enantiomeri. In questo caso lenantiomero affine al componente chirale della fase mobile eluisce per primo. Questo secondo tipo di cromatografia liquida chirale è poco diffuso. Giorgio Bonaga

82 G) CROMATOGRAFIA CON SCAMBIO DI LEGANTE ( Ligand Exchange Chromatography = LEC ) È una cromatografia di scambio cationico che utilizza un copolimero (comunemente stirene/divinilbenzene) funzionalizzato con gruppi –SO 3 -, ma in più la fase stazionaria viene caricata con un controione metallico (ad es. Fe +++ ) capace di formare complessi con le sostanze da separare. Lo ione metallico non deve saturare tutti i siti attivi del copolimero, ma maggiore è il numero dei siti caricati con il controione maggiore è la capacità della colonna. È anche opportuno che la concentrazione dei soluti da separare non sia tanto elevata da determinare la rimozione del controione dal silicone. Il soluto è trattenuto tanto più a lungo dalla fase stazionaria quanto maggiore è la stabilità del complesso ione/soluto (con un conseguente aumento del suo t R ), secondo lequilibrio: Copolimero-SO 3 - Fe HO-R Copolimero-SO 3 - Fe O-R + H + Dopo la formazione dei complessi Fe +++ /soluti, si impiega con una soluzione tampone a pH decrescente per avere leluizione selettiva dei soluti, secondo un ordine che dipende dalla stabilità del complesso ione /soluto e dalla basicità del soluto. Giorgio Bonaga

83 a) A PARITA DI STABILITA DEI COMPLESSI IONE/SOLUTO: viene eluito prima il soluto più basico; b) A PARITA DI BASICITA DEI SOLUTI: viene eluito prima il soluto che forma il complesso ione/soluto meno stabile. ESEMPIO Separazione di fenoli monosostituiti. Giorgio Bonaga volume fase mobile pH fase mobile

84 H) CROMATOGRAFIA A FLUIDO SUPERCRITICO ( Supercritical Fluid Chromatography = SFC ) Rispetto le altre LC, la cromatografia a fluido supercritico è più versatile, economicamente più vantaggiosa, di facile esecuzione, con una risoluzione migliore, non impiega solventi organici, comporta tempi di analisi più rapidi. 1. TEORIA GENERALE DELLA SFC Un fluido supercritico può essere definito dal diagramma di fase di una sostanza pura, in cui sono indicate le regioni corrispondenti allo stato solido, liquido e gassoso. Giorgio Bonaga regione del fluido supercritico SOLIDO LIQUIDO VAPORE temperatura critica pressione critica punto triplo.

85 Una sostanza può esistere in fase solida, liquida e gassosa in diverse combinazioni di temperatura e pressione. Per ogni sostanza, però, cè una temperatura ( temperatura critica ) al di sopra della quale essa non può esistere allo stato liquido, indipendentemente dalla pressione a cui è sottoposta e cè una pressione ( pressione critica ) al di sopra della quale essa non può esistere allo stato gassoso, indipendentemente dalla temperatura a cui è sottoposta. A questo punto il liquido e il vapore hanno la stessa densità e il fluido non può essere liquefatto per incremento della pressione. Sopra questo punto non avviene più nessun cambiamento di fase e la sostanza è un fluido supercritico. Giorgio Bonaga FLUIDO temperatura critica (°C) pressione critica (bar) anidride carbonica ,8 etilene 9,2 50,4 propilene91,8 46,0 triclorometano198,0 44,1 ammoniaca132,3113,5 acqua374,1221,2 cicloesano280,3 40,7 toluene318,6 41,0

86 Giorgio Bonaga PROPRIETAgas fluido supercritico liquido densità (g/cm)0,6-2,0 x ,2-0,50,6-2,0 coefficiente di diffusione (cm/s)1,0-4,0 x ,2-2,0 x viscosità (g/cm. s)1,0-4,0 x ,6-2,0 x ,2-3,0 x La SFC è una tecnica cromatografica intermedia tra la GC e la LC nella quale la fase mobile è un fluido ottenuto per riscaldamento al di sopra della sua temperatura critica e compresso al di sopra della sua pressione critica. Cè una transizione continua da liquido a fluido supercritico per incremento della temperatura a pressione costante o da gas a fluido supercritico per incremento della pressione a temperatura costante. I fluidi supercritici hanno proprietà, intermedie tra quelle dello stato gassoso e dello stato liquido, proprietà che sono particolarmente utili nella cromatografica. Per la loro densità elevata sono in grado di dissolvere molecole ad alto peso molecolare, non volatili, termolabili, ma hanno anche un grande potere solvatante. Per il loro coefficiente di diffusione elevato consentono di usare colonne lunghe e di ridurre i tempi di analisi. Per la loro viscosità bassa riducono i fenomeni di caduta di pressione in colonna.

87 2. FASE MOBILE Nonostante siano disponibili numerosi fluidi, la SFC utilizza comunemente lanidride carbonica e, a volte, lacqua. a) CO 2 Non è infiammabile, non è tossica, è ecocompatibile, ha una temperatura critica bassa e una pressione critica modesta, è miscibile con molti solventi organici e facilmente recuperabile alla fine del processo. Le molecole di CO 2, piccole e lineari, diffondono velocemente. b) H 2 O Ha temperatura critica e pressione critica elevate a causa della sua notevole polarità. In condizioni supercritiche lacqua cambia, da solvente di sole specie ioniche a solvente di paraffine, sostanze aromatiche, sali. 3. PRESSIONE Il potere solvatante di un fluido supercritico è proporzionale alla sua densità e la densità aumenta allaumentare della pressione. La programmazione della pressione nella SFC corrisponde alla programmazione della temperatura nella GC e alla eluizione a gradiente nella HPLC. Giorgio Bonaga

88 4. STRUMENTAZIONE SFC È molto simile a quella HPLC, perché le temperature e le pressioni richieste per produrre il fluido supercritico si ottengono anche con uno strumento HPLC. Ci sono due differenze sostanziali: 1) forno termostatato 2) restrittore a) POMPE colonne impaccate : pompe reciprocanti colonne capillari : pompe a siringa b) INIETTORI colonne impaccate : tradizionali valvole di iniezione HPLC per grandi volumi colonne capillari : valvole pneumatiche per piccoli volumi c) FORNO È necessario un forno termostatato con controllo accurato delle temperature, molto simile a quello della GC. d) COLONNE Nella SFC il notevole potere solvatante della fase mobile rende importante e delicata la scelta della fase stazionaria. colonne impaccate : acciaio inox (3-25 cm) di allumina, silice, polistirene e altre fasi insolubili nel fluido supercritico (diametro: 3-10 m), anche legate (silice-C18, ecc.) colonne capillari : silice fusa (1-35 m), tipo WCOT (f.t.: 0,1-3,0 m) Giorgio Bonaga

89 e) RESTRITTORE ( back-pressure device ) È un dispositivo, collocato tra lestremità finale della colonna e il detector, che serve a mantenere la pressione desiderata nella colonna, mediante un diagramma di pressione variabile. f) DETECTOR La SFC è compatibile sia con i detector della HPLC e della GC (RI, PD, UV-VIS, LSD, FID, MS). La scelta del detector dipende da: composizione della fase mobile, velocità di flusso della fase mobile, tipo di colonna, abilità del detector di garantire le alte pressioni necessarie nella SFC. g) FLUIDI MODIFICATORI La CO 2 non è un ottimo solvente per soluti ad alto peso molecolare, polari o ionici. Questo limite può essere superato per aggiunta di piccole quantità di un secondo fluido, completamente miscibile con la CO 2 (alcol, eteri ciclici, acetonitrile, acqua, ecc), detto fluido modificatore. La sua funzione è di innalzare il potere solvatante della CO 2, ma anche di incrementare la selettività ( ) e la efficienza (HETP) della separazione attraverso la neutralizzazione di parte dei siti attivi della fase stazionaria. Giorgio Bonaga

90 80 temperatura (°C) 250 Giorgio Bonaga min min GC SFC 0,225 densità (g/ml) 0,70

91 ULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (UPLC) È basata su una nuova fase stazionaria, con particelle di diametro inferiore a 2 m, che garantisce efficienza, risoluzione e sensibilità analitica oltre ad una riduzione dei tempi di analisi di quasi un fattore 10. La fase stazionaria è costituita da particelle, a fase inversa da 1,7 m di tetraetossisilossano (TEOS) successivamente polimerizzato e derivatizzato con C18 (ottadecilsilil-), resistenti alle elevate pressioni di esercizio (15000 psi, pari a oltre 1000 atm). Le caratteristiche di questa fase consentono un ottimale interfacciamento della UPLC con la MS. Giorgio Bonaga

92 HPLC TRADIZIONALE, FAST HPLC, UPLC v (mm/sec) HETP ( m) m (1970) 5 m (1980) 3 m (2000) 1,7 m (2004) UPLC FAST HPLC HPLC Giorgio Bonaga

93 EFFETTI DELLHETP SULLEFFICIENZA E SUL TEMPO rrr rrr HPLC UPLC mV t (min) 1,8 minuti 18 minuti flusso: 1,0 ml/min colonna: 4,6 mm I.D. x 150 mm fase stazionaria: C18 (5,0 m) fase mobile: H 2 O/CH 3 CN (50/50) lunghezza donda: 254 nm campione (20 l): 1. uracile 2. alcol benzilico 3. benzene 4. toluene 5. alcol etilico flusso: 0,6 ml/min colonna: 2,1 mm I.D. x 50 mm fase stazionaria: C18 (1,8 m) fase mobile: H 2 O/CH 3 CN (50/50) lunghezza donda: 254 nm campione (1 l): 1. uracile 2. alcol benzilico 3. benzene 4. toluene 5. alcol etilico Giorgio Bonaga

94 4 + tetraetossisilano (TEOS) bis (trietossisililetano) (BTEE) polietossisilano (BPEOS) Si C O H Giorgio Bonaga

95 particelle capello umano particelle da 5 m 60 m da 1,7 m Giorgio Bonaga

96 STRATEGIA HPLC CAMPIONAMENTO SCELTA DEL METODO CROMATOGRAFICO SCELTA DELLA COLONNA 1. LSC 2. LLC 3. IEC 4. SEC RFC NPC IEC SIC GFC GPC 1.lunghezza colonna 2.tipo di fase stazionaria 3.dimensione delle particelle 4.diametro dei pori 1.pressione 2.temperatura 3.eluizione isocratica o a gradiente 4.column switching N k SCELTA DELLA FASE MOBILE 1.composizione fase mobile 2.forza delleluente 3.indice di polarità eluente 4.viscosità fase mobile SCELTA DELLE CONDIZIONI

97 Giorgio Bonaga COLUMN SWITCHING È un sistema costituito da due colonne di lunghezza diversa, ma riempite con lo stesso materiale dimpaccamento, collegate tra loro con una valvola a 3 vie. Agendo sulla valvola si può fare in modo che una parte della miscela eluisca in entrambe le colonne (la parte i cui soluti hanno t R non elevati) e una parte eluisca soltanto nella prima colonna (quella i cui soluti hanno t R molto elevati) perché deviata dalla valvola direttamente sul detector. detector colonna cortacolonna lunga valvola a 3 vie

98 Giorgio Bonaga detector colonna a bassa capacità colonna ad elevata capacità valvola a 3 vie Unalternativa è limpiego di due colonne di lunghezza uguale, ma a diverso grado di funzionalizzazione della silice con catene C18 (RPC). La colonna meno funzionalizzata trattiene meno i soluti a t R elevati, che verranno deviati dalla valvola prima di entrare nella seconda colonna direttamente sul detector.

99 Giorgio Bonaga colonna 1: 5,0 cm colonna 2: 15,0 cm colonna 1 + colonna 2 column switching min

100 DERIVATIZZAZIONI IN LC Il limite di rilevabilità di alcuni soluti può essere abbassato con reazioni di derivatizzazione che vanno scelte in relazione alla natura dei soluti e al tipo di rivelatore che è più opportuno utilizzare. Le reazioni possono essere fatte in due momenti diversi del processo cromatografico: a) POST-COLUMN Tra la colonna e il detector si inserisce un tubo immerso in un bagno termostatico ed una pompa peristaltica che miscela i soluti già separati dalla colonna analitica con i reagenti necessari alla derivatizzazione. VANTAGGI il campione non richiede preparazione e manipolazioni; la reazione può essere automatizzata a vantaggio della riproducibilità; non si formano artefatti perché i reagenti non attraversano la colonna analitica. SVANTAGGI è richiesta una apparecchiatura supplementare (bagno termostatico, pompa, ecc.); è compatibile soltanto con reazioni molto veloci (circa 30-40) perché tempi maggiori produrrebbero un allargamento dei picchi; il solvente di reazione deve essere compatibile con la fase mobile; un eccesso di derivatizzazione produrre un background che disturba la misura dei segnali dei soluti. Giorgio Bonaga

101 b) PRE-COLUMN Prima delliniezione nella colonna analitica la miscela da separare viene sottoposta alla reazione di derivatizzazione. VANTAGGI non ci sono incompatibilità tra solvente di reazione e fase mobile; la velocità di reazione non è un fattore limitante; è richiesto il clean up (filtrazione, estrazione, precipitazione) del campione per evitare la formazione di artefatti, pertanto la separazione viene fatta su un campione obbligatoriamente pulito; non è richiesta una apparecchiatura supplementare, dal momento che è sufficiente una provetta con tappo a tenuta in un termostato; SVANTAGGI il campione reale che viene iniettato nella colonna analitica può essere complesso per la presenza di solventi di reazione (ad esempio lacetone, che assorbe nellUV), catalizzatori, tamponi, ecc.; è necessario luso di uno standard interno quando la reazione di derivatizzazione non è quantitativa; la resa della reazione di derivatizzazione è spesso variabile, a spese della riproducibilità; molte volte i composti prodotti dalla derivatizzazione sono più difficili da separare dei loro precursori, per effetto di una riduzione delle differenze dei valori dei k di derivati che hanno nella molecola lo stesso gruppo funzionale introdotto. Giorgio Bonaga

102 In generale nella LC si usa prevalentemente la derivatizzazione pre-column, più raramente quella post-comumn ( come nel caso dellindicatore metallocromico nella IEC), abitualmente per rendere i soluti da separare capaci di assorbire nellUV-VIS o di emettere radiazioni di fluorescenza. Le principali reazioni di derivatizzazione riguardano: 1. ACIDI 2. AMMINE 3. COMPOSTI CARBONILICI 4. ZUCCHERI

103 Giorgio Bonaga 1. DERIVATIZZAZIONE DI ACIDI DERIVATIZZANTESISTEMA DI REAZIONEDETECTOR 1. bromuro di fenacile acetone, KHCO 3, 18-crown-6 UV (254 nm) 2. bromometil-metossicumarina acetone bollente FD (ecc.: 330 nm, emis.: 380 nm) 3. metil-metossicumarina acetone bollente FD (ecc.: 330 nm, emis.: 380 nm) crown-6 K+K+

104 Giorgio Bonaga Cromatogramma di acidi carbossilici di un vino Dolcetto derivatizzati con bromuro di fenacile min acido gliossilico acetone acido succinico acido lattico acido acetico bromuro di fenacile acido tartarico acido malico acido citrico

105 Giorgio Bonaga 2. DERIVATIZZAZIONE DI AMMINE DERIVATIZZANTEAMMINEDETECTOR 1. cloruro di 2,4-dinitrobenzoileRNH 2, R 2 NHUV (254 nm) 2. cloruro di dansileRNH 2, R 2 NHFD (ecc.: 330 nm, emis.: 540 nm) 3. o -ftalaldeide RNH 2 FD (ecc.: 390 nm, emis.: 450 nm) 4. fluram RNH 2 FD (ecc.: 390 nm, emis.: 450 nm) 5. cloruro di nitrobenzoossadiazoloRNH 2, R 2 NHFD (ecc.: 480 nm, emis.: 650 nm)

106 Giorgio Bonaga Cromatogramma di dansil-derivati di ammine alifatiche FASE STAZIONARIA: silice-C18 (porosa) 10 m FASE MOBILE: H 2 O/CH 3 CN con eluizione a gradiente da 40% a 75% min CH 3 CN (75%) CH 3 CN (40%)

107 Giorgio Bonaga 3. DERVATIZZAZIONE DI COMPOSTI CARBONILICI E ZUCCHERI DERIVATIZZANTEAMMINEDETECTOR 1. 2,4- dinitrofenilidrazinaaldeidi, chetoniVISIBILE 2. dansil-idrazina aldeidi zuccheri FD (ecc.: 350 nm, emis.: 500 nm) RID Negli zuccheri la danisil-idrazina produce un aumento della sensibilità del RID di un fattore 10 2, inoltre la minor polarità dei dansil-derivati consente la cromatografia a fase inversa.

108 Giorgio Bonaga min Cromatogramma di dansil-idrazoni di steroidi eccitazione emissione Spettri di eccitazione e di emissione di fluorescenza dei dansil-derivati


Scaricare ppt "L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo."

Presentazioni simili


Annunci Google