SVILUPPO DEL PRIMO MODELLO CELLULARE IN VITRO DI CELLULE STAMINALI TUMORALI DI OSTEOSARCOMA A PICCOLE CELLULE Dr.ssa Gaia Palmini (Sez. Malattie del Metabolismo Minerale e Osseo, Dipartimento di Chirurgia e Medicina Traslazionale, Università degli Studi di Firenze) XI° Congresso OrtoMed, Firenze, 16 Dicembre 2016

Osteosarcoma a piccole cellule Tra i tumori primitivi dell’osso, l’Osteosarcoma (OS) è il tumore maligno più diffuso. Suddiviso in diverse varianti sulla base delle caratteristiche cliniche, radiografiche e microscopiche, presenta varianti a basso e ad alto grado di malignità. Tra queste ultime si annovera l’Osteosarcoma a piccole cellule (SCO, Small Cell Osteosarcoma). È una delle forme più rare, ma più aggressive di OS. È Diffuso prevalentemente in età pediatrica e giovane adulta con un incidenza del 1.5% di tutti i casi di OS diagnosticati. Coinvolge principalmente le metafisi delle ossa lunghe. Da un punto di vista istologico presenta cellule piccole e tondeggianti, aree necrotiche e regioni stromali caratterizzate dalla presenza di matrice osteoide Trattamenti terapeutici che sono ad oggi multidisciplinari (i.e. chemioterapia pre operatoria, intervento chirurgico e chemio- e/o radio-terapia post operatoria. Nonostante i quali la prognosi a 5 anni rimane < 20%, con un’alta percentuale di pazienti che dopo i trattamenti presentano recidive o metastasi polmonari. Yaw, K.M. Seminars in Surgical Oncology (1999); Klein, M.J. et al. American Journal of Clinical Pathology (2006); Cotteril S.J. et al. Pediatric Blood Cancer (2004).

Sarcomi e Cellule Staminali Tumorali (CSCs) Gibbs CP et al. Neoplasia. 2005; Wang L et al. Cancer Biol Ther.2009; Clarke MF et al. Cancer Res 2006; Magee JA et al. Cancer Cell. 2012; Filemon S Dela Cruz. Front Oncol. 2013; Prospettiva innovativa nella battaglia all’OS recentemente è emersa dalla ricerca sul ruolo delle “Cellule Staminali Tumorali” (CSCs). I sarcomi, come i tessuti sani da cui prendono origine, sono composti da una popolazione cellulare eterogenea. Come nei tessuti sani risiede una sottopopolazione di cellule distinte dotate della capacità di auto-rinnovamento e di mantenimento dell’omeostasi tissutale, generando cellule differenziate, così anche i sarcomi presentano la stessa eterogeneità cellulare. La presenza delle CSCs offre quindi la possibile spiegazione al perché la maggior parte dei trattamenti sembrano avere inizialmente effetto antineoplastico, ma a distanza di anni dalla terapia il paziente presenta recidive o metastasi. Rendendole possibili target primari per lo sviluppo di terapie antineoplastiche mirate e più efficaci. Capacità di autorinnovamento indefinita Mantenimento della popolazione tumorale eterogenea Capacità differenziativa multilineare: adipociti, osteoblasti, condrociti e miociti Capacità di crescita in condizioni estreme Espressione di marker specifici del fenotipo mesenchimale: CD44, CD105, CD90, CD117, CD34 Espressione di geni tipici delle cellule staminali embrionali: Nanog, Oct 3/4 (POU5F1), Sox-2, Lin-28 e KLF4 Capacità di formare colonie simil-fibroblastiche CFU-F (Colony Forming Units-Fibroblasts) Alti livelli di Aldeide Deidrogenasi (ALDH) Capacità di dare metastasi in altri organi/tessuti Capacità di resistere agli agenti antineoplastici

Scopo della ricerca Isolare e caratterizzare da un campione di Osteosarcoma a piccole cellule (SCO) una linea cellulare primaria di CSCs (SCO-CSCs) per lo studio della loro biologia, al fine di individuare possibili marcatori molecolari che potranno essere utilizzati come target di nuove terapie mirate contro le CSCs, ed essere quindi maggiormente efficaci.

Coltura primaria, Sarcosfere e SCO-CSCs Campione bioptico di SCO da prelievo chirurgico Linea cellulare primaria di SCO. Osservazione in contrasto di fase con obiettivo 10x. Linea cellulare primaria di SCO-CSCs isolata dalle sarcosfere. Osservazione in contrasto di fase con obiettivo 10x. B C D E A A. Saggio di crescita in non adesione a 24h dalla semina. B. Prime sarcosfere formatesi a 7 gg. C. Sarcosfere a 24 gg dall’inizio del saggio. D. Sarcosfera in condizioni di normale adesione. E. Espansione delle cellule dalla sfera inn adesione. Osservazione in contrasto di fase con obiettivi 20x e 40x .

Caratterizzazione 1 A B A B 0 giorni 30 giorni Differenziamento adipogenico valutato a 0 gg (A) e dopo 30 gg (B) di induzione mediante colorazione con OIL Red O. In rosso i vacuoli lipidici intracellulari e in azzurro i nuclei contro colorati con Ematossilina. Osservazione in campo chiaro. Obiettivo 40X A. Sarcosfere a 24 gg dall’inizio del saggio. Osservazione in contrasto di fase con obiettivo 40x. B. Linea di SCO-CSCs-II isolata dalla II generazione di sarcosfere a partire dalla linea SCO-CSCs.Osservazione in contrasto di fase con obiettivi 20x. 0 giorni 21 giorni A B C D A-B. Differenziamento osteogenico valutato a 0 gg e dopo 21 gg di induzione mediante colorazione per la ALP con Fast Blue BB. In blu le cellule ALP+ (B), in rosso i nuclei contro colorati con Ioduro di Propidio. Osservazione composita in campo chiaro e in epifluorescenza. Obiettivo 20X. C-D. Colorazione dei depositi di HA con Alizarina Red S. In rosso-arancio i depositi di HA. Cellule non colorate, contrastate in grigio. Osservazione in contrasto di fase. Obiettivo 20X A B

Caratterizzazione 2 A B C D E F G H I L Espressione di Nanog (A), POU5F1 (C), SOX2 (E), KLF4 (G) e di LIN28A (I) nella linea di SCO-CSCs isolata dalla linea primaria di OS a piccole cellule (SCO) e nella linea di fibroblasti usata come controllo (B-D-F-H-L). In verde l’anticorpo. In rosa i nuclei. Per effetto della colocalizzazione dei fluorofori la colorazione nucleare appare quasi bianca. LSCM a colori convenzionali. Obiettivo 40x. ALDH1A1 MYC SCO-CSCs PROM1 AXL EZR CD34 β-Actin SCO KLF4 Sox2 LIN28A Nanog POU5F1 Espressione in Real Time PCR dei geni marcatori della staminalità embrionale (i.e. POU5F1, Nanog, LIN28A, SOX2 e KLF4) e dei geni caratterizzanti le CSCs (i.e. PROM1, MYC, ALDHA1, CD34, EZR ed AXL) B D A C Espressione di CD44 (A), CD105 (B) e CD45 (C) nella linea di SCO-CSCs isolata dalla linea primaria di OS a piccole cellule (SCO) e nella linea di fibroblasti usata come controllo (D). In verde l’anticorpo. In blu i nuclei. LSCM a colori convenzionali. Obiettivo 20x.

Conclusioni Nello studio qui mostrato non solo si presenta per la prima volta l’allestimento di una linea cellulare umana finita di Osteosarcoma a piccole cellule (SCO), ma anche l’allestimento/caratterizzazione di una linea di CSCs di SCO. Presentando così il primo modello cellulare in vitro utile allo studio della biologia di questa rara forma di Osteosarcoma altamente aggressiva.

Ringraziamenti Dipartimento di Neuroscienze, psicologia, Area del Farmaco e Salute del Bambino (NEUROFARBA), Università di Firenze Dr.ssa Alessandra Aldinucci SOD di Ortopedia Oncologica e Ricostruttiva_AOUC, Firenze : Prof. Domenico Andrea Campanacci Sezione di Anatomia Patologica, DCMT, Università di Firenze, Firenze: Prof. Alessandro Franchi Dr. ssa Antonella Simoni Progetto di ricerca interamente finanziato dall’ Istituto Toscano Tumori _ Grant ITT 2010 Clinica Universitaria Ortopedia e traumatologia, AO, Pisa: Prof. Rodolfo Capanna Sezione di Endocrinologia e Malattie del Metabolismo, DCMT, Università di Firenze, Firenze: Prof.ssa Maria Luisa Brandi Dr. Roberto Zonefrati Dr.ssa Cecilia Romagnoli Dr. Carmelo Mavilia Dr. ssa Gigliola Leoncini Dr.ssa Francesca Marini

GRAZIE