Dr. Carlo Visco Divisione di Ematologia, Ospedale S. Bortolo, Vicenza PROGRESSI NELLA DIAGNOSI E NELLA TERAPIA DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE Udine, 17/11/2006 Definizione clinica, laboratoristica, biologica e molecolare di aggressività di malattia Dr. Carlo Visco Divisione di Ematologia, Ospedale S. Bortolo, Vicenza

Malattie linfoproliferative “aggressive” “Rilevante sintomatologia all’esordio e rapida progressione se non trattate” Una definizione che ricalca quello che un ematologo intende per aggressiva quando si trova davanti un paziente con malattia linfoproliferativa. Longo DL. Philadelphia: Lippincott 1995

Valutazione clinica di aggressività (I) Tumore dipendente - Diagnosi istologica e grading (cinetica cellulare) - Stadio clinico - Dimensione massima della neoplasia (bulky) - Siti nodali ed extranodali coinvolti - LDH, Beta2-microglobulina - Correlazione con agenti infettivi (HIV, HCV, HP, EBV, HHV-8 etc) B vs T. grading del follicolare, burkitt o gr cellule vs bassi gradi, PL vs clHL LDH etc: universalmente considerati come sinonimo di aggressività, riflettono il bulky e lacinetica cellulare HHV-8= PEL, Multicentric Castleman disease, quasi sempre in ambito HIV

Valutazione clinica di aggressività (II) Paziente dipendente Risposta alla neoplasia: - Performance Status - Sintomi B (Perdita di peso >10%, sudorazioni notturne, febbre >38°C) - Insufficienze d’organo Capacità di tollerare il trattamento: - Performance Status - Età - Co-morbidità Performance status e sintomi B sono direttamente correlati alle citochine secrete dal tumore. Insufficienza organo da compressione, da infiltrazione o da lisi tumorale (stomaco, midollo). Gli altri 3 sono i principali parametri su cui si basa una decisione terapeutica…un anziano…

Stadiazione di Ann Arbor (1971) Stadio I: Una singola regione linfonodale coinvolta Stadio II: Due o più aree linfonodali coinvolte dallo stesso lato del diaframma Stadio III: Aree linfonodali coinvolte da entrambi i lati del diaframma Stadio IV: Interessamento diffuso o disseminato di una o più sedi extranodali Ancora indispensabile nelle decisioni terapeutiche, meno nell’indicazione prognostica. Il 70-80% dei pazienti si presenta in stadio avanzato. Non include il Bulky. Il caposaldo nella stadiazione con l’eccezione delle forme leucemiche. Dopo la dgn istologica (di cui vi ha già parlato) il primo approccio alla definizione clinica di aggressività. Nata per l’HL e ancora importante per essa. B = Perdita di peso >10%, sudorazioni notturne, febbre >38°C S = coinvolgimento splenico E = singola sede extranodale

Differenze dell’OS nel linfoma follicolare Sopravvivenza mediana 10 anni Survival (years) Probability 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 5 10 15 20 25 Stadio Ann Arbor III-IV L’80% dei pazienti si presenta in stadio avanzato. Discorso applicabile ad altre categorie più rare di linfoma a basso grado (LPC, MZL, mantle) che esordiscono in stadio avanzato quasi sempre

FLIPI Philippe Solal-Céligny, et al. Follicular Lymphoma International Prognostic Index Blood, Sep 2004; 104: 1258 - 1265 The IPI is limited for FCL- only 10-15% are labelled poor- risk in that series L’interesse del flipi sarà nell’era dell’immunoterapia e della RIT nel tailor il treatment. Recentemente validato anche nei pazienti trattati con Mabthera. Individua 3 gruppi di pazienti. Paziente il primo, poi lab e malattia.

Linfoma B diffuso a grandi cellule International Prognostic Index Revised International Prognostic Index (R-IPI) is a better predictor of outcome than the Standard IPI for patients with DLBCL treated with R-CHOP. Blood 15 nov 2006: 0/1-2/3-5: tre gruppi invece di 4. PS al posto di Hb level e siti extranodali al posto di nodali: il PS è infatti un parametro che assume un significato importante nei linfomi aggressivi perché esprime l’impatto del tumore sul pazientee la capacità del paziente di tollerare terapie necessariamente più aggressive. Nei bassi gradi difficilmente il PS è alterato dal tumore stesso. Esistono altri schemi che includono bulky e Beta2, vedi TS (n=2.031) Performance status>1; età>60; LDH>norm; n° sedi extranodali>1; AAS III-IV The International Non Hodgkin’s Lymphoma Prognostic Factors Project. N Engl J Med 1993

International Prognostic Score Linfoma di Hodgkin International Prognostic Score Hasenclever et al, 1998 Hb < 10.5 g/dl > Albumina età > 45 aa. Stadio IV Sesso M GB > 15.000 mmc. Linfociti <600 mmc. 1618 pz Gli schemi basati su parametri clinici finora utilizzati sono di utilità limitata. Falliscono nell’individuare pazienti con altissimo rischio di recidiva. Figure 1. Use of the Prognostic Score to Predict Rates of Freedom from Progression of Disease (Panel A) and Overall Survival (Panel B) in 1618 Patients with Advanced Hodgkin's Disease. Seventy-five percent of the study population had classic advanced disease (Ann Arbor stage IIIB, 33 percent; stage IVA, 13 percent; and stage IVB, 29 percent), and 12 percent had stage IIIA disease. Thirteen percent of the patients presented with stage I or II disease (stage I, 1 percent; stage IIA, 4 percent; and stage IIB, 8 percent). Eta’ e sesso per il paziente, il resto lab e stadio (tumore) Hasenclever and Diehl, N Engl J Med 1998

Rilevanza clinica della sede anatomica coinvolta (I) Linfoma primitivo del SNC: Batchelor T et al, J Clin Oncol 2006 Oltre il 90% DLBCL La barriera emato-encefalica rende inefficaci i comuni schemi terapeutici Clinica e terapia sui generis La sede anatomica coinvolta conferisce caratteristiche diverse di aggressività per definizione nel SNC, come tutte le masse che crescono nella scatola cranica (parla dell’edema, doppia freccia) La massa espande infiltrando il corpo calloso B dopo contrasto lo prende e si vede l’alone di edema (doppia freccia). C è la RMN in T2, con contrasto la D in T1. Sempre l’edema in doppia freccia L’approccio biologico ad una malattia simile ha un’importanza relativa perché tutti hanno una clinica aggressiva

Rilevanza clinica della sede anatomica coinvolta (II) Linfoma primitivo del testicolo: Pessima prognosi e tendenza alla ricaduta anche tardiva Alta percentuale di recidive al SNC e al testicolo controlaterale Time (months) Fraction Alive Patients Deaths 43 29 .2 .4 .6 .8 1 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Patients Failures 43 24 20 40 60 80 120 140 160 180 PFS Visco C et al, Clin Lymph 2001 Sono gr cellule B. Anche se raro nasconde peculiarità biologiche solo in parte chiarite. Sottolinea che la pessima prognosi anche in stadio I favorevole secondo IPI, anche se trattati con antracicline, Recidive testicolari 20% anche tardive, recidive meningee 30% precoci (<2 anni). Discorso dell’età>60

Rilevanza clinica della sede anatomica coinvolta (III) Linfoma primitivo cutaneo Fraction Alive Time (years) Patients Deaths 53 13 2 4 6 8 10 12 14 .2 .4 .6 .8 1 53 pazienti con linfoma aggressivo: DLBCL, anaplastico a grandi cellule, linfomi T-periferici Visco C et al, Ann Oncol 2002 L’aggressività istologica spesso non corrisponde all’aggressività clinica DLBCL, leg-type Sindrome di Sezary OS mediano 2-5 anni I cutanei sono ALK-. Le cell di Sezary sono cellule T nel sangue periferico, skin e adenopatie. CD4+, CD8-. Triade: eritrodermia, linfoadenopatie, cellule di Sezary

I parametri clinici e laboratoristici nella definizione di aggressività Descrivono la diffusione della malattia e il suo impatto sullo stato del paziente Tuttora “gold standard” nelle decisioni terapeutiche Conseguenza delle intrinseche caratteristiche biologiche della malattia modulate dalla risposta dell’ospite Necessitano di essere integrati da parametri biologici

Approccio multifattoriale nella definizione di malattia linfoproliferativa The Revised European-American Lymphoma (REAL) classification is based on the principle that a classification is a list of "real" disease entities, which are defined by a combination of morphology, immunophenotype, genetic features, and clinical features. La svolta, in linea con la WHO, il patologio fa un passo nella clinica. Rappaport solo morfologia, cell lineage and differentiation nella Kiel. WF dimensioni della cellula (cell size), pattern di crescita (nodal pattern), morfologia, gradi di aggressività sul survival dei pazienti non trattati Harris NL et al, Blood 1994

Il linfoma anaplastico CD30+ L’aggressività clinica varia radicalmente con la sede iniziale di malattia e con l’espressione della proteina ALK A) Primitivo cutaneo Età media 60 anni ALK negativo Prognosi ottima con sola chirurgia o radioterapia Papulosi linfomatoide Istologicamente, fenotipicamente e clinicamente sovrapponibile Continue remissioni spontanee perché patologia benigna DD Come esempio estremamente semplice e calcante dell’integrazione tra caratteristiche cliniche e molecolari nella definizione di aggressività di malattia abbiamo il ALCL Nodulo rossastro tipicamente isolato. Sottolinea che è un linfoma T o null istologicamente aggressivo. Età media 60 anni come tutti i tumori alk-. Willemze R et al, Blood 2005

Il linfoma anaplastico CD30+ L’aggressività clinica varia radicalmente con la sede iniziale di malattia e con l’espressione della proteina ALK B) Primitivo sistemico ALK+ M/F 6,5 I-III decade Stadio avanzato con sintomi B (++ febbre) Frequente coinvolgimento organi extranodali ALK- M/F 0,9 V-VII decade Più rari i sintomi B e le localizzazioni extranodali Proteina di fusione che deriva dalla traslocazione. Qui la riflessione che l’aggressività clinica iniziale non è sempre sinonimo di cattiva prognosi (vedi burkitt, mediastinico) Stein H et al, Blood 2000

Linfoma B diffuso a grandi cellule (DLBCL) sec. REAL/WHO Il più comune tra i LNH (30-40%) Insieme eterogeneo di entità che variano per presentazione clinica, pattern immunofenotipico e caratteristiche genetiche e molecolari Generalmente richiede un trattamento immediato Patologie generalmente aggressive. Spesso corredato da sintomatologia importante, richiede un trattamento tempestivo (vedi def di aggressivo) E’ una real entity destinata ad essere frammentata nelle futureclassificazioni

Overall survival (years) Il profilo di espressione genica identifica diverse entità cliniche tra i DLBCL 2 4 6 8 10 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 GCB Type 3 ABC P < 0.001 Overall survival (years) Probability I DLBCL che originano dal CG condividono una miglior prognosi Tecnica del gene-microarray Entità cliniche differenti. Migliaia di geni analizzati. ABC sta per activated peripheral blood B cells. Rosenwald A, et al. N Engl J Med 2002

La predittività del profilo genico è indipendente dall’IPI Rosenwald A, et al. N Engl J Med 2002

Linfoma B primitivo del mediastino Un distinto profilo di espressione genica si riflette in un differente comportamento clinico Caratteristiche cliniche Femmine giovani Massa localizzata al torace Sindrome mediastinica Recidive extratoraciche Rosenwald A, et al. J Exp Med 2003 Related to HL, buon survival rispetto ai DLBCL, non esprimono o poco il CD10, 30-35 anni vs 60 anni per gli altri DLBCL. Non solo una distinzione dal p. di v. prognostico ma il profilo genico può caratterizzare e scorporare altre patologie e spiegare perchè la clinica è diversa.

Dallo studio del genoma al prodotto proteico Studio del profilo di espressione genica (Micro-array genomico) DNA mRNA Espressione di singoli geni (RT-PCR, nested-PCR) Il primo ha dati il là allo studio di singoli geni e successivamente alla loro espressione proteica. Progressiva discesa dei costi umani e dei macchinari.

Modello prognostico basato sullo studio in qRT-PCR di sei geni LMO2, BCL6, FN1 Bassa aggressività clinica CCND2, SCYA3, BCL2 Alta aggressività clinica IPI 0-1 IPI 2-3 IPI 4-5 FN1=fibronectina1 è una glicoproteina extracellulare recettore di adesione per le cellule mesenchimali. LMO proteina espressa nel centro germinativo recentemente individuata in ihc su blood ahead of printing. Bcl-6 rende possibile la maturazione delle cellule B Lossos et al. N Engl J Med 2004

Dallo studio del genoma al prodotto proteico Studio del profilo di espressione genica (Micro-array genomico) DNA mRNA Espressione di singoli geni (RT-PCR, nested-PCR) Il primo ha dati il là allo studio di singoli geni e successivamente alla loro espressione proteica. Progressiva discesa dei costi umani e dei macchinari. Prodotto Espressione proteica (IHC, micro-array tissutale)

Marker fenotipici nei DLBCL Centro germinativo Mutazione somatica Ig Plasma cell Naïve B-cell Memory B-cell Progenitor B-cell BCL-6 CD138 MUM-1 CD10 Parla un attimo del mum-1 (Mult myeloma 1) e del cd138

La classificazione immunoistochimica dei DLBCL + GCB CD10 + Non-GCB CD10 + Mum-1 GCB Bcl-6 Bcl-6 Non-GCB 5 10 20 15 P < 0.001 Overall survival (%) 40 60 80 100 GCB (n = 64) Non-GCB (n = 88) I risultati del gene-microarray vengono validati e trasferiti a livello di tissue- microarray (IHC) Hans C, et al. Blood 2004

un ulteriore passo avanti Sottotipi di DLBCL: un ulteriore passo avanti Due geni fondamentali nella regolazione del ciclo cellulare: bcl-2: azione anti-apoptotica (cr. 18q) p53: azione pro-apoptotica (cr. 17p) La t(14;18) mette la bcl-2 a contatto con l’Ig heavy chain gene enhancer. Non è un fattore prognostico nel DLBCL correlata o meno alla presenza di t(14;18) Una volta assodata l’esistenza di almeno due tipi di DLBCL ad aggressività e prognosi diversa, individuabili con le metodiche suddette facciamo un altro piccolo sforzo. Se andate a vedere in letteratura vedrete che Ruolo controverso nell’individuare i pazienti con DLBCL a maggiore aggressività e prognosi sfavorevole

Espressione di bcl-2 nei DLBCL 50% non espresso 50% espresso GC DLBCL Non-GC DLBCL t(14;18) mai presente Correla con la presenza di t(14;18) La t(14;18) mette la bcl-2 a contatto con l’Ig heavy chain gene enhancer. ABC DLBCL patients also have high levels of BCL2 expression in the absence of t(14;18)(q32;q21), indicating alternative mechanisms of BCL2 upregulation . Circa il 50% dei DLBCL in toto iperesprimono la bcl2 (>30%) T(14;18) nel 35% dei GC. Bcl-2 expression potrebbe rappresentare l’attivazione di due differenti vie genetiche nei due sottotipi. Fig 3. Representative images of (A) 18q21 amplification and (B) t(14;18) by interphase fluorescence in situ hybridization. 18q21 was frequently amplified in the activated B-cell–like subgroup. The t(14;18) shows two yellow fusion signals from probes on 14q32 and 18q21. The presence of more than three red signals along with two aqua signals depicts amplification. …deriva quindi da vie patogenetiche diverse nei due tipi di DLBCL… Huang et al, Blood 2002

Espressione di bcl-2 nei DLBCL Non-GC DLBCL GC DLBCL 18q21 amplification t(14;18) La t(14;18) mette la bcl-2 a contatto con l’Ig heavy chain gene enhancer. ABC DLBCL patients also have high levels of BCL2 expression in the absence of t(14;18)(q32;q21), indicating alternative mechanisms of BCL2 upregulation . Circa il 50% dei DLBCL in toto iperesprimono la bcl2 (>30%) T(14;18) nel 35% dei GC. Bcl-2 expression potrebbe rappresentare l’attivazione di due differenti vie genetiche nei due sottotipi. Fig 3. Representative images of (A) 18q21 amplification and (B) t(14;18) by interphase fluorescence in situ hybridization. 18q21 was frequently amplified in the activated B-cell–like subgroup. The t(14;18) shows two yellow fusion signals from probes on 14q32 and 18q21. The presence of more than three red signals along with two aqua signals depicts amplification. Huang et al, Blood 2002

Rilevanza clinica di bcl-2 nei sottotipi di DLBCL L’espressione di bcl-2 sia come mRNA che come proteina è un bio-marker di aggressività di malattia nel sottogruppo dei non-GC, ma non dei GC-DLBCL Bcl-2+ Bcl-2- GC t(14;18) Bcl-2- E sottointende vie patogenetiche diverse. Ecco spiegato perché t(14;18) non è mai stato un prognostic factor nei dlbcl Non-GC Bcl-2+ 18q ampl, etc. Iqbal et al, JCO 2006

Sottotipi di DLBCL: ruolo di p53 Il “guardiano del genoma” Mutazioni del gene correlano con l’aggressività della malattia in varie m. linfoproliferative (MCL, SLVL, LLC, MM) Il gene della p53 è mutato nel 20% dei DLBCL Le mutazioni sembrano essere distribuite uniformemente tra GC e non-GC DLBCL ma il loro ruolo è controverso nei DLBCL presi in toto…. E’ implicata nella patogenesi di circa la metà dei cancri nell’uomo

Rilevanza clinica delle mutazioni di p53 nei sottotipi di DLBCL A. CG B. Non-CG Recentemente è emerso che i tumori legati alla bcl-6 necessitano di una p53 non funzionante per svilupparsi….Nature Visco C et al, Hematologica, 2006

Impatto clinico delle nuove acquisizioni biologiche nei DLBCL: Questioni aperte Conosciamo tutte le entità cliniche dei DLBCL? Come portare queste acquisizioni nella clinica? Questi modelli devono essere ri-modellati secondo le più moderne strategie terapeutiche

Impatto clinico delle nuove acquisizioni biologiche nei DLBCL: Questioni aperte Conosciamo tutte le entità cliniche dei DLBCL? Come portare queste acquisizioni nella clinica? Questi modelli devono essere ri-modellati secondo le più moderne strategie terapeutiche

Impatto clinico delle nuove acquisizioni biologiche nei DLBCL: Questioni aperte Conosciamo tutte le entità cliniche dei DLBCL? Come portare queste acquisizioni nella clinica? Questi modelli devono essere ri-modellati secondo le più moderne strategie terapeutiche

Espressione di bcl-6: R-CHOP vs CHOP Concentrati su bcl-6-!!! Il miglioramento dell’outcome dato dall’R potrebbe essere dovuto al fatto che cura meglio i non-CG ovvero bcl6-. L’IPI rimane il top nell’R-CHOP!!!! Se confermati questi dati comportano che l’R-chop venga usato solo nei Bcl-6-. Il rituxan migliora i bcl2+ e bcl6-. Revised International Prognostic Index (R-IPI) is a better predictor of outcome than the Standard IPI for patients with DLBCL treated with R-CHOP. Blood 15 nov 2006 La normale funzione del bcl6 nel CG accompagna e rende possibile il processo di somatic hypermutation che porta alla maturazione delle cellule B Apre orizzonti su trattamenti mirati Winter JN, et al. Blood 2006

Aspetti molecolari della LLC Centro germinativo IgVH non mutato IgVH mutato Mutazione somatica IgVH Naïve B-cell Plasma cell Progenitor B-cell Memory B-cell 17p-/11q- 35% 17p-/11q- 7% Spezzata in due tronconi, una in balia dell’amntigene, l’altra che ha terminato il suo percorso differenziativo ZAP-70+ ZAP-70- AGGRESSIVA INDOLENTE

…e il micro-environment? Nel linfoma follicolare le caratteristiche di espressione genica delle cellule accessorie (non tumorali) influenzano l’aggressività di malattia T cell signature genes with a survival advantage Macrophage signature genes with inferior survival [Dave S. et al, NEJM, 2004] Nei linfomi primitivi del testicolo e del SNC la perdita dell’antigene leucocitario umano (HLA I e II) protegge le cellule B tumorali dall’effetto citotossico delle cellule T CD4+ e CD8+, rendendo inefficace la risposta immune antitumorale. [Booman et al, Clin Cancer Res 2006] 1. Diff DLBCL e MCL 2. delezioni Più o meno quello che fa il flipi (vedi diapo precedente). Riflessione sull’effettiva efficacia dei vaccini nel LF, il linfoma che appare più responsivo a questo tipo di approccio. Un unico studio, mai confermato, va preso comunque con le pinze. Tipo c’è uno studio pilota di 26 pazienti trattati con rituxan che hanno il gene expression e i geni espressi non sono gli stessi che predicono il survival in questa serie. Indipendente dall’IPI. Ricordo che gli altri predictive models basati sul gene profiling (DLBCL e MCL) si basavano su geni espressi direttamente dalla cellula tumorale. Per la discussione: pensa al microenvironment nel MALT HP+, nel NHL HCV+, nella CLL mutata. Rosenwald 2002 NEJM la cosidetta “lymphnode signature” con markers macrofagici e Nk sono associati a miglior outcome. Il testicolo è spesso bcl2+ ma senza t(14;18) e non GC, il CNS è di tutti i tipi ma ha un profilo genico diverso dai nodali. L’HLA è espresso su tutte le cellule nucleate e serve a presentare l’antigene alle cellule T. Rosenwald aveva trovato 3 tipi: MHC classe II, lymphnode signature (host response) e GC. Negli Immune priviledged sites vi sono larghe delezioni a giustificare la perdita dell’HLA. Il linfoma a grandi cellule B primitivo cutaneo leg-type ha Un profilo genico non CG a differenza dei linfomi con altre sedi, Esprime il BCL-2, MUM-1, quasi mai il CD10 + testis (tutti non GC) Nei linfomi a grandi cellule e centro-follicolari primitivi cutanei i geni associati alla risposta immune antitumorale sono iperattivati [Hoefnagel et al, Blood 2005]

Tecniche di microarray Definizione di aggressività di malattia Sottotipo istologico +/- grading Citogenetica-FISH Biologia molecolare Citofluorimetria 100 101 102 103 104 CD3+CD56 PE-> ZAP-70 FITC-> 40% Immunoistochimica Stadiazione clinica Si arriva così alla definizione moderna di aggressività Ki67. Come vedremo nessuno di questi aspetti può essere eliminato dalla pratica clnica e la loro importanza varia di patologia in patologia Impatto sul paziente Tecniche di microarray genomico e tissutale

Conclusioni (I) Le più recenti classificazioni delle malattie linfoproliferative forniscono gli “strumenti” per una più accurata stratificazione prognostica e favoriscono l’individuazione di nuovi possibili target terapeutici I fattori prognostici clinici sono basati su studi retrospettivi e su strategie terapeutiche non più in uso Velcade, anti bcl-2 etc

Conclusioni (II) Oggi è possibile distinguere diverse “entità cliniche” all’interno di una stessa categoria linfoproliferativa. Con la migliore comprensione dei meccanismi di oncogenesi contrasta la scarsa conoscenza della storia naturale di queste nuove entità che possono variamente risentire delle più moderne terapie Le nuove entità emergenti dovranno essere validate mostrando una diversa sensibilità alle terapie attuali e un distinto valore prognostico Velcade, anti bcl-2 etc

Conclusioni (III) Come studiare oggi una m. linfoproliferativa per stabilirne prognosi e terapia? - Anamnesi, es. obiettivo, esami strumentali - Osservazione nel tempo a seconda dell’istotipo (CLL, MM, etc) - Parametri di laboratorio (emocromo, LDH, Beta2M, etc) - Caratterizzazione istologica con studio fenotipico (Ki-67, ZAP-70, etc) - Studio citogenetico/FISH e molecolare (gene IgVH, bcl-2, p53, etc) I parametri “clinici” e “biologici” devono essere integrati nelle decisioni terapeutiche