ENTRIAMO IN LABORATORIO …

Laboratori Forensi Medicina Legale Genetica Polizia Scientifica (Roma) Carabinieri (Parma, Messina)

Standardizzazione delle procedure analitiche ed il controllo qualità sono fondamentali per questo tipo di analisi (garanzie per giudici e imputati) ISFG (International Society of Forensic Genetics) riferimento per l’Europa GeFI (Italia)(Genetisti Forensi Italiani) Raccomandazioni, linee guida

L’analisi del DNA è una procedura scientifica sofisticata che dovrebbe essere solamente condotta dai laboratori che possiedono le appropriate attrezzature…Gli stati membri dovrebbero assicurare che …laboratori o istituzioni accreditati soddisfino i seguenti criteri: Alta conoscenza professionale combinata con appropriate procedure di controllo di qualità Integrità scientifica Adeguata salvaguardia per assicurare assoluto riserbo nel rispetto delle dell’identificazione delle persone Garanzia che le condizioni contenute siano seguite Gli stati membri dovrebbero instituire un sistema di supervisione regolare dei loro laboratori accreditati(Consiglio d’Europa, 1992)

Analisi preliminari… repertazione… Tali analisi risultano fondamentali in alcuni casi: Sospetto rapporto incestuoso risulta essenziale individuare macchie di sperma su indumenti della figlia.

I° FASE ESTRAZIONE DNA

Estrazione di DNA Varie metodiche per estrazione DNA: Estrazione manuale: vari kit in commercio ( spin basket, biglie magnetiche) Estrattori automatici

Diagnosi individuale: determinazione del profilo del DNA ESTRAZIONE DEL DNA Rottura membrane cellulari Purificazione Precipitazione Concentrazione

Estrazione del DNA da sangue

Una goccia di sangue Saliva presente su una sigaretta o su un chewing-gum Tracce di sperma Urine e feci Un capello Fossili (dinosauri inclusi) Mummie

DNA da lacrime UNITED STATES AIR FORCE COURT OF CRIMINAL APPEALS ... where Dr. Tim Kalafut performed DNA extraction and comparison. ... Dr. Kalafut continued to say that “tears” are another good source of DNA. ...

Estrazione di DNA dalla mucosa buccale

Estrazione di DNA da mummie Mummia del Faraone Tutankamen, 1354 a.C.

II° FASE Amplificazione dei tratti polimorfici

Analisi in PCR (1997) Metodo enzimatico che ci permette di ottenere una grande quantità di copie del frammento di DNA che contiene uno o più loci polimorfici Sequenziamento Analisi dei frammenti

Reazione a catena della polimerasi (PCR) Mezzo rapido ed economico per ottenere grandi quantità (amplificazione) di una specifica sequenza di DNA o RNA Sfrutta la capacità della polimerasi di catalizzare la sintesi di acidi nucleici a partire da un filamento stampo

PCR: 3 Fasi Denaturazione : apertura doppia elica Annealing : attacco dei primers Extension : copiatura da parte della Taq polimerasi

Reazione di Polimerizzazione a Catena (PCR)

Reagenti necessari per la PCR DNA Primers Oligonucleotidi Taq polimerasi Buffer e Magnesio H2O Ciclo standard di PCR 94°C 10 m 1 ciclo 35 cicli 72°C 10 m 1 ciclo 94°C 30s 58°C 30s 72°C 30s

Vantaggi della PCR a) Sensibilità. Si possono amplificare regioni specifiche di DNA avendo a disposizione pochissimo materiale b) Velocità. In poche ore è disponibile l’amplificazione del frammento desiderato

Limiti della PCR a) Sensibilità. Tecnica suscettibile di contaminazione da parte dell’operatore o da parte di prodotti di precedenti amplificazioni b) Necessità di nozioni a priori. Per poter costruire i primers necessari alla reazione, è necessario avere informazioni precise inerenti le regioni fiancheggianti la sequenza da amplificare c) Dimensioni degli amplificati. I prodotti della PCR, in condizioni standard,non superano i 5Kb

Metodica AmpFlSTR identifilerTM Amplification kit Amplificazione di 15 loci STR e del marker Amelogenina per la determinazione del sesso

La scelta degli STR per l’indagine forense è dovuta da: Marcatori che vengono ereditati dai genitori senza che subiscano variazioni (salvo eventi rari) Trattandosi di ripetizioni corte è molto più probabile travarli intatti su materilali biologici molto degradati o antichi È possibile analizzare più loci in contemporanea il che favorisce l’uso di sistemi automatici di analisi Sono altamente polimorfi presentando ogni STR un elevato numero di alleli

I polimorfismi di lunghezza Vengono oggi studiati con la tecnica di polimerizzazione a catena (PCR)