Corso di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica Lucio Pastore (c/o CEINGE-Biotecnologie Avanzate, via G. Salvatore 486 e Dip. Medicina Molecolare e Biotecnologie Mediche) Giorno ricevimento martedì dalle 14 alle 15.30 lucio.pastore@unina.it

Testi di consultazione: Argomenti trattati: In successione da calendario delle lezioni pubblicato sulla guida dello studente Testi di consultazione: Medicina di Laboratorio (G. Federici ed altri , 2008-Mc Graw Hill) Medicina di Laboratorio e Diagnostica Genetica (L. Sacchetti ed altri, 2007-Idelson-Gnocchi) Diagnosi clinica e metodi di laboratorio (Henry’s, 2010, McPherson Pincus)

Medicina di Laboratorio è una disciplina clinica che ricerca dati relativi alla natura e alla entità delle alterazioni di struttura e funzione, su campioni ottenuti dal paziente e sul paziente stesso, per elaborarli in informazioni

Diagnosi Medica Si basa su un approccio multifattoriale: Anamnesi Esame Clinico Indagini strumentali Indagini di laboratorio

Tipologie di laboratori presso l’AOU Federico II Laboratori di routine biochimica clinica ematologia e coagulazione Biologia molecolare clinica microbiologia Virologia Immunologia Dosaggi ormonali Immunotrasfusione  Laboratorio d’urgenza   Points of care Point of care- es biosensori transcutanei (es. glucosio), puntura dal dito;; monitoraggio on-line, riduzione costi trasporto e tempi attesa; svantaggi: valrif diversi, personale non appropriato, manutenzione e controllo di qualità, ripetizione dei test e risultati non confrontabili-Applicazioni: glucometer; troponina per AMI, tempo di protrombina, alcoolemia, bilirubinemia, emogasanalisi, test per la gravidanza

Appropriatezza del laboratorio (College of American Pathologists) “Il grado con cui i test di laboratorio sono efficaci, chiaramente indicati, non eccessivi e forniti ai pazienti ricoverati, ambulatoriali, a domicilio, o in qualunque altra situazione per rispondere al meglio ai bisogni del paziente” Dalla letteratura: il grado di inappropriatezza oscilla tra 30-50% Cause di Inappropriatezza del laboratorio: Analizzatori multicanali, pannelli d’organo, eccesso di richieste urgenti, eccessivo timing degli esami di monitoraggio, non eleminazione di test obsoleti. Interventi correttivi: interventi educativi, linee guida, interventi amministrativi es. il Col-HDL si può chiedere solo in seconda battuta (test condizionato) se il Col-Tot è alto >5,5 mmol/L (test condizionante)- ad es. le proteine plasmatiche non cambiano significativamente in meno di una settimana- le transaminasi invece possono cambiare in 24 ore in caso di epatite virale acuta, ma fatta la diagnosi ulteriori indagini non modificano il trattamento- Il potassio può cambiare rapidamente e così il trattamento- Le indagini raramente vanno ripetute più di una volta al giorno e se è il caso (ter. Inrtensiva) solo quelle necessarie.

Strategie per l’uso razionale dei test di laboratorio ci deve essere sempre una ragione alla base della richiesta di indagini di laboratorio per un paziente, se il test richiesto non fornisce informazioni rilevanti il suo impiego è irragionevole. Per es. quando una richiesta va fatta in urgenza? Se conoscere la risposta subito fa modificare il trattamento, altrimenti è inutile!

Prima di richiedere un test occorre conoscere…   la fisiologia dell’analita struttura, sorgente, distribuzione nel corpo, modalità di escrezione, emivita, variazioni fisiologiche, etc. i meccanismi patologici che possono produrre variazioni della concentrazione dell’analita appropriati intervalli di riferimento eventuali interferenze in vivo e in vitro Finestra diagnostica- Interferenza da farmaci (es. antibiotici su creatinina); palpazione prostatica su ACP per diversi giorni; ipokalemia dopo diuretici

Motivi della domanda di esami di laboratorio Per finalità di screening (in assenza di segni o sintomi) es. screening neonatali, screening in gravidanza, screening nell’adulto Nella fase diagnostica (conferma o esclusione di un sospetto clinico): Per istituire un trattamento immediato (esami d’urgenza) Prima di attuare un trattamento generale Per monitorare: il decorso della malattia il livello dei farmaci Per finalità medico-legali Per ricerca (consenso specifico del paziente) Gli screening neonatali iniziarono negli anni ’60 con Robert Guthrie che sviluppò il test per la fenilalanina. Premesse per lo screening: non segni della malattia, malattia seria, relativamente comune e curabile, popolazione a rischio e se necessario (in caso di malattie genetiche) fare la consulenza genetica, avere test specifici (bassa prevalenza), avere test di conferma. Con le nuove tecnologie (es. MS/MS tandem spettrometria di massa) è aumentata la possibilità di screening neonatali (es. 5 disordini del metabolismo degli ac. Grassi, 9 acidemie organiche, 6 aminoacidopatie (es. PKU fenilchetonuria), 3 emoglobinopatie. Es. PKU,diabete in gravidanza, iperlipidemie familiari- sperimentazione di un nuovo farmaco o attoivazione di una nuova indagine diagnostica

Tipi di campioni biologici Sangue (venoso, arterioso, capillare) Urine Feci Liquidi biologici: liquido cefalo-rachidiano, liquido seminale, liquido pleurico, etc. Liquido amniotico, villi coriali (indagini prenatali) Sangue intero, siero o plasma- La Raccolta di sangue è nota come flebotomia-le feci si usano per ricerche microbiologiche, per il sangue in alcuni tumori del tratto GI, per i grassi nel malassorbimento-,

Tipi di campione ottenibili con il prelievo venoso Sangue intero, plasma e siero Il tipo di campione dipende dalle indagini da eseguire, in alcuni casi la scelta è obbligata. Indagini biochimico cliniche: siero o plasma. Rispetto al siero il plasma ha emolisi inferiore.

Metodo di prelievo Bisogna eseguire il prelievo di sangue venoso evitando una eccessiva stasi venosa che può indurre fenomeni di emoconcentrazione Inoltre, è importante far defluire il sangue nella provetta spontaneamente e delicatamente per evitare l’emolisi. E’ la causa più frequente di inadeguatezza qualitativa del prelievo di sangue (60% dei campioni non processati) Conseguenza dell’emolisi è il passaggio nel siero o nel plasma dell’emoglobina e delle sostanze contenute nei globuli rossi.

Il prelievo venoso Il sangue di un uomo corrisponde a circa l'8% del suo peso ed è formato da cellule, frammenti cellulari e da plasma (contenente varie sostanze organiche, il 7% di proteine el'1% di sali inorganici). La fase liquida del sangue coagulato è il SIERO e si distingue dal plasma per l'assenza di fibrinogeno ed altre proteine che intervengono nei processi di coagulazione. Per alcuni tipi di analisi è necessario impedire la coagulazione con l'aggiunta di anticoagulanti tipo eparina, EDTA, citrato di sodio, ossalato o fluoruro di sodio.

Tecnica del Prelievo Venoso Preparazione del materiale Identificazione del paziente e delle provette Scelta della sede del prelievo Raccolta del campione Rimozione dell’ago Eliminazione dei materiali EDTA: etilenDiamina-TetrAcetato Si usa per la sua capacità di chelare gli ioni bivalenti, la cui presenza facilita l’azione delle nucleasi, che degradano il DNA. Non usare provette con Eparina, poichè può interferire con la procedura di amplificazione e con l’attività di alcuni enzimi di restrizione.

Tipi di provette in uso : Vacutainer

Scelta dell’anticoagulante caratteristiche chimico-fisiche

L’impiego di anticoagulanti è indispensabile per la misura di: fattori della coagulazione nel plasma analisi su sangue intero, come l’esame emocromocitometrico e la velocità di eritrosedimentazione (VES).

Eparina E’ un mucopolisaccaride acido che esiste in commercio come sale di litio, di sodio o di potassio. E’ considerato l’anticoagulante naturale, in quanto è presente a bassi livelli nel sangue e nei tessuti. Agisce inibendo la trombina, in associazione con l’antitrombina III, e altri fattori della coagulazione. Altera la morfologia e la colorazione dei leucociti. Provoca aggregazione delle piastrine. E’ usata per i conteggi cellulari solo nelle specie in cui l’EDTA provoca emolisi

EPARINA - ANTITROMBINA III - TROMBINA LEGA ANTITROMBINA III x2000 COMPLESSO EPARINA - ANTITROMBINA III - TROMBINA (x1200) Fattore Xa Fattore IXa (x10000)

acido etilendiaminotetracetico EDTA acido etilendiaminotetracetico Rappresenta l’anticoagulante di scelta per l’esame emocitometrico E’ il migliore per studiare la morfologia delle cellule del sangue Esplica la sua azione anticoagulante sequestrando lo ione calcio, formando con esso dei sali insolubili Non altera il volume degli eritrociti Non provoca emolisi Riduce al minimo la lisi dei leucociti Limita l’aggregazione piastrinica E’ rapidamente solubile nel sangue EDTA in eccesso raggrinzimento degli eritrociti

acido etilendiamminotetracetico FORTISSIMO CHELANTE DEL CALCIO Lega anche altri cationi divalenti (zinco, magnesio, rame) Sale di sodio o di potassio Sia la solubilità sia il pH dell’EDTA dipendono dal tipo di sale

Citrato di sodio viene universalmente impiegato per la misura della VES, per lo studio dei fattori della coagulazione e della funzionalità piastrinica. Anche il citrato esplica la sua azione anticoagulante come l’EDTA

TEST DI COAGULAZIONE (1:10) Tempo di protrombina (PT) via estrinseca e comune Tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT) via intrinseca e comune Se il rapporto aumenta per diminuito riempimento di sangue della provetta, i valori di PT e aPTT aumentano ANALISI PIASTRINE VES (1:5)

ALTRI ADDITIVI Miscela CPT INIBIZIONE DELLA DEGRADAZIONE DEL GLUCOSIO consumo di glucosio pari al 50% in 5 ore Fluoruro di sodio: enolasi Iodoacetato di litio: gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi 3 ore per far effetto efficacia di 3 giorni Mannosio: esocinasi precoce ma breve durata INIBIZIONE DELLA AGGREGAZIONE PIASTRINICA Ossalato sale di sodio, potassio o ammonio È l’anticoagulante chelante del calcio usato più raramente Può venire usato per le analisi emocoagulative in alternativa al citrato Fluoruro Esplica un’azione competitiva con il calcio plasmatico e, quindi, ha una debole azione anticoagulante alla concentrazione utilizzata. A concentrazioni più elevate induce emolisi del campione. Si accoppia, quindi, con l’EDTA per il dosaggio del glucosio in urgenza (in tempi brevi dall’esecuzione del prelievo), in quanto agisce come inibitore degli enzimi glicolitici (glicostatico). Miscela CPT Citrato trisodico + piridossalfosfato + trisidrossimetilamminometano CONSERVAZIONE DEI GLOBULI ROSSI Soluzioni contenenti destrosio

Standardizzazione del prelievo del campione biologico E’ noto che “il prelievo va effettuato sul paziente riposato e a digiuno da almeno 6-8 ore”, ma ci sono numerose condizioni che possono influenzare i risultati analitici Alimentazione Postura Attività fisica Azione farmacologica e metabolica Ritmi cronobiologici Metodo di prelievo

Alimentazione Digiuno In fase post-prandiale: la glicemia e la lipemia aumentano la potassiemia e la fosforemia diminuiscono la glicemia aumenta (infatti è possibile valutare la tolleranza al glucosio in fase post-prandiale); la potassiemia e la fosforemia diminuiscono (a causa dei processi metabolici di utilizzazione del glucosio)

Dieta Apporto glucidico: la prova di tolleranza al carico glucidico deve essere programmata, in quanto nei giorni che precedono la prova il paziente deve assumere quantità equilibrate di glucidi Apporto proteico e lipidico: in soggetti sani l’azotemia non aumenta in relazione al carico proteico, mentre la concentrazione di trigliceridi è inflenzata da variazioni dietetiche. Tuttavia, per la determinazione del metabolismo basale, il paziente deve sottoporsi ad un regime di restrizione proteica per almeno tre giorni

Alimenti che interferiscono con la determinazione di specifici analiti i tiocianati (es., la senape) o composti simili al tiouracileinterferiscono con la determinazione degli ormoni tiroidei, abbassandone la concentrazione Notevoli quantità di serotonina (es., banane e ananas fresco) aumentano il tasso di acido 5-idrossiindolacetico escreto con le urine in maniera così rilevante da far sospettare un tumore carcinoide La determinazione urinaria di aldosterone può essere influenzata da una dieta ricca di agrumi, caffè, carote e spinaci

Postura Riposo a letto (pz. degenti) e ortostatismo (pz ambulatoriali) influenzano la concentrazione di numerose sostanze In ortostatismo si ha una concentrazione ematica più alta, rispetto al paziente degente Esempio: risultano più ELEVATI NEI PZ AMBULATORIALI: Emoglobina Proteine totali Sostanze legate a proteine Calcio, colesterolo, bilirubina

POSTURA e gravidanza l’escrezione degli estrogeni è aumentata in posizione clinostatica parallelemente alla modificazione del flusso plasmatico renale al contrario in posizione ortostatica si ha un netto aumento nell’escrezione della noradrenalina.

Attività fisica Il prelievo deve essere eseguito al mattino, in condizioni di riposo in quanto l’attività fisica intensa può influenzare alcuni analiti, come gli enzimi localizzati prevalentemente nella muscolatura scheletrica. Alcuni esempi: CPK, aspartato aminotransferasi, aldolasi, lattatodeidrogenasi Ammoniaca, ac lattico, ac piruvico Catecolamine urinarie (esercizio fisico prolungato)

Dopo esercizio fisico si riscontra un aumento consistente della concentrazione di ammoniaca, acido lattico e acido piruvico. D’altro canto, l’immobilizzazione completa determina un processo di demineralizzazione del tessuto scheletrico con aumento dell’escrezione urinaria del calcio, del fosforo e della idrossiprolina.

Azione biofarmacologica e metabolica Nelle ore precedenti al prelievo i trattamenti farmacologici devono essere sospesi Interferenza diretta di natura fisica o chimica sulla reazione analitica per l’azione farmacologica, immunologica o tossicologica dei medicamenti Ad esempio: la vit. A e la riboflavina contengono pigmenti gialli che vengono assorbiti nel tratto intestinale, possono alterare la misura della bilirubina

Diuretici  alterano la concentrazione degli elettroliti nei liquidi biologici Morfina e metildopa  innalzano il tasso di catecolamine nel sangue Eparina  diminuisce la secrezione di aldosterone Bismuto, fenotiazine, inibitori delle monoaminoossidasi e altri farmaci con azione epatotossica  alterano il livello della fosfatasi alcalina Vit. K  aumenta la sintesi epatica di protrombina e diminuisce quindi il tempo di protrombina e il tempo di emorragia Vit. D  alterazione della calcemia Allopurinolo  riduce la sintesi dell’acido urico e diminuisce l’uricemia Barbiturici  stimolano la sintesi della glucoroniltransferasi epatica, modificando la velocità di escrezione della bilirubina

Interferenza fisica La Vit A, la riboflavina, le carote e altri alimenti contenenti pigmenti gialli che vengono assorbiti nel tratto intestinale  alterano la misura della bilirubina eseguita con metodo diretto I preparati di eparina che contengono sodio bisolfito  riducono il picco di assorbimento del verde di indocianina usato per la prova di cromosecrezione o di diluizione arteriosa

Interferenza chimica È la causa di interferenza più diffusa e più critica Meccanismi di interferenza Interazione del farmaco con l’analita  l’eparina compete con l’albumina con il verde di bromocresolo, colorante impiegato per la misura dell’albumina Interazione con i reagenti L-dopa, metildopa, isoniazide, 6-mercaptopurina, acido ascorbico interferiscono sul dosaggio dell’acido urico Acido ascorbico interferisce sulla determinazione del glucosio Interazione della tecnica di misura  lo spironolattone interferisce nel dosaggio fluorimetrico del cortisolo

Naturalmente non devono essere sospesi i farmaci che sono stati prescritti dal medico per ottenere un effetto metabolico specifico, la modificazione indotta sul dato di laboratorio è attesa dal medico curante e come tale giustamente interpretata. Ad esempio: insulina i diuretici alterano la concentrazione degli elettroliti

Ritmi cronobiologici Alcuni analiti hanno una variazione di concentrazione ritmica: periodi inferiori alle 24 h ( ritmo ultradiano) periodi oltre le 24h (infradiano). Fra i ritmi infradiani si possono ricordare quelli di 7 giorni circa, un mese e un anno. Il ritmo più comune è quello circadiano, che ha come sincronizzatore più comune l’alternanza luce- oscurità, sonno-veglia, assunzione di cibo, ecc. VES, ACTH, cortisolo, gonadotropine, sideremia, cloruremia, calcemia, 5-idrossitriptamina, catecolamine, sodio, potassio e fosfati presentano variazioni cronobiologiche.

Variazione ritmica circadiana VES Nel sangue: ACTH Cortisolo Gonadotropine Sideremia Cloruremia Calcemia 5-idrossitriptamina Nelle urine: Catecolamine Sodio Potassio fosfati

EMOLISI E’ la causa più frequente di inadeguatezza qualitativa del prelievo di sangue. Si calcola che rappresenti la causa del 60% dei campioni non processati. Conseguenza dell’emolisi è il passaggio nel siero o nel plasma dell’emoglobina e delle sostanze contenute nei globuli rossi. L’emolisi diventa visibile quando la concentrazione dell’emoglobina supera i 200-300 mg/L.

EMOLISI

Principali cause di emolisi Emolisi osmotica: presenza di acqua, alcool o altri solventi nell’ago, nella siringa o nelle provette Emolisi meccanica: impiego di aghi da prelievo troppo sottili; eccessiva aspirazione durante il prelievo di sangue o pressione troppo elevata durante l’espulsione del sangue dalla siringa quando non si toglie l’ago; agitazione troppo vigorosa della provetta Emolisi fisica: conservazione prolungata del campione di sangue in condizioni di temperatura non idonee; va evitato il congelamento perché la cristallizzazione dell’acqua endoeritrocitaria provoca rottura delle membrane cellulari e lisi degli eritrociti

a b c Comportamento dei globuli rossi immersi in una soluzione a) isotonica, b) ipertonica e c) ipotonica. a b c il doppio flusso di solvente è equilibrato e il globulo mantiene la sua forma; prevale il flusso verso l'esterno e in globulo raggrinzisce il globulo tende a gonfiarsi: esplode liberando l'emoglobina (la pressione osmotica del sangue è circa 7.8 atm, equivalente a quella di una soluzione di NaCl 9 g/litro o 0.154 M)

Passaggio dell’emoglobina nel siero o nel plasma GLI ERRORI CONSEGUENTI ALL’IMPIEGO DI CAMPIONI EMOLIZZATI SONO LEGATI A: Passaggio dell’emoglobina nel siero o nel plasma Passaggio nel siero o nel plasma di analiti contenuti negli eritrociti in maggiore concentrazione rispetto al siero Concentrazione di alcuni analiti nei globuli rossi e nel plasma (nell’uomo) Analita Globuli rossi Plasma Glucosio (mg/dl) 74.0 90.0 Acido urico (mg/dl) 2.5 4.6 Na+ (mmol/l) 16 140 K+ (mmol/l) 100 4.4 LDH (mU/ml) 58000 360 AST (mU/ml) 500 25 L’emoglobina interferisce in alcune analisi colorimetriche sia per motivi fisici (assorbimento della sostanza nella zona dello spettro a 405 nm e a 550-575 nm), sia per motivi chimici, ad esempio apparente aumento dell’albumina se determinata col metodo al verde di bromocresolo; aumento della bilirubina se misurata spettrofotometricamente, diminuzione della bilirubina se misurata col diazoreattivo Aumento dei livelli sierici o plasmatici di potassio (a seconda delle specie animali), di alcuni enzimi come la lattato deidrogenasi, l’aspartico transaminasi, ecc.

Il potassio ha una concentrazione endoeritrocitaria di circa 100 mmol/l, e una concentrazione nel siero di circa 4-5 mmol/l Arginasi Catalasi Lattatodeidrogenasi Fosfatasi acida Transaminasi

La presenza di emoglogina nel siero può costiture errore: 1) nelle analisi colorimetriche Per motivi chimici: dovuti all’inibizione delle reazioni di diazotazione (es., nella determinazione della bilirubina) o per l’inibizione dell’attività lipasica Per motivi fisici: dovuti all’assorbimento naturale della sostanza nella zona dello spettro intorno a 405 (banda di Soret) e a 550-575 nm 2) per il passaggio nel siero (o plasma) delle sostanze con concentrazione maggiore negli eritociti che nel siero

Raccolta del campione biologico Possono essere oggetto degli esami di laboratorio tutti i campioni biologici (fluidi, tessuti, frammenti bioptici) purchè siano rappresentativi dei sistemi da investigare Il tipo di campione dipende dalle indagini da eseguire: Sangue venoso, siero o plasma Sangue arterioso Sangue dai capillari Urine Feci Fluido cerebrospinale (LCS) Tessuto o cellule Calcoli Aspirato (fluido della pleura, asciti, fluido sinoviale, fluido intestinale…) Liquido amniotico

RACCOLTA DELLE URINE Campione di più semplice raccolta Recipiente pulito ed in alcuni casi sterile Esame completo delle urine: campione della prima minzione mattutina Rapido invio al laboratorio Modalità di raccolta e conservazione: mattutina, 24 h Precauzioni Modalità di raccolta per indagini microbiologiche

I contenitori per la raccolta delle urine Esame batteriologico delle urine: possono contenere sostanze che inibiscono la crescita batterica o acidi che stabilizzano alcuni metaboliti. Esame delle urine delle 24 ore: devono essere sufficientemente grandi per contenere una raccolta completa della urine Per l’esame biochimico delle urine è sufficiente raccogliere le urine di prima mattina in contenitori con tappo a vite

Campioni usati nelle analisi cliniche Il tipo di campione dipende dalle indagini da eseguire, in alcuni casi la scelta è obbligata. Sangue venoso, siero o plasma Sangue arterioso Sangue dai capillari Urine Feci Fluido cerebrospinale (LCS) Tessuto o cellule Calcoli Aspirato (fluido della pleura, asciti, fluido sinoviale, fluido intestinale…) Campioni “speciali” Per alcuni esami può essere richiesto l’uso di specifici fluidi corporei o tessuti. Ci sono protocolli specifici per maneggiare e trasportare questi campioni al laboratorio; sè necessario consultare il laboratorio locale per suggerimenti.

Liquido cefalorachidiano e puntura lombare Il liquor riempe tutti gli spazi liberi dall’encefalo e dal midollo spinale all’interno della dura madre Quantità: Adulto: 160 mL Neonato: 40/60mL Pressione liquorale: varibile da soggetto a soggetto ed è modificata in modo determinante dalla postura Aspetto: limpido e senza tracce di sangue

Puntura lombare Il liquor cerebrospinale viene raccolto con una puntura effettuata a livello della colonna vertebrale lombare Poiché l'estensione del midollo spinale finisce all'inizio della colonna lombare, la puntura non rischia di ferire strutture nervose. Campione: max 12-15 mL nell’adulto, da suddividere in più provette, di cui una sterile per gli esami microbiologici Precauzioni: consegnare sollecitamente il campione al lab.; se necessario, conservare a 37°C, ma solo per un breve periodo di tempo.

Liquido sinoviale è un ultrafiltrato del sangue attraverso la membrana sinoviale È privo di proteine ad alto peso molecolare Indicazioni: indagini di laboratorio mirate ad approfondire e trattare le alterazioni delle articolazioni Quantità: Valori di riferimento nell’adulto: 3/3,5 ml infiammazioni: 25 ml Aspetto: limpido e senza tracce di sangue

Modalità di prelievo: aspirazione in siringa sterile Provette: differenti a seconda del tipo di indagini da eseguire, in particolare: con eparina: per indagini di microbiologia senza anticoagulante: per indagini di chimica clinica ed immunologia con EDTA: per indagini cito-ematologiche Precauzioni: è necessario impedire la naturale tendenza del fluido sinoviale a coagulare, dato l’alto contenuto in mucopolisaccaridi acidi (acido ialuronico e proteine)

Liquidi di versamento delle cavità sierose Le cavità sierose (pleurica, pericardica e peritoneale) contengono un fluido simile al siero per colore e caratteristiche chimico-fisiche, che si forma continuamente per ultrafiltrazione del plasma e viene riassorbito attraverso i capillari delle sierose, in modo che la quantità e la composizione restano costanti.

Versamento pericardico Versamento endocavitario: aumento della quantità del fluido intracavitario a seguito di condizioni patologiche, quali: lesioni infiammatorie, neoplastiche o traumatiche degli organi endocavitari patologia infiammatoria o neoplastica delle sierose stesse Versamento pleurico ascite Versamento pericardico

Prelievo a scopo terapeutico: per evitare la compressione degli organi endocavitarisi effettua lo svuotamento per aspirazione mediante puntura cutanea Prelievo a scopo diagnostico: 50 mL divisi in provette diverse: con EDTA per analisi citologiche con eparina in contenitori sterili per esami microbiologici e colturali in vetro per esami di chimica clinica

Liquido amniotico L'amnios è un annesso embrionale che circonda e protegge l'embrione. Si forma principalmente per secrezione attiva da parte della membrana amniotica, delle vie respiratorie ed urinarie del feto, oltre che ad altri organi fetali. Poiché l'amnios è continuamente ricambiato, il suo riassorbimento avviene per mezzo dell’ apparato respiratorio del feto, per deglutizione o per intermediazione della membrana amniotica stessa. Aspetto: lievemente opalescente e di colore citrino molto tenue L’analisi del liquido amniotico consente di evidenziare: alterazioni cromosomiche (dopo la coltura degli amniociti) alterazioni genetiche (dopo la coltura degli amniociti ed estrazione del DNA) difetti strutturali (es., spina bifida, anencefalia) Anomalie metaboliche ereditarie Stato di maturità polmonare (tramite il rapporto lectina/sfingomielina) Paternità e sesso del nascituro

L’Amniocentesi È il prelievo transaddominale di 20-30 ml di liquido amniotico (con AGO 20-22G). Si esegue a partire dalla 14a settimana di gravidanza: se eseguita prima della XIV settimana aumenta il rischio di deformità fetali, di fallimento della procedura e di aborto (amnios e corion non sono ancora fusi). Comporta un rischio di aborto dell'1%, dipendente dalla manualità dell'operatore Precauzioni: per le analisi citogenetiche o biochimiche è necessario usare provette sterili di materiale plastico per evitare che le cellule aderiscano alle pareti e non siano più recuperabili.

Feci Indagini: Ricerca del sangue occulto Ricerca di parassiti e/o loro uova Presenza di enzimi e/o sostanze parzialmente digerite

La ricerca del sangue occulto indicatore precoce della presenza di polipi o tumore del colon. Caratteristiche: test qualitativo, colorimetrico Modalità di raccolta del campione: il paziente raccoglie con una spatolina una piccola porzione di fesi e le depone su un cartoncino. Precauzioni: Falsi positivi: ogni sorgente di sangue darà un risultato positivo, quindi il sangue proveniente da emorroidi sanguinanti, ragadi anali e il sangue mestruale interferirà con il test. Inoltre, nei giorni che precedono il test: dieta ad alto contunuto di fibre, evitare carni rossi, rape, radicchi e rafano) evitare l’ assunzione di farmaci (acido acetilsalicilico ed antiinfiammatori non steroidei potrebbero provocare piccole erosioni gastriche) Falsi negativi: causati dall’incostante sanguinamento dei polipi, quindi il paziente avrà cura di ripetere la raccolta del campione per tre giorni consecutivi. Inoltre, nei giorni che precedono il test non bisogna assumere Vitamina C, in quanto essa può interferire con la reazione del test, convertendo un risultato positivo in falsamente negativo.

Errori di campionamento In molti casi possono invalidare i risultati! Tecnica di prelievo del sangue Stasi prolungata durante la venopuntura Campione insufficiente Errori nel campionamento a tempo Contenitore sbagliato del campione Sito inappropriato di prelievo Conservazione sbagliata del campione

Trasporto del campione biologico al laboratorio E’ molto importante che i tempi non siano eccessivi perché influenzano la stabilità del materiale e quindi l’accuratezza della misura In generale, dal momento in cui si effettua il prelievo è importante eseguire: immediatamente i test su fattori della coagulazione la centrifugazione entro 1 h l’esame emocromocitometrico entro 7 h La VES non oltre 24 h dal prelievo

Non tutti gli analiti presentano la stessa STABILITA’ in un campione di SANGUE INTERO conservato A TEMPERATURA AMBIENTE Ad esempio: ORMONI  1 settimana Na+, ACIDO URICO, COLESTEROLO, TRIGLICERIDI  3gg AMILASI, TRANSAMINASI  2-3 gg GLUCOSIO, LIPASI  meno di 4h AMMONIO  rapido aumento GLUCOSIO  diminuisce a tutte le temperature, perché viene metabolizzato K+  aumenta a causa della lisi eritrocitaria e piastrinica

Trasporto del campione biologico a distanza I contenitori impiegati per la spedizione devono essere di dimensioni idonee, infrangibili e muniti di tappi a tenuta sicura Durante il trasporto vanno evitate eccessive vibrazioni per i loro effetti dannosi sui fattori della coagulazione e sugli elementi figurati del sangue. Se il campione esige una conservazione a bassa temperatura è indispensabile l’aggiunta di ghiaccio sintetico o secco o azoto liquido nella spedizione, in modo da mantenere il campione alla temperatura prevista per il tempo necessario al trasporto

Ogni campione deve giungere al laboratorio già accuratamente etichettato: indicati dati identificativi del soggetto inchiostro indelebile su etichetta ben adesa al tubo. indicati data e ora del prelievo Il laboratorio può rifiutare i campioni: non etichettati o etichettati in modo improprio danneggiati durante il trasporto non raccolti e conservati correttamente contaminati esternamente

Criteri di non accettabilità del campione biologico Identificazione assente o incompleta Contenitore non idoneo o non integro Prelievo non corretto Quantità insufficiente Rapporto sangue/anticoagulante inadeguato o scorretto Presenza di coaguli (interferenza su emocromo o test coagulativi) Emolisi evidente Conservazione a temperatura non corretta Esposizione a luce solare diretta

Conservazione del materiale biologico Quando il laboratorio non è in grado di eseguire immediatamente tutti gli esami richiesti, il campione biologico deve essere conservato nel modo migliore in modo che non intervengano variazioni nella sua composizione o nelle sue proprietà. La natura delle variazioni che possono alterare la composizione di un campione biologico è riconducibile a: Cause di tipo fisico Cause di tipo chimico-fisico Cause di tipo biochimico o biometabolico

Ruolo e interfaccia tra il laboratorio e la clinica

Tipi di variabilità del dato di laboratorio

Variabili preanalitiche Scorretta identificazione del paziente o del campione biologico Ora del prelievo (variazioni circadiane, test da carico, etc.) Ordine del campionamento (provette sterili per culture, provette senza additivi, provette con anticoagulanti, etc.) Trasporto dei campioni (instabilità di analiti, evaporazione) Presenza di sostanze interferenti nel campione (contaminanti, farmaci) Es. emolisi altera le transaminasi, il potassio (falsi aumenti), l’emoglobina può interferire con il dosaggio della bilirubina- trasporto ritardato del campione-se il campio di sangue si conserva in frigo aumenta il K e se congelato si emolizza Variabili postanalitiche Errata trascrizione dei risultati Refertazione inadeguata o incompleta (note, valori di riferimento, acronimi)

METODO Il Metodo è il fattore principale delle possibili discordanze tra il valore vero e la sua stima.

Caratteristiche dei metodi SENSIBILITA’ ANALITICA Capacità di un metodo di dosare piccole concentrazioni, o piccole variazioni della concentrazione di un composto Direttamente correlate alla precisione del metodo SPECIFICITA’ ANALITICA Capacità di un metodo di misurare selettivamente il composto che interessa. Direttamente correlata all’accuratezza di un metodo PROCEDURE DEL CONTROLLO DI QUALITA’(procedure realizzate nel laboratorio che consentono di garantire l’affidabilità del dato di laboratorio e quindi di fornire informazioni valide ed utili dal punto di vista medico)

Misura della VARIABILITA’ ANALITICA (Procedure del Controllo di Qualità) Imprecisione (errori casuali) Discordanza tra i valori ottenuti da misure replicate dello stesso campione (controllo), si misura in termini di deviazione standard (DS) o di coefficiente di variazione (CV)% CV % = DS . 100 media (CV =Modo di esprimere la DS in valore percentuale) Inaccuratezza (errori sistematici) Discordanza tra la media dei valori ottenuti misurando un campione a concentrazione nota per un analita (X) ed il valore vero (μ) dello stesso μ-X . 100 Limiti di accettabilità<10% μ μ = valore teorico del controllo, x= valore misurato per il controllo; <3 CV anal o < 10%; per gli enzimi può essere più alto

CARATTERISTICHE DI ATTENDIBILITA’ ANALITICA DEI METODI IMPRECISIONE ed INACCURATEZZA sono indipendenti tra di loro VALORE REALE

CONTROLLO DI QUALITA’ INTERNO (intralaboratorio) Carta di Shewhart - Levey - Jennings

CONTROLLO DI QUALITA’ INTERNO (intralaboratorio) Esempi di metodo “fuori controllo”

Tipi di variabilità del dato di laboratorio

VARIABILITA’ INTRAINDIVIDUALE E INTERINDIVIDUALE INTRA: è legata alle oscillazioni omeostatiche che garantiscono la composizione costante dei liquidi biologici. INTER: ogni individuo ritenuto sano ha caratteristiche distintive peculiari che lo diversificano dal suo simile all’interno della stessa popolazione

INTERPRETAZIONE DI UN RISULTATO ANALITICO Il risultato è normale? Calcolo sulla base dei valori di riferimento Vi è una variazione significativa? Se il test è stato già eseguito in precedenza Calcolo della differenza critica

POPOLAZIONE DI RIFERIMENTO popolazione composta di individui con caratteristiche fisiologiche omogenee con quelle dell’individuo in esame.

VALORI DI RIFERIMENTO Come si sceglie una popolazione di riferimento? Come si elaborano gli intervalli di riferimento?

VALORI DI RIFERIMENTO Come si sceglie una popolazione di riferimento? Criteri di partizione: Numero di soggetti sufficientemente elevato In buono stato di salute Età, sesso Fattori ambientali (dieta, quota altimetrica) Altri fattori biologici (variazioni cronobiologiche)

Come si sceglie una popolazione di riferimento? VALORI DI RIFERIMENTO Come si sceglie una popolazione di riferimento? Criteri di esclusione: Malattie sistemiche e disordini fisiopatologici. Assunzione di agenti farmacologicamente attivi: terapia farmacologica contraccezione orale Tossicodipendenza alcolismo e tabagismo Gravidanza

COME SI ELABORANO GLI INTERVALLI DI RIFERIMENTO ? Disegnare un grafico di frequenza Ispezionare il grafico (asimmetria, curtosi, outlier, polimodalità) Trattamento statistico per riconoscere il tipo di distribuzione (normale-parametrica o non normale-non parametrica) Eliminare i dati aberranti Determinazione dell’intervallo di riferimento Grafico di frequenza: sull’asse X la frequenza di ogni valore osservato sull’asse Y i valori osservati. Asimmetria: quando le code hanno grandezza diversa. Se la coda destra è più lunga si parla di asimmetria positiva, se sinistra negativa. Moda, mediana e media coincidono solo se la distribuzione è simmetrica. La curtosi si riferisce all’acutezza del picco dell’istogramma, se la distribuzione è stretta e alta si parla di leptocurtosi, se è larga e bassa di platicurtosi. La distribuzione gaussiana ha un solo picco, se ne ha più di uno si definisce bi- o plurimodale. Se la distribuzione è plurimodale o eccessivamente asimmetrica, bisogna rivalutare i criteri iniziali di esclusione e di partizione perché nel gruppo di riferimento potrebbero esserci gruppi troppo eterogenei. I valori aberranti vengono in genere evidenziati dalla semplice ispezione visiva del grafico e in genere sono valori isolati che vanno fuori dalle 3-4 DS. Però non vanno eliminati automaticamente, ma bisogerebbe ripercorrerne la storia, cercando di capire i fattori che l’hanno potuto generare.

VALORI DI RIFERIMENTO Distribuzione gaussiana Moda Mediana Media ±2DS

DISTRIBUZIONE NON PARAMETRICA mediana

DETERMINAZIONE NON PARAMETRICA DEGLI INTERVALLI DI RIFERIMENTO Il limite inferiore dell’intervallo corrisponde al valore del risultato al 2.5° percentile e il limite superiore al valore del risultato al 97.5° percentile L’intervallo così definito comprende il 95% dei risultati della popolazione di riferimento. mediana percentili 2,5°percentile 97,5°percentile

Caso 3 Un bambino di 4 anni con dolore addominale, si presenta al pronto soccorso dopo un incidente. I risultati ottenuti dal laboratorio sono i seguenti: Bilirubina 14 umol/L (<20) ALT 14 U/L (<42) ALP 326 U/L (<250) Albumina 40 g/L (35-45) GGT 14 U/L (<55) Calcio 2.34 mmol/L (2.15-2.55) Discussione Sul foglio di richiesta non era stata riportata l’età del paziente. L’apparecchio automaticamente ha pertanto riportato i valori di riferimento per gli adulti. La fosfatasi alcalina è un enzima i cui valori sono fisiologicamente più elevati nell’età pediatrica. Il risultato pertanto è da considerarsi normale.

Caso 4 Un maschio nigeriano di 54 anni si presenta al pronto soccorso con dolore toracico. Il suo ECG risulta normale. Dopo 6 ore dal dolore viene fatto un prelievo e si ottengono i seguenti risultati: CK 498 U/L (<250) Troponina T 0.01 ng/L (<0.02) Discussione Il paziente non aveva avuto un infarto. I valori di riferimento si riferiscono alla popolazione Caucasica. I valori normali negli Africani possono essere 2-3 volte più alti.