Prevenzione Biologia Molecolare Diagnosi Terapia a a a a a a

Biologia I padri fondatori: G.Mendel (1822-1884) Nel 1865 pubblica i risultati sulla riproduzione dei piselli Enuncia le leggi fondamentali dell’eredità dei caratteri Le leggi saranno ignorate fino alla loro riscoperta nel 1900

I fondatori della genetica molecolare F. Crick (1916) & J. D I fondatori della genetica molecolare F.Crick (1916) & J.D.Watson (1928) Nel 1953 pubblicano un articolo di una pagina su Nature Nell’articolo propongono la struttura a doppia elica del DNA Nel 1962 condividono il premio Nobel con M.Wilkins

Applicazioni diagnostiche e forensi La PCR ha rivoluzionato il campo della diagnostica molecolare, fornendo nuovi e potenti strumenti per effettuare diagnosi precoci di alterazioni genetiche anche a livello di singolo nucleotide Caratteristiche rilevanti: Estrema sensibilità possibilità di funzionare a partire da campioni non trattati Applicazioni innovative: diagnosi prenatale di malattie genetiche analisi precoce di marker tumorali follow up clinici conseguenti ad asportazioni chirurgiche di tumorali campo forense e medico legale

post-natale Diagnosi pre-natale

(reazione a catena della polimerasi) Digestione enzimatica Diagnosi di portatore Estrazione del DNA PCR (reazione a catena della polimerasi) Digestione enzimatica Ibridazione con sonda Elettroforesi Ibridazione con sonda Elettroforesi

DIAGNOSI PRENATALE Pre-fecondazione biopsia del corpo polare FISH del cromosoma X Pre-impianto biopsia del blastomero Post-impianto Analisi delle cellule fetali nel sangue materno Villocentesi Amniocentesi

(reazione a catena della polimerasi) Digestione enzimatica Diagnosi prenatale post-impianto Amniocentesi Prelievo di sangue periferico Villocentesi Coltura degli amniociti Pulizia dei villi coriali Estrazione del DNA PCR (reazione a catena della polimerasi) Digestione enzimatica Ibridazione con sonda Elettroforesi Ibridazione con sonda Elettroforesi

(reazione a catena della polimerasi) Elettroforesi capillare Diagnosi prenatale pre-impianto Lisi cellulare PCR (reazione a catena della polimerasi) Elettroforesi capillare

Diagnosi prenatale post-fecondazione Biopsia del blastomero analisi molecolare coltura  trasferimento

Evoluzione del concetto di qualità Fase pre-analitica Fase analitica Fase post-analitica Controllo di qualità

Evoluzione del concetto di qualità Fase pre-analitica Fase analitica Fase post-analitica Controllo di qualità

1 2 3 4 Schema suggerito per l’organizzazione e l’equipaggiamento di un laboratorio di biologia molecolare clinica Stoccaggio e Preparazione reattivi 1 Assemblaggio della Mix per PCR 3 Preparazione del campione 2 Analisi dei prodotti di PCR Elettroforesi Ibridazione Sequenziamento 4

1 2 3 4 Schema suggerito per l’organizzazione e l’equipaggiamento di un laboratorio di biologia molecolare clinica Stoccaggio e Preparazione reattivi 1 Operazioni Preparazione di soluzioni Stock Aliquotazione di soluzioni Equipaggiamento Camici, guanti, copricapo Frigo, freezer, bilance, pHmetro Banchi di lavoro Macchina del ghiaccio, registro Assemblaggio della Mix per PCR 3 Preparazione del campione 2 Operazioni Estrazione degli acidi nucleici Conservazione degli acidi nucleici Dispensazione degli acidi nucleici nelle provette Sintesi del cDNA per l’analisi dell’RNA Equipaggiamento Pipettatori autoclavabili Banchi con cappa e lampada UV Bagnomaria a ultrasuoni, frigo, freezer, centrifuga (refrigerata) Registro Operazioni Relazione di amplificazione Equipaggiamento Cappa, lampada UV, thermocycler, centrifuga, bagnomaria, pipettatore Registro Analisi dei prodotti di PCR Elettroforesi Ibridazione Sequenziamento 4

PROGETTAZIONE DEL LABORATORIODI BIOLOGIA MOLECOLARE CLINICA Personale adeguatamente formato Strumentazioni dedicate Organizzazione degli spazi Per eliminare il problema delle contaminazioni del campione o dei reagenti:  da parte degli acidi nucleici naturali (stampo)  da parte degli acidi nucleici naturali che originano dal processo di amplificazione (prodotti di amplificazione)

Sensibilità dell’analisi L’alta sensibilità delle tecniche utilizzate in un laboratorio di Biologia Molecolare Clinica, è influenzata da una serie di variabili: Variabili Preanalitiche Variabili Analitiche

1 Schema suggerito per l’organizzazione e l’equipaggiamento di un laboratorio di biologia molecolare clinica Stoccaggio e Preparazione reattivi 1 Operazioni Preparazione di soluzioni madri Preparazione di aliquote di soluzioni Equipaggiamento Camici, guanti, copricapo Frigo, freezer, bilance, pH-metro Banchi di lavoro Macchina del ghiaccio, registro

Regolamentazione della Area di Conservazione dei reagenti Precauzioni da adottare nell’utilizzo di quest’area: Utilizzare solo la strumentazione e i reagenti conservati nell’area Effettuare una accurata pulizia del banco/cappa di lavoro prima e dopo l’uso Autoclavare periodicamente le pipette Esporre il banco/cappa di lavoro ad illuminazione UV O.N. al termine del lavoro di tutti gli operatori

2 Schema suggerito per l’organizzazione e l’equipaggiamento di un laboratorio di biologia molecolare clinica Preparazione del campione 2 Operazioni Estrazione degli acidi nucleici (DNA,RNA) Dispensazione degli acidi nucleici nelle provette Conservazione degli acidi nucleici Equipaggiamento Pipettatori autoclavabili Banchi con cappa e lampada UV Bagnomaria a ultrasuoni, frigo, freezer, centrifuga (refrigerata) Registro

Estrazione di acidi nucleici L’estrazione di acidi nucleici è il primo passo nelle applicazioni di biologia molecolare Esiste una pletora di metodi, tra i quali la scelta si effettua in base a: Tipo di acido nucleico (ssDNA, dsDNA, RNA totale, mRNA, etc.) Fonte (tessuti animali o vegetali, eucarioti, procarioti, virus) Materiale di partenza (organo intero, tessuto, coltura cellulare, sangue, etc.) Risultato desiderato (quantità, purezza, tempo richiesto) Applicazione prevista post-estrazione (PCR, marcatura, restrizione enzimatica, southern blotting, RT-PCR)

Estrazione di acidi nucleici 1. Lavorare con DNA/RNA B. Purificazione Per rimuovere le proteine da soluzioni di acido nucleico: 1. Trattare con un enzima proteolitico es. Pronase, Proteinase K 2. Estrarre con fenolo/cloroformio. Il metodo più comune prevede prima fenolo o fenolo/cloroformio e poi cloroformio. Il fenolo denatura le proteine e l’estrazione finale con cloroformio rimuove le tracce di fenolo

Sangue intero (EDTA/citrato) ESTRAZIONE DNA Metodo di riferimento Sangue intero (EDTA/citrato)

ESTRAZIONE DNA Sangue Fase della lisi delle cellule Assorbimento Fase di separazione Del DNA Lavaggio Fase di eluizione Del DNA Proteine Verifica estrazione del DNA (gel agarosio) S DNA

Sangue intero (EDTA/citrato) Guanidina Tiocianato ESTRAZIONE RNA Metodo di riferimento

Estrazione di acidi nucleici 1. Lavorare con DNA/RNA C. Quantificazione 1. Spettrofotometrica. Per soluzioni pure di DNA, il metodo più semplice è leggere l’assorbanza a 260 nm. 1 OD = 50 mg/ml di DNA bicatenario 40 mg/ml di RNA o DNA monocatenario Il rapporto di assorbanza 260/280 dà una stima della purezza della soluzione: soluzioni pure di DNA ed RNA hanno un rapporto pari a 1,8 e 2,0 rispettivamente. 2. Fluorescenza con bromuro di etidio. Diluizioni di una sol. di DNA ignota in presenza di 2 mg/ml di bromuro di etidio sono confrontate con diluizioni di una soluzione standard “spottate” su agarosio.

Variabili nella fase pre-analitica Campionamento: Tipologia del campione biologico di partenza (sangue intero, midollo, sangue secco, buffy-coat, saliva, acqua di lavaggio buccale, sezioni tissutali, tessuti fissati, etc.) Vetreria Invio dei campioni al laboratorio Conservazione dei campioni Scopo: ottenere un campione quantitativamente e qualitativamente utile. Estrazione degli acidi nucleici: Interferenze connesse alla preparazione del DNA (inibitori: eme, eparina, fenolo, cloroformio, etc.) Interferenze connesse alla conservazione del DNA Interferenze connesse alla preparazione dell’RNA (inibitori:eme, eparina, RNasi) Interferenze connesse alla conservazione dell’RNA

Controlli suggeriti nella fase pre-analitica Standardizzazione delle procedure Controllo di qualità interno nella preparazione del DNA Elettroforesi su gel di agarosio (degradazione del DNA) Digestione del DNA con endonucleasi di restrizione e separazione elettroforetica (presenza di inibitori) Lettura spettroforetica a 260 e 280 nm (presenza di residui proteici o fenolo) Controllo di qualità interno nella preparazione dell’RNA totale Elettroforesi su gel di agarosio in condizioni denaturanti (degradazione RNA e contaminazione da DNA) Misura densitometrica dell’asimmetria dei picchi (qualità e integrità dell’RNA)

Esempi di sequenze riconosciute da alcuni enzimi di restrizione