Elettroforesi su gel di agarosio è definita come la migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un campo elettrico viene utilizzata per separare, identificare e purificare frammenti di DNA

L’apparecchiatura per l’elettroforesi è composta da un ALIMENTATORE che fornisce una corrente elettrica continua costante e da una CAMERA ELETTROFORETICA che contiene i due elettrodi, positivo (ANODO) e negativo (CATODO). Nella camera elettroforetica viene posto il GEL DI AGAROSIO. La camera elettroforetica viene riempita con la soluzione tampone di corsa (TBE, Tris- Borato EDTA) che permette la conduzione della corrente elettrica.

struttura del gel di agarosio unità ripetitiva di agarosio L’agarosio è un polisaccaride purificato dalle alghe rosse della specie Agar agar. L’agarosio è solubile ad alta temperatura in soluzione acquosa; quando la soluzione si raffredda si forma una matrice (gel) a causa della formazione di legami idrogeno crociati tra le catene polimeriche dell’agarosio. Il GEL DI AGAROSIO è il supporto sul quale avviene l’elettroforesi, e funge anche da setaccio molecolare per separare le molecole di DNA in base alle dimensioni struttura del gel di agarosio

Percentuale di agarosio nel gel (% w/v) Range di efficiente separazione di molecole di DNA lineare (kb) 0.3 5 - 60 0.6 1 – 20 0.7 0.8 – 10 0.9 0.5 – 7 1.2 0.4 – 6 1.5 0.2 – 3 2.0 0.1 – 2 La percentuale di agarosio nel gel determina la grandezza delle “maglie” e la capacità di risoluzione del gel stesso. Gel a basse concentrazioni di agarosio vengono usati per elettroforesi di molecole relativamente grandi di DNA, mentre gel ad alte concentrazioni di agarosio permettono un’efficiente separazione di molecole di DNA piccole.

Il DNA è carico negativamente a causa della presenza dei gruppi fosfato, quindi in presenza di un campo elettrico migrerà verso il polo positivo (ANODO) CATODO ANODO

DNA plasmidico DNA plasmidico linearizzato dsDNA di 500 bp dsDNA di 800 bp La velocità di migrazione delle particelle durante l’elettroforesi dipende da: CARICA il DNA è carico negativamente, quindi migrerà verso l’elettrodo positivo DIMENSIONE la velocità di migrazione di molecole lineari di dsDNA è inversamente proporzionale al log10 del numero di paia di basi FORMA molecole di DNA lineare migrano più velocemente rispetto a molecole di DNA circolari (plasmidi) m = q f q carica elettrica della particella f coefficiente frizionale m mobilità elettroforetica

ATTENZIONE: mutageno e cancerogeno! Le molecole di Bromuro di Etidio si intercalano tra le basi del DNA a doppio filamento ed emettono luce fluorescente (arancio-rossa) quando irradiate con luce ultravioletta il Bromuro di Etidio viene aggiunto direttamente nella preparazione del gel di agarosio in modo da permettere la visualizzazione del DNA migrato durante l’elettroforesi ATTENZIONE: mutageno e cancerogeno!

I campioni di DNA vengono caricati nei pozzetti del gel dopo essere stati mescolati con il LOADING BUFFER 6x (buffer di caricamento), che: contiene glicerolo, che aumenta la densità del campione evitando che fuoriesca dal pozzetto durante il caricamento; contiene sostanze coloranti (Blu di bromofenolo e Xilen-cianolo) che permettono di seguire la corsa elettroforetica. In un pozzetto del gel viene caricato un marcatore di peso molecolare (marker), cioè del DNA di dimensioni note con cui confrontare i propri campioni 900 bp 800 bp 180 bp 500 bp 320 bp 750 bp 80 bp 150 bp Marker A B C

Preparazione di un gel di agarosio al 2% ed elettroforesi di DNA   Preparare il vassoio per colare il gel nella “slitta” e inserire i “pettini” necessari per la formazione dei pozzetti di caricamento Pesare 2 grammi di agarosio e metterli in una beuta da 250 ml Aggiungere nella beuta 100 ml di TBE 0.5x (diluire dalla soluzione stock di TBE 5x), mescolare e portare ad ebollizione nel microonde fino alla completa solubilizzazione dell’agarosio Aggiungere alla soluzione di agarosio 5 ml di Bromuro di Etidio a concentrazione 10 mg /ml (concentrazione finale 0.5 mg/ml) e mescolare Lasciar raffreddare la soluzione di agarosio e versarla nel vassoio contenente il pettine prima che solidifichi; nel frattempo preparare i campioni da caricare: 15 ml di reazione di PCR + 3 ml di loading buffer 6x marker di peso molecolare Ad avvenuta solidificazione del gel porre il vassoio con il gel nella camera elettroforetica e riempirla con il TBE 0.5x fino a ricoprire completamente il gel; rimuovere delicatamente il pettine Caricare i campioni nel gel, collegare la camera elettroforetica agli elettrodi tenendo conto che gli acidi nucleici migrano verso il polo positivo (anodo) ed effettuare la corsa elettroforetica a voltaggio costante (100 V) Interrompere la corsa elettroforetica prima che il blu di bromofenolo fuoriesca dal gel Analizzare la corsa elettroforetica ponendo il gel sopra un transilluminatore a luce ultravioletta IMPORTANTE! Il Bromuro di Etidio è un agente mutageno e cancerogeno: dall’aggiunta di Bromuro di Etidio in poi indossare sempre i guanti