Organizzazione delle unità di ripetizione dei geni per gli istoni in diverse specie
Tutti i genomi contengono copie multiple dei geni per l’rRNA e per i tRNA
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
I PRECURSORI DEGLI rRNA SONO PIU' LUNGHI DELLA SOMMA DEI DUE rRNA MATURI
I precursori degli rRNA subiscono maturazione
I geni per gli rRNA sono ripetuti in tandem nei genomi eucariotici ETS 18S ITS 28S NTS RNA RNA DNA DNA gene promoter 60/81 bp repeats spacer other repetitive elements DNA
Amplificazione DNA Clonaggio PCR
Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni Minicromosomi artificiali
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 sito di restrizione Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità
Uso degli enzimi di restrizione Clonaggio Mappa di restrizione Polimorfismi di restrizione (RFLP)
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Elementi di un vettore plasmidico Origine di replicazione Marcatore di selezione Sito di restrizione unico
Vettori plasmidici
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
Preparazione del DNA da clonare Digestione clone già esistente DNA specifico PCR frammentato con enzimi di restriz. Frammento di DNA genomico che può contenere regioni trascritte o non trascritte frammentazione meccanica Collezione DNA (banca, genoteca) cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dell’mRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Collezioni di DNA clonato (banca cDNA, genoteca) Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 RNA PREPARAZIONE del cDNA DNA Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
Unione, mediante ligasi, di estremità coesive create da un enzima di restrizione GAATTC CTTAAG VETTORE GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC EcoRI G CTTAA AATTC INSERTO GAATTC CTTAAG DNA ligasi
Reazione di ligasi strategie controlli
Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare mediante ligasi di estremità coesive VETTORE GAATTC CTTAAG AATTC G G CTTAA EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI GAATTC CTTAAG INSERTO
Clonaggio con singola digestione trattamento del vettore con fosfatasi pAATTC G AATTC G G CTTAAp G CTTAA fosfatasi GpAATTC CTTAA G G AATTC CTTAApG DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI GAATTC CTTAAG
Clonaggio con doppia digestione EcoRI HindIII GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA AGCTT A G CTTAA GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
Introduzione del DNA nella cellula ospite Trasformazione: CaCl2 Elettroporazione In E.coli Impacchettamento e infezione fagica Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato Liposomi In cellule di Elettroporazione eucarioti superiori Microiniezione DNA gun
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
Vettori plasmidici
Strategie di selezione nel clonaggio resistenza AMPICILLINA AMPICILLINA
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti
1200 bp SacI EcoRI
Isolamento acidi nucleici lisi cellulare deproteinizzazione concentrazione
Analisi acidi nucleici Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)
1 OD260=50g/ml Spettro di assorbimento del DNA Assorbanza (OD) 220 240 260 280 300 320 0.5 1.0 1.5 lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0
Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide
Elettroforesi su gel di agarosio
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi. Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.
http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=lgmq_HsuZIU http://www.youtube.com/watch?v=6mQGNDnOyH8
Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi
Visualizzazione del DNA
Marcatori di peso molecolare HindIII
Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting) Southern (blot) Northern (blot) Western (blot)
Agarosio o acrilammide BLOTTING (TRASFERIMENTO) Molecole trasferite Sonda Gel Southern DNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide Northern RNA Western Proteine Anticorpi Acrilammide
Metodi di trasferimento Capillare Elettroblot
Assemblaggio del blot capillare vaschetta carta 3MM carta 3MM } membrana nylon gel supporto tampone
Fattori che influenzano l’ibridazione Temperatura Forza ionica pH
Esempio di Southern blot genomico
Analisi di espressione (mRNA)