Genetica Forense 6 CFU Laurea in Scienze biologiche Sapienza Università di Roma III anno I semestre Docente: Fulvio Cruciani fulvio.cruciani@uniroma1.it Edificio genetica, stanza 3-09 (2°piano) Telefono : 06 49912826 / 2924 Per altre informazioni sull’insegnamento: https://elearning2.uniroma1.it/ (iscrivetevi su elearning per ricevere comunicazioni dal docente)
Genetica Forense Programma AA 2019-2020 Breve storia della genetica forense: dal sistema AB0 ai genomi completi. La variabilità genetica umana e la sua utilizzazione come strumento d'indagine forense. La genetica delle popolazioni nelle inferenze genetico-forensi. Raccolta, conservazione e determinazione del tipo cellulare e/o tissutale dei reperti biologici. Estrazione differenziale, quantificazione e determinazione del sesso genetico del DNA dei reperti. Metodi per la tipizzazione di marcatori polimorfici in ambito forense. Problematiche relative alla natura del campione biologico: DNA fortemente degradato e/o in tracce minime; determinazione dei genotipi in campioni misti. Problematiche concernenti l’interpretazione del profilo di DNA: stuttering, microvarianti e alleli “off-ladder” nei microsatelliti, alleli nulli, drop-out e drop-in allelico. Utilizzazione dei sistemi a ereditarietà uniparentale (cromosoma Y e mtDNA) in ambito forense. La peculiarità dei polimorfismi del cromosoma X come strumento d'indagine. Elementi di calcolo delle probabilità. Likelihood ratio e statistica Bayesiana. Probabilità d'identità, probabilità di match casuale, potere di esclusione e indici di variabilità genetica. Test di parentela e paternità. Indice di paternità. Inferenza sull’origine geografica, aspetto fenotipico ed età attraverso l’analisi del DNA. Identificazione nelle indagini criminali; identificazione delle vittime dei disastri di massa; indagini sulle persone scomparse; the "innocence project" La ricerca scientifica in ambito genetico-forense. Applicazioni del next generation sequencing nelle investigazioni forensi. La genetica forense animale L'importanza dei database di profili genetici e di frequenze alleliche ed aplotipiche. La genetica forense nel dibattimento processuale In giallo: Lezioni tenute dal Maggiore Giuseppe Iacovacci (Banca Dati Nazionale del DNA) In verde: Lezioni tenute dalla Dr.ssa Luisa Garofalo (Istituto zooprofilattico Sperimentale del Lazio e Toscana) In bianco: Lezioni tenute dal titolare del corso
Genetica Forense Testi consigliati Testi consigliati in italiano Per approfondimenti
genetica delle popolazioni Premessa Nozioni di base genetica formale e genetica delle popolazioni
Ricordiamo alcuni termini... Gene (alcune possibili definizioni): fattore che determina un carattere la cui ereditarietà segue le leggi di Mendel (definizione mendeliana) oppure unità funzionale del DNA (definizione funzionale) Locus (plurale loci) regione di un cromosoma che identifica in modo preciso un gene o una sequenza qualsiasi di DNA Alleli forme alternative di un gene (più in generale, forme alternative di un qualsiasi locus) Genotipo è dato dall’insieme degli alleli ad uno o più loci (due alleli per ciascun locus per organismi diploidi) Fenotipo (o carattere o tratto) caratteristica osservabile (a qualsiasi livello) di un organismo Omozigosi, eterozigosi, emizigosi
Il genoma umano
La variabilità genetica (V.G.) V.G. somatica V.G. gametica intra-individuo V.G. gametica intra-popolazione (polimorfismo) V.G. gametica inter-popolazione V.G. gametica inter-specie (filogenetica)
Variabilità genetica INTRA-SPECIE (intra- e inter-popolazione)
Variabilità genetica INTER-SPECIE
Variabilità genetica a livello molecolare
Descrivere la variabilità genetica di una popolazione Nella genetica, una popolazione è perfettamente rappresentata attraverso le frequenze dei suoi genotipi. Da questi, è possibile calcolare le frequenze alleliche e diversi indici «sintetici» di variabilità (ad esempio l’eterozigosità). Si noti tuttavia che popolazioni con identiche frequenze alleliche potrebbero avere differenti genotipi (ma non viceversa).
La frequenza allelica può essere calcolata a partire dalle frequenze Un allele è una variazione ad un locus (codificante o meno), ad esempio una sostituzione nucleotidica C-T: Allele C: CCGCTACGTACGGCGATCGATGGCGGCCACGCTCGCGATCGCTACGC Allele T: CCGCTACGTACGGCGATCGATGGCGGCTACGCTCGCGATCGCTACGC La frequenza allelica può essere calcolata a partire dalle frequenze (assolute o relative) dei genotipi nella popolazione. Es. Popolazione composta da 20 omozigoti CC (frequenza relativa = 20/100 = 0,20) 45 eterozigoti CT (frequenza relativa = 45/100 = 0,45) 35 omozigoti TT (frequenza relativa = 35/100 = 0,35) (metodo 1) Frequenze alleliche partendo dalle frequenze genotipiche assolute (anche detto metodo della conta degli alleli) Frequenza allele C = (20 × 2 + 45)/ (2 × 100) = 0.425 Frequenza allele T = (35 × 2 + 45)/ (2 × 100) = 0.575 (metodo 2) Frequenze alleliche partendo dalle frequenze genotipiche relative: Frequenza allele C = 0,2 + ½ × 0,45 = 0.425 Frequenza allele T = 0,35 + ½ × 0,45 = 0.575
𝑒.𝑠. =𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟𝑒 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 𝑝 𝑖 =± 𝑝 𝑖 (1− 𝑝 𝑖 ) 2𝑛 STIMA DI FREQUENZE ALLELICHE Se stiamo analizzando (come quasi sempre accade) un campione di una popolazione, quella ottenuta è una stima delle frequenze alleliche della popolazione. Questa stima avrà un proprio errore che può essere calcolato come: 𝑒.𝑠. =𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟𝑒 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 𝑝 𝑖 =± 𝑝 𝑖 (1− 𝑝 𝑖 ) 2𝑛 Nell’esempio: ± 0,575×0,425 2×100 = ±0,035 Dove pi rappresenta uno qualsiasi degli i alleli al locus considerato (2 alleli nell’esempio precedente, per i quali l’errore sarà uguale) ed n è la dimensione del campione di individui (100 nell’esempio). L’intervallo 𝑝 𝑖 ± 1.96 𝑒.𝑠. ℎ𝑎 𝑢𝑛𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑏𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡à 𝑑𝑒𝑙 95% 𝑑𝑖 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑟𝑒𝑛𝑑𝑒𝑟𝑒 𝑙𝑎 vera 𝑓𝑟𝑒𝑞𝑢𝑒𝑛𝑧𝑎 𝑎𝑙𝑙𝑒𝑙𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙𝑙𝑎 𝑝𝑜𝑝𝑜𝑙𝑎𝑧𝑖𝑜𝑛𝑒
Probabilità che si verifichi un evento “A” = Pr(A) Probabilità di un evento è la frequenza relativa con cui l’evento si verifica in una lunga serie di prove ripetute sotto condizioni simili Probabilità che si verifichi un evento “A” = Pr(A) Probabilità che si verifichi un evento “B” = Pr(B) La probabilità che si verifichino l’uno o l’altro di due eventi incompatibili (due eventi si dicono incompatibili se il verificarsi dell’uno esclude il verificarsi dell’altro) Pr(A o B) = Pr(A U B) = Pr(A) + Pr(B) (Principio della somma) Esempio: probabilità che tirando un dado esca un 6 oppure un 5 Esempio sbagliato: probabilità che estraendo una carta esca un cuori oppure un asso La probabilità che si verifichino sia l’uno che l’altro di due eventi indipendenti (due eventi si dicono indipendenti se il verificarsi dell’uno non influenza la probabilità di verificarsi dell’altro) Pr(A e B) = Pr(A ∩ B) = Pr(A) × Pr(B) (Principio del prodotto) Esempio: Probabilità che tirando due volte un dado esca prima un 6 E dopo un 5 Esempio sbagliato: probabilità che un individuo italiano a caso sia biondo E con gli occhi azzurri…
Parte 1 Introduzione alla Genetica forense
La genetica nelle scienze forensi La genetica forense è una delle molteplici discipline delle scienze forensi e può essere definita come lo studio della variabilità genetica finalizzato alla risoluzione di controversie legali in ambito sia civile che penale L’importanza della genetica come strumento d’indagine legale si è notevolmente accresciuta negli ultimi anni, grazie ai progressi sulla conoscenza dei marcatori genetici polimorfici ed all’evoluzione di strumenti sempre più sofisticati per analizzarli
La genetica come «strumento» d’indagine in ambito forense e investigativo Identificare individui che abbiano commesso dei crimini Risolvere casi di paternità incerta Predire la popolazione di origine di un DNA (es. Africano, Asiatico ecc.) Ottenere informazioni fenotipiche su un soggetto (es. colore occhi) Identificare e «ricostruire» cadaveri la cui identità sia ignota (vittime di catastrofi naturali, disastri aerei, guerre, genocidi) Investigazioni su persone scomparse Non-human forensic DNA testing: DNA profiling in animali domestici comuni Tracciare la provenienza di sostanze illegali a fini investigativi Identificare DNA appartenente a specie protette (es. mistificazioni alimentari)
Il fenomeno biologico sul quale si basa la genetica forense: DIVERSITA’ GENETICA
La genetica forense si basa sulla presenza di diversità genetica DIVERSITA’ GENETICA: A QUALE LIVELLO? Diversità genetica tra individui Diversità genetica tra popolazioni Diversità genetica tra specie Applicazione in Ambito forense Nella maggior parte delle applicazioni la genetica forense sfrutta la diversità genetica tra individui (variabilità intra-popolazione). In alcuni casi sfrutta «direttamente» la variabilità genetica tra popolazioni (della quale va sempre tenuto conto!). In un minor numero di casi sfrutta la variabilità genetica tra specie.
La genetica forense si basa sulla presenza di diversità genetica DIVERSITA’ GENETICA: A QUALE LIVELLO? Diversità genetica tra individui Diversità genetica tra popolazioni Diversità genetica tra specie Applicazione in ambito forense Le basi teoriche della genetica forense vanno ricercate nella genetica mendeliana e nella genetica delle popolazioni
La genetica forense si basa sulla presenza di diversità genetica DIVERSITA’ GENETICA: IN QUALE PORZIONE DEL GENOMA? Autosomi Cromosoma Y DNA mitocondriale Cromosoma X Rilevanza in Ambito forense I marcatori più utilizzati in ambito forense sono localizzati sugli autosomi
La genetica forense si basa sulla presenza di diversità genetica DIVERSITA’ GENETICA: CHE TIPO DI VARIAZIONE? Microsatelliti (short tandem repeats, STRs) Sostituzioni nucleotidiche (~ SNPs) Minisatelliti (~ VNTR) Inserzione/delezione di basi (indels) Presenza assenza di elementi trasponibili Copy number variants (CNVs) Polimorfismi «citogenetici» Rilevanza in ambito forense I marcatori più utilizzati in ambito forense sono i microsatelliti
Marcatori polimorfici Marcatori polimorfici Sospettato individuato Crimine Trasferimento del materiale biologico May match another (K’) Campione “Q” (Question) Reference campione “K” (Known) Ricerca in database Steps coinvolti Steps coinvolti Raccolta Raccolta Conservazione Esclusione (no match) Conservazione Serology Caratterizzazione Q ≠ K Estrazione Estrazione Q K Confronto dei profili Biology Quantificaz. Quantificaz. Controllo di qualità Amplificaz. Amplificaz. Q = K Marcatori polimorfici Marcatori polimorfici Compatibilità (match) Figure 1.1 Steps involved in the Q-K comparison during forensic DNA testing. Da Butler Separazione/detection Separazione/ Detection Technology Report (con peso statistico) Interpretazione dei dati Interpretaz.ne dei dati Interpretazione statistica Genetics Corte Profilo depositato in database Profilo depositato in database
Esempio di Lab Report relativo ad un indagine sul DNA estratto da 2 reperti (Q1 e Q2) e da due indagati (K1 e K2) Tratto da Butler JM «Fundamentals of forensic DNA typing» 2010.
Storia della genetica forense Parte 2 Storia della genetica forense
Breve storia della genetica forense Il primo sistema polimorfico utilizzato in ambito forense: Sistema di gruppo sanguigno ABO (scoperto nel 1900 da Landsteiner) Utilizzato per la prima volta in un processo nel 1915 in Italia (Lattes) e successivamente utilizzato in casi di identificazione e paternità incerta anche in altri paesi europei ed in US Caratteristiche : 3 alleli (IA = IB > i) domin./codominanza 4 fenotipi (gruppi sang. A, B, AB, 0) Rapidità di esecuzione Possibilità di esclusione Limitato potere di discriminazione -------------------------------------------------------------------------------------- Il sistema AB0 è un sistema di gruppo sanguigno determinato geneticamente da un gene con tre alleli, uno recessivo (allele i) che determina in omozigosi il fenotipo 0, e due codominanti (alleli IA e IB) che codificano per due diverse galattosiltrasferasi in grado di aggiungere al fucosio terminale una molecola di N-acetilgattosamina (antigene A) oppure un galattosio (antigene B). Gli omozigoti per l’allele recessivo non codificano per un enzima funzionale e quindi l’ultimo monosaccaride rimane il fucosio Successivamente affiancato da altri sistemi di gruppo sanguigno: MN (1927), Rh (1937) fino a circa 50 sistemi di gruppo sanguigno oggi noti
Breve storia della genetica forense L’era dei polimorfismi proteici/enzimatici Differenze nel materiale genetico possono «tradursi» in differenze nelle sequenze aminoacidiche delle proteine. Tali differenze vennero utilizzate negli anni 60-80 per studi di genetica di popolazioni ed in ambito forense. Differenti forme dello stesso enzima (isoenzimi) venivano evidenziate mediante elettroforesi su agar, agarosio o acrilammide, sfruttando la differente carica degli isoenzimi per la separazione. La specificità enzimatica veniva al termine della corsa utilizzata per innescare una reazione che culminava con la produzione di una sostanza visibile Caratteristiche rilevanti in ambito genetico-forense: - Numero di alleli ridotto (in genere 2-4); - Tempi di esecuzione relativamente lunghi Potere di discriminazione maggiore (quando combinati) rispetto ai sistemi di gruppo sanguigno Livelli bassi di proteine nei reperti; Instabilità
Breve storia della genetica forense Minisatelliti I minisatelliti sono una classe di DNA ripetuto in tandem, con un motivo ripetuto di 8-100 basi ed un numero di ripetizioni spesso molto elevato (fino a 1000). Sono localizzati in tutto il genoma umano, preferenzialmente nelle regioni subtelomeriche. Il polimorfismo consiste nel diverso numero di ripetizioni in tandem (alleli) presenti nello stesso minisatellite. Il numero degli alleli è spesso nell’ordine delle decine (esempio di sistema multiallelico).
Minisatelliti: la tecnica del «DNA fingerprinting» Breve storia della genetica forense Minisatelliti: la tecnica del «DNA fingerprinting» Il metodo per evidenziare la variabilità dei minisatelliti si basa sulla tecnica «southern blotting». Si utilizza una sonda che riconosce un motivo “core” comune a più minisatelliti, e che permette quindi di evidenziare più minisatelliti contemporaneamente. Alec Jeffreys Il DNA fingerprinting Introdotto da Alec Jeffreys nel 1985. Il DNA viene estratto, digerito con enzimi di restrizione, sottoposto ad elettroforesi, denaturato e trasferito su membrana (southern blotting). Quindi viene utilizzata una sonda multi-locus “core” minisatellite marcata con radioattivo per l’ibridazione. Il segnale radioattivo viene rivelato mediante esposizione di una lastra sensibile ai raggi X DNA fingerprinting
Breve storia della genetica forense 1985: MINISATELLITI, inizia l’era del DNA typing CASE STUDY (1) Il primo caso criminale risolto mediante DNA typing: il signor Colin Pitchfork 1983: Lynda Mann, 15 anni, viene violentata e uccisa nel Leichestershire (UK) 1986: Dawn Ashworth, 15 anni, viene violentata e uccisa nella stessa zona Il modus operandi nei due delitti era lo stesso ed il gruppo sanguigno (gruppo A), determinato dalle tracce di liquido seminale, era il medesimo. Si decise di utilizzare la nuova tecnica del DNA fingerprinting mediante la quale si confermò che i due omicidi erano riconducibili allo stesso individuo. 1986: Richard Buckland, un ragazzo del posto, viene incriminato dei due delitti, ma l’analisi del DNA mediante fingerprinting rivela la sua innocenza. Circa 5000 individui nel Leichestershire possedevano il gruppo sanguigno A. Si organizzò uno screening di massa ed in nessun caso il DNA fingerprinting dei 5000 individui risultò corrispondere a quello del reperto. 1987: Per un puro caso, si venne a sapere che una persona del posto, un certo Colin Pitchfork, aveva chiesto ad un amico ed ottenuto di partecipare allo screening in sua vece. Il signor Pitchfork venne invitato a donare il sangue ed il profilo del suo DNA risultò identico a quello del DNA raccolto sulla scena dei due delitti.
Minisatelliti: vantaggi e limitazioni Breve storia della genetica forense Minisatelliti: vantaggi e limitazioni Vantaggi e limitazioni: Potere di discriminazione molto elevato Sensibilità limitata (>50-500 ng) Tecnica time-consuming Non automatizzabile Elevato peso molecolare: non adatto per campioni degradati Differenti alleli difficili da distinguere Problemi per l’interpretazione statistica Note sulla nomenclatura: ambiguità relativa ai termini RFLP, VNTR, DNA fingerprinting Introduzione di sonde che riconoscono un solo locus
esempio di «DNA fingerprinting» Breve storia della genetica forense Minisatelliti: esempio di «DNA fingerprinting» DNA fingerprinting di una famiglia. E’ stata utilizzata una sonda multicolus di tipo (GTG)5 Prima e ultima lane: profilo di un individuo non correlato alla famiglia Seconda e terza lane: padre e madre Lanes 4-22: figli Per gli studenti: Provare ad individuare, sulla base dei risultati del DNA fingerprinting riportato sopra, quali delle molteplici bande siano alleliche.
Breve storia della genetica forense 1985: viene descritta la tecnica PCR 1990: la tecnica PCR viene accolta in ambito forense La tecnica della reazione a catena della polimerasi ha rivoluzionato il modo di fare ricerca in diversi settori della genetica e della biologia molecolare. In ambito forense, l’introduzione della PCR ha rappresentato un punto di svolta fondamentale, permettendo di risolvere un problema molto ricorrente nelle indagini criminali: La scarsa quantità di DNA che può essere estratta da gran parte dei reperti. Breve descrizione della tecnica, gli studenti dovrebbero/potrebbero già conoscerla
CASE STUDY (2) Breve storia della genetica forense L’importanza della PCR in ambito forense CASE STUDY (2) Un vecchio caso di esclusione ottenuto mediante PCR: Glen Woodall 1987: Glen Woodall viene condannato a 355 anni di prigione per due diversi casi di violenza sessuale verificatisi nel parcheggio di un centro commerciale in West Virginia. Test su polimorfismi dei gruppi sanguigni ed enzimatici avevano rivelato un match tra il materiale biologico repertato ed il sangue prelevato all’accusato. La probabilità di match casuale era stata stimata essere pari a 6/10000. La difesa fece richiesta di un nuovo test basato sul DNA fingerprinting, ma questo si rivelò inconclusivo, per la quantità non ottimale del DNA repertato. Successivamente, la difesa fece richiesta di un nuovo test del DNA, questa volta basato sulla tecnica PCR. Il test confermò che il liquido seminale dei due casi di violenza proveniva dallo stesso aggressore, ma che il profilo genetico ottenuto era differente da quello di Glen Woodall. Nel 1992 G. Woodall venne discolpato ed indennizzato, dopo 5 anni di carcere.
Breve storia della genetica forense 1990: la prima tecnica basata su PCR accolta in ambito forense Il sistema polimorfico Human Leucocite Antigen (HLA) DQA1 Il sistema MHC (complesso maggiore di istocompatibilità, nell’uomo chiama HLA) è costituito da un insieme di proteine di superficie capaci di legarsi ad antigeni derivanti da patogeni e di esporli sulla superficie di cellule specializzate. Il sistema MHC è anche coinvolto nell’istocompatibilità e nelle malattie autoimmuni. I 240 geni MHC umani sono divisi in tre classi (I, II e III) e sono localizzati tutti in una regione di circa 3.3 Mbasi sul cromosoma 6. Il gene DQA1 appartiene alla classe II e codifica per la catena alfa del dimero DQ, coinvolto nell’immunità «extracellulare»
Breve storia della genetica forense 1990: la prima tecnica basata su PCR accolta in ambito forense Il sistema polimorfico Human Leucocite Antigen (HLA) DQA I geni del sistema MHC sono tra i più variabili del genoma umano, per ovvie ragioni legate alla funzione delle proteine per le quali codificano Basi molecolari della variabilita’ dell ’ esone 2 del gene DQA1, utilizzato in genetica forense nei primi anni ’90 come sistema altamente polimorfico analizzabile mediante PCR
Breve storia della genetica forense 1990: la prima tecnica basata su PCR accolta in ambito forense Il sistema polimorfico Human Leucocite Antigen (HLA) DQA1 La tecnica (reverse dot blot) Amplificazione mediante PCR dell’esone 2 ipervariabile del gene DQA1 (circa 200bp). I primers sono marcati con biotina. Ibridazione del prodotto PCR con oligo «allele specifici» fissati su una strip di membrana di nylon. 3) Lavaggio ad elevata stringenza: rimangono sulla membrana solo i prodotti PCR con sequenze perfettamente complementari ai relativi oligo. 4) Rivelazione mediante sistema streptavidina/biotina
Breve storia della genetica forense 1990: la prima tecnica basata su PCR accolta in ambito forense Il sistema polimorfico Human Leucocite Antigen (HLA) DQA1 Nel sistema «Amplitype DQ-a» erano presenti inizialmente 9 sonde in grado di distinguere 6 alleli, per un totale di 21 differenti genotipi (pannelo “a” in figura) Un kit prodotto successivamente (Polymarker) permetteva di discriminare un ulteriore allele in DQA (4.1 vs 4.2,4.3) e al tempo stesso permetteva di conoscere il genotipo di altri 5 sistemi polimorfici, due triallelici e tre biallelici (pannello “b” in figura, dove è mostrato il genotipo per una linea cellulare -9948- utilizzata come standard). Vantaggi e svantaggi: - Metodo semplice e rapido - Elevata sensibilità (PCR) - Potere di discriminazione relativamente basso (circa 1/10000) Nota: i 6 alleli nel pannello a sono 1.1, 1.2, 1.3, 2, 3 e 4. La combinazione di 6 alleli da luogo a 6 genotipi omozigoti e 15 genotipi eterozigoti.
(un minisatellite amplificabile mediante PCR) Breve storia della genetica forense 1994: Il minisatellite D1S80 (un minisatellite amplificabile mediante PCR) L’introduzione del kit Amplitype D1S80 rispondeva a due esigenze fondamentali in ambito genetico forense: La possibiltà di analizzare quantità minime di DNA mediante PCR La necessità di avere a disposizione marcatori multiallelici e caratterizzati da un elevato grado di eterozigosità (maggiore dei sistemi DQA1). Il minisatellite presenta una unità ripetitiva di 16 basi (corta per essere un minisatellite) con più di venti alleli caratterizzati da un numero di ripetizioni nel range 14-41. L’intero prodotto PCR varia da circa 400 bp (alleli più corti) a circa 800 bp (alleli più lunghi).
(un minisatellite amplificabile mediante PCR) Breve storia della genetica forense Il minisatellite D1S80 (un minisatellite amplificabile mediante PCR) Vantaggi e svantaggi: Metodo relativamente semplice (PCR + elettroforesi) Elevata sensibilità (PCR) Potere di discriminazione elevato (per un singolo locus) La presenza di alleli multipli facilita l’interpretazione delle «misture» Range bp del prodotto PCR troppo grande (problemi con DNA degradato) Difficoltà per l’analisi in multiplex e per l’automazione
1995-present: MICROSATELLITI Breve storia della genetica forense (fine ?) 1995-present: MICROSATELLITI L’introduzione dei microsatelliti in ambito forense verso la metà degli anni ’90 portò alla rapida «estinzione» dei marcatori utilizzati in precedenza. Dal 1995 ad oggi i microsatelliti autosomici sono rimasti i marcatori di elezione in ambito forense, ed è opinione diffusa (sebbene non da tutti condivisa) che lo rimarranno per sempre. Ciò nonostante, altri tipi di marcatori e sistemi polimorfici vengono oggi utilizzati in casi forensi specifici: Variazione di sequenza del DNA mitocondriale Microsatelliti del cromosoma Y e del cromosoma X SNPs indels Questi sistemi polimorfici e i microsatelliti, per la loro importanza nella genetica forense moderna, saranno trattati in dettaglio in lezioni dedicate
Multiplex microsatelliti Breve storia della genetica forense Confronto tra sistemi polimorfici utilizzati in ambito genetico forense nel XX secolo (variabilità vs. rapidità analisi) Speed of Analysis (Technology) Power of Discrimination (Genetics) Low High Slow Fast Minisatelliti Single Locus Probes Multi-Locus Probes ABO/gruppi sanguigni Multiplex microsatelliti DQ Singolo microsatellite minisatelliteD1S80 mtDNA PCR Southern blot Sequencing Polimorfismi proteici Figure 1.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
quale marcatore? dimensioni tasso di mutazione In qualsiasi tipo di applicazione (forense, evolutiva, mappatura, diagnostica) che coinvolga dei marcatori genetici polimorfici sono disponibili (o sono stati disponibili) diversi tipi di marcatori. Storicamente, nelle diverse discipline alcuni marcatori sono stati preferiti ad altri, che sono caduti in disuso. La scelta dei marcatori si basa (o si è basata storicamente) su una serie di caratteristiche dei marcatori, che possono essere di tipo biologico o tecnico: dimensioni tasso di mutazione grado di eterozigosità (potere di discriminazione) numero di alleli localizzazione nel genoma numero di copie/cellula stabilità biologica (proteine vs DNA vs RNA) sensibilità analitica accuratezza possibilità di analisi multiplex possibilità di standardizzazione tempi tecnici dell’esperimento costi dell’attrezzatura costi dell’esperimento Caratteristiche biologiche Caratteristiche tecniche del metodo di analisi
Cos’è il tasso di mutazione? Numero di mutazioni per unità di tempo e di spazio Parlando di tasso di mutazione bisogna sempre specificare a cosa si fa riferimento: Tempo Tasso di mutazione per anno? generazione? divisione cellulare? Spazio Tasso di mutazione per: nucleotide? elemento variabile? gene? genoma?
profilo microsatelliti profili minisatelliti
Parte 3 Focus sui microsatelliti (short tandem repeats, STRs) marcatori d’elezione in genetica forense
Natura molecolare dei microsatelliti I microsatelliti sono una classe di DNA ripetuto caratterizzato da un piccolo numero di ripetizioni corte in tandem. Sono comuni nel DNA nucleare di tutti gli eucarioti fino ad ora esaminati (circa 1/10 mila basi) Nei primati rappresentano circa 2% del genoma
Esempio di microsatellite utilizzato in ambito genetico forense: D16S539 Figure 5.1 (tratto da Butler) DNA sequence of a D16S539 allele containing 11 GATA repeats (shown in blue font). The STR repeat sequence is included in lowercase font with breaks between each repeat unit for emphasis. Underlined regions in green font indicate PowerPlex 16 primer binding sites (Krenke et al. 2002) with the shaded portion showing the PCR product, which is 288 bp (see Appendix 1). This top strand of the reference sequence is the reverse complement of GenBank entry AC024591 available from http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/seq_ref.htm. The ‘T’ shown in red font indicates a point mutation that resulted in a null allele with a previous primer (Nelson et al. 2002).
Natura molecolare dei microsatelliti perfetti composti interrotti I microsatelliti possono essere perfetti (o semplici), interrotti o composti. Alcuni microsatelliti che presentano diversi motivi e/o interruzioni vengono detti complessi (esempio SE33). Vengono ulteriormente classificati in base alla composizione del motivo ripetuto (esempio GATA repeat) oppure alla lunghezza del motivo ripetuto: dinucleotide repeats (4 tipi possibili), trinucleotide repeats (10 tipi), tetranucleotide repeats (33 tipi), pentanucleotide repeats (102 tipi) ecc.
Distribuzione dei microsatelliti I microsatelliti sono distribuiti in modo abbastanza omogeneo nel DNA nucleare dove si ritrovano sia sugli autosomi che nei cromosomi sessuali. Nei primati rappresentano circa 2% del genoma. Non sono invece presenti nel mtDNA umano
Mutazione nei microsatelliti L’elevato tasso di mutazione nei microsatelliti è dovuto a scivolamento della polimerasi in replicazione Tasso di mutazione molto elevato: 10-2 – 10-4 mutazioni/STR/generazione La mutazione avviene generalmente per aumento o diminuzione di una singola unità ripetitiva Mutazioni per aumento più frequenti di mutazioni per diminuzione Il tasso di mutazione per ciascun microsatellite è positivamente correlato con la lunghezza dell’allele
Variabilità genetica dei microsatelliti Il polimorfismo nei microsatelliti consiste nel diverso numero di copie del motivo semplice Il numero degli alleli è generalmente compreso tra 4 e 40 Il grado di variabilità dei microsatelliti è correlato positivamente con il numero di ripetizioni; microsatelliti corti sono in genere monomorfici A causa dell’elevato tasso di mutazione, gli alleli dei microsatelliti uguali in stato spesso non sono uguali per discendenza Microsatelliti interrotti in genere mostrano un grado minore di variabilità di microsatelliti perfetti di pari lunghezza La mutazione nei microsatelliti generalmente non ha effetti fenotipici, ma in alcuni casi è causa di importanti malattie, in gran parte neuro-degenerative (CORSO GENETICA UMANA - LM GBM)
I microsatelliti in ambito forense «Il microsatellite ideale» (nella genetica forense) Microsatellite con elevata eterozigosità (maggiore discriminazione) Microsatellite con range allelico contenuto (facilita multiplexing) Microsatellite amplificabile in corti prodotti PCR (per DNA degradato) Microsatellite i cui alleli siano ben separabili su gel (accuratezza) Microsatellite che presenti un ridotto fenomeno di stuttering Microsatellite con tasso di mutazione contenuto (x paternità) Microsatellite situato su autosomi (“indipendenza” statistica dei loci) Molte di queste caratteristiche si escludono vicendevolmente: (esempio: basso tasso di mutazione e elevata eterozigosità) Qual è un ragionevole compromesso? La comunità forense si è orientata principalmente su microsatelliti del tipo tetranucleotide repeats autosomici
I microsatelliti in ambito forense Necessità di identificare un set unico (core) di microsatelliti che sia condiviso da tutta la comunità genetico forense. Pannello di 13 microsatelliti «core» (in giallo) secondo il CODIS, USA CODIS (Combined DNA Index System) Programma dell’FBI in supporto alla giustizia che si basa sullo sviluppo e l’utilizzazione di databases di profili genetici. In UK e alcuni altri stati Europei si utilizza un «core» di 10 STR, 8 dei quali in comune con il CODIS CODIS (from the FBI web site) The Combined DNA Index System, or CODIS, blends forensic science and computer technology into a tool for linking violent crimes. It enables federal, state, and local forensic laboratories to exchange and compare DNA profiles electronically, thereby linking serial violent crimes to each other and to known offenders. Using the National DNA Index System of CODIS, the National Missing Persons DNA Database also helps identify missing and unidentified individuals. Overview CODIS generates investigative leads in cases where biological evidence is recovered from the crime scene. Matches made among profiles in the Forensic Index can link crime scenes together, possibly identifying serial offenders. Based upon a match, police from multiple jurisdictions can coordinate their respective investigations and share the leads they developed independently. Matches made between the Forensic and Offender Indexes provide investigators with the identity of suspected perpetrators. Since names and other personally identifiable information are not stored at NDIS, qualified DNA analysts in the laboratories sharing matching profiles contact each other to confirm the candidate match. History The FBI Laboratory’s CODIS began as a pilot software project in 1990, serving 14 state and local laboratories. The DNA Identification Act of 1994 formalized the FBI’s authority to establish a National DNA Index System (NDIS) for law enforcement purposes. Today, over 190 public law enforcement laboratories participate in NDIS across the United States. Internationally, more than 90 law enforcement laboratories in over 50 countries use the CODIS software for their own database initiatives. Mission The CODIS Unit manages CODIS and NDIS. It is responsible for developing, providing, and supporting the CODIS program to federal, state, and local crime laboratories in the United States and selected international law enforcement crime laboratories to foster the exchange and comparison of forensic DNA evidence from violent crime investigations. The CODIS Unit also provides administrative management and support to the FBI for various advisory boards, Department of Justice grant programs, and legislation regarding DNA. The Team Program managers, forensics system program managers, biologists, auditors, management and program analysts, and paralegal specialists. The Future Through the combination of increased federal funding and expanded database laws, such as the DNA Fingerprint Act of 2005, the number of profiles in NDIS has and will continue to dramatically increase, resulting in a need to re-architect the CODIS software. A considerable focus during this time will be to enhance kinship analysis software for use in identifying missing persons. This next generation of CODIS will utilize STR and mtDNA information as well as metadata (such as sex, date of last sighting, age, etc.) to help in the identification of missing persons. The re-architecture will also enable CODIS to include additional DNA technologies, such a Y Short Tandem Repeat (Y-STR) and mini-Short Tandem Repeat (miniSTR). The FBI Laboratory is committed to the support of the CODIS program. With the continued cooperation and collaboration of legislative bodies and all components of the criminal justice community—law enforcement, crime laboratories, victims, prosecutors, and the judiciary—the future of DNA, CODIS, and NDIS holds even greater promise to solve crime and identify missing persons. I 13 microsatelliti del CODIS furono scelti nel 1997 a partire da 17 loci candidati, in base alla loro variabilità e facilità di interpretazione dei risultati. I 13 loci sono tutti «tetranuceotide repeats», sia semplici che composti. L’analisi dei 13 loci del CODIS porta a profili genetici la cui probabilità di random match è minore di 1 su un miliardo di milioni (10-15) .
I microsatelliti in ambito forense Necessità di identificare un set unico (core) di microsatelliti che sia condiviso da tutta la comunità genetico forense. I kit commerciali sviluppati da Applied Biosystems (a sinistra) e Promega (sotto) permettono di amplificare i 13 STR «core» del CODIS più alcuni altri STR. I kit commerciali sono in continua «evoluzione» inseguendo le richieste della comunità forense (maggior numero di loci coamplificabili, mini STR, Y-STR , STR ipervariabili ecc.)
I microsatelliti in ambito forense I kit commerciali sono in continua «evoluzione» inseguendo le richieste della comunità forense (maggior numero di loci coamplificabili, mini STR, Y-STR , STR ipervariabili ecc.)
Nomenclatura dei microsatelliti (e dei loro alleli) Necessità di fare riferimento ad una nomenclatura univoca per permettere il confronto tra laboratori e con i diversi database Nomenclatura degli alleli: (1) Scelta del filamento Se il microsatellite è in un gene, si prende in considerazione il filamento codificante Se il microsatellite non è in un gene, si prende in considerazione il filamento corrispondente alla sequenza originariamente descritta in letteratura e riportata in un database pubblico. La direzione di lettura è sempre, ovviamente, 5’-3’ Figure 5.6 (Butler 2012) Example of the DNA sequence in a STR repeat region. Note that using the top strand versus the bottom strand results in different repeat motifs and starting positions. In this example, the top strand has 6 TCTA repeat units while the bottom strand has 6 TGAA repeat units. Under ISFG recommendations, the top strand from GenBank should be used. Thus, this example would be described as having [TCAT] as the repeat motif. Repeat numbering, indicated above and below the sequence, proceeds in the 5’-to-3’ direction as illustrated by the arrows. 1 2 3 4 5 6 5’-TTTCCC TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCACCATGGA-3’ 3’-AAAGGG AGTA AGTA AGTA AGTA AGTA AGTA AGTGGTACCT-5’ 6 5 4 3 2 1
Nomenclatura dei microsatelliti (e dei loro alleli) (2) Nome del motivo ripetuto. Nell’esempio riportato sotto, potremmo parlare di un microsatellite di tipo (TCAT)n oppure (CATT)n oppure (ATTC)n o ancora (TTCA)n (TCAT)n La scelta ricade sul primo motivo ripetuto «utile» incontrato partendo dal 3’ del filamento scelto secondo il criterio visto in precedenza. Nell’esempio sopra quindi si sceglierà (TCAT) E’ importante osservare che la scelta del filamento e/o del motivo ripetuto potrebbe condizionare il numero di repeats conteggiate con importanti implicazioni per la ricerca di match in database. Nell’esempio sotto, allele (AAAT)8 oppure (TAAA)9 ? 5’ AAAATGCACTAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAACAAA 1 2 3 4 5 6 5’-TTTCCC TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCACCATGGA-3’ 3’-AAAGGG AGTA AGTA AGTA AGTA AGTA AGTA AGTGGTACCT-5’ 6 5 4 3 2 1 Figure 5.6 (Butler 2012) Example of the DNA sequence in a STR repeat region. Note that using the top strand versus the bottom strand results in different repeat motifs and starting positions. In this example, the top strand has 6 TCTA repeat units while the bottom strand has 6 TGAA repeat units. Under ISFG recommendations, the top strand from GenBank should be used. Thus, this example would be described as having [TCAT] as the repeat motif. Repeat numbering, indicated above and below the sequence, proceeds in the 5’-to-3’ direction as illustrated by the arrows.
Nomenclatura dei microsatelliti (e dei loro alleli) (3) «Microvarianti» o interalleli. Alleli con motivi ripetuti incompleti devono includere il numero di ripetizioni complete e, separate da un punto, il numero di basi nella ripetizione incompleta. Esempio: Allele 11.3: ctcc GATA GATA GATA GATA GATA GTA GATA GATA GATA GATA GATA GATA ctcg Esempio di interallele 11.3 al locus D2S441 NOTA: Poiché con i metodi standard di analisi degli STR (elettroforesi capillare) il numero di repeats si deduce dalla lunghezza complessiva dell’amplicone, può accadere che un interallele sia dovuto ad inserzione/delezione nella sequenza dell’amplicone fiancheggiante il STR, piuttosto che nell’STR stesso.