I MARCATORI PROGNOSTICI DEL CARCINOMA SQUAMOSO DEL CAVO ORALE: RUOLO DELLA CITOMETRIA A FLUSSO E DELL’IMMUNOISTOCHIMICA CON PARTICOLARE RIGUARDO ALLE PROTEINE DEL CHECKPOINT MITOTICO M.Schneider (1), C.Rizzardi (2), M.Biasotto (3), M.Faraon (3), M.Melato (2) 1. Ass.n.2 Isontina, Servizio di Anatomia ed Istologia Patologica, Ospedale S.Polo, Monfalcone (Go). 2. Dipartimento di Patologia e Medicina Legale, Azienda Ospedaliero-Universitaria Ospedali Riuniti, Trieste. 3. U.C.O. di Clinica Odontostomatologica, Universita' degli Studi di Trieste

INDICATORI PROGNOSTICI Numerosi sono i fattori prognostici del carcinoma del cavo orale attualmente accettati e consolidati; essi possono essere correlati al paziente, alle caratteristiche clinico-morfologiche e molecolari della neoplasia od al trattamento. Nel nostro studio abbiamo valutato: la ploidia le proteine del checkpoint mitotico (Mad2) Ki67

PLOIDIA Si dice aneuploide una cellula che contiene un numero di cromosomi diverso da 46; l’aneuploidia è stata correlata alla prognosi in molte neoplasie umane ed evidenziata in numerose lesioni preneoplastiche (cervice uterina, capo e collo, colon, esofago, midollo osseo umani e mammella e cute in animali). Essa può originare in seguito a difetti nel checkpoint del fuso mitotico. L’aneuploidia nel carcinoma del cavo orale è stata correlata positivamente da alcuni autori con le dimensioni e la differenziazione della neoplasia e con la presenza o meno di metastasi.

IL CHECKPOINT DEL FUSO MITOTICO Il checkpoint del fuso mitotico è un meccanismo di controllo che assicura una corretta segregazione dei cromatidi fratelli durante la mitosi al fine di garantire un contenuto diploide nelle cellule figlie. Mutazioni nelle proteine del checkpoint mitotico sono state riscontrate nelle neoplasie di: colon-retto, polmone, nasofaringe, ovaio, mammella, fegato e cavo orale.

MAD2 Mad2 è una proteina chiave nel checkpoint mitotico; topi che la iperesprimono sviluppano multiple neoplasie e topi knockout per il suo gene hanno anomalie cromosomiche. Cellule prostatiche in coltura senza Mad2 sviluppano aneuploidia, crescita indipendente e perdono la risposta p53 mediata al danno al DNA. Mad2 risulta iperespressa nell’esofago di Barrett, nelle neoplasie dello stomaco, colon e retto, vescica, neuroblastoma, esofago, mammella La sua espressione non è mai stata valutata nei carcinomi del cavo orale

ATTIVITÀ PROLIFERATIVA Ki67 è un anticorpo che lega un antigene nucleare espresso solo dalle cellule proliferanti. La sua iperespressione è stata correlata, in numerosissime neoplasie umane, alla prognosi. Nel carcinoma del cavo orale essa è stata correlata alla progressione delle lesioni preneoplastiche, alle metastasi ed alla sopravvivenza, al T ed N, alle metastasi ed al grado da diversi autori.

MATERIALI E METODI 57 carcinomi del cavo orale (1997-2007) Follow-up da 9 a 111 mesi, fine al 20/02/2007 Età tra i 41 e gli 86 anni, con età media di 67 anni Ploidia: citometria a flusso (Coulter Epics Elite ESP) Immunoistochimica: Ki67 (Ventana Medical System) e Mad2 (BD Transduction) Conta 500 cellule nell’area a maggiore positività; singolo osservatore in cieco Ki67=1 se <33% Ki67=2 se 34%-66% Ki67=3 se >66% Schoelch et al 1999 Mad2=1 se <10% Mad2=2 se 11%-25% Mad2=3 se 26%-50% Mad2=4 se >51% Li et al 2003-2004

MATERIALI E METODI: STUDIO STATISTICO CON EPIINFO 2005: Curve di sopravvivenza di Kaplan Maier per: Sottosede anatomica pG pT pN Stadio Superamento capsulare in N+ Recidiva/metastasi Ploidia Ki67 Mad2 Test del X2 per: Tutti i parametri della neoplasia con: Ploidia Ki67 Mad2 Localizzazione subcellulare di Mad2 Ploidia, Ki67 e Mad2 tra loro Correlazione tra parametri quantitativi di Ki67, Mad2 e % cellule aneuploidi

RISULTATI 1 Sesso: Maschi 79%; Femmine 21% Sopravvivenza: deceduti 49%; vivi 51% Recidiva: + 37%; -63% Fine follow-up: vivi senza ripresa di malattia: 37%; vivi con ripresa di malattia: 14%; deceduti senza ripresa di malattia: 26%; deceduti con ripresa di malattia: 23% Sede: orofaringe 47%; 28% pavimento; 23% lingua; 2% palato Istotipo: ca.squamoso 96%; ca.verrucoso 2%; ca.pseudosarcomatoso 2% pT : pT1 39%; pT2 43%; pT3 11%; pT4 7% pN: pN0 33%; pN1 23%; pN2 44% Superamento capsulare in N+: - 72%; + 28% Stadio: st.x 21%; st.1 5%; st.2 18%; st.3 18%; st.4 38%

RISULTATI 2 Ploidia: Mad2: 59% diploide 1(<10%) 2% 41% aneuploide Ki67: 1(<33%) 2% 2(33-66%) 35% 3 (>66%) 63% Mad2: 1(<10%) 2% 2(11-25%) 9% 3(26-50%) 7% 4(>51%) 62% Citoplasma + 18% Nucleo + 82%

Mad2 alta positività Mad2 Ki67 alta positività Mad2 bassa positività Mad2 Ki67 bassa positività

RISULTATI CON VALORE PREDITTIVO P<0,05 X2 con P<0,05: Ki67 e Stadio Mad2 e pT Mad2 citoplasmatico o nucleare con il pN e lo Stadio Intensità di Mad2 rispetto la mucosa sana e suo valore % nel conteggio su 500 cellule Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier con P<0,05: pN Superamento capsulare nei pN+

Curva di sopravvivenza di Kaplan-Maier per il superamento capsulare negli N+ Test Statistic D.F. P-Value Log-Rank 4,6471 1 0,0311 Wilcoxon 4,3281 1 0,0375

Chi-squared df Probability 18,7245 6 0,0047 Intensità di Mad2 nella neoplasia rispetto alla mucosa sana e sua correlazione con il numero di cellule positive su 500

CONCLUSIONI Il nostro studio ha confermato i dati esistenti in letteratura riguardo l’epidemiologia del carcinoma orale (età, sesso, mortalità) ed il peso del pN e del superamento capsulare sulla prognosi. Nella nostra casistica non si è messa in luce alcuna relazione tra la ploidia ed il Ki67 con la prognosi. Mad2 sembra essere un promettente indicatore prognostico, alla luce dei risultati del X2, in particolare riguardo la sua localizzazione subcellulare ed al suo andamento con il Ki67, anche se non statisticamente significativo. Inoltre l’intensità di Mad2 nella neoplasia rispetto alla mucosa sana è risultata rappresentativa del suo valore sulla conta su 500 cellule, suggerendo un metodo di valutazione più intuitivo.