Il laboratorio nella valutazione della funzionalità epatica e renale

The multiple functions of the liver are exceeded only by the biochemical methods designed to test them... Dame Sheila Sherlock Diseases of the Liver and Biliary System

Perchè vengono richiesti i test di funzionalità epatica? - 1 Diagnosi – Questo paziente ha una malattia epatica? Prognosi – Stima probabile della sopravvivenza nelle malattie croniche ed acute del fegato Screening – Gruppi selezionati – Individuale Progressione della malattia Risposta alla terapia Guarigione dopo chirurgia o altri interventi

Differenziazione del tipo di epatopatia – Ittero da colestasi, ostruttivo – Epatite - infettiva, autoimmune, alcolica Guida per ulteriori indagini – Sierologia virale – Autoanticorpi – Imaging (radiologia, TAC, Ecografia) – ERCP (Endoscopic retrograde colangio- pancreatoscopy) Perchè vengono richiesti i test di funzionalità epatica? - 2

Test di primo livello attualmente più utilizzati (Liver Function Tests - LFTs) Transaminasi o Aminotransferasi, AST, ALT – danno parenchimale Bilirubina – colestasi Fosfatasi alcalina, -glutamiltranspeptidasi (GGT) – danno epitelio biliare ed ostruzione biliare (alcol) Albumina – sintesi epatica Tempo di protrombina (INR) – coagulazione (indicatore dinamico)

Aminotransferasi (transaminasi) Aspartato aminotransferasi (AST) presente in: – Fegato, muscolo cardiaco e scheletrico, rene, cervello, pancreas, polmone, WBC e RBC – Isoforme mitocondriale e citoplasmatica (immunosottrazione) – mAST (mitocondriale) proposta come marcatore per differenziare epatite alcolica vs non-alcolica Alanina transaminasi (ALT) presente in: – Come AST ma in misura minore nei tessuti non-epatici – Enzima citoplasmatico

Cause di aumento AST/ALT ?Origine epatica o non epatica – dosaggio CK (muscolo scheletrico), cTnI (cuore), amilasi (pancreas), etc. Se di origine epatica, un'aumento della AST indica un danno degli epatociti: – epatite : virale, autoimmune, alcolica, da farmaci Se non di origine epatica, possibile danno muscolare: – Miosite, ipotiroidismo, droghe, IM (infarto miocardico)

Cause di un aumento di AST / ALT >10x ULN (upper limit of normality) Epatite acuta, ipossiemia tessutale (shock) 5-10x ULN infarto miocardico, Trauma, malattie del muscolo scheletrico, Colestasi, Epatiti croniche, epatite autoimmune < 5x ULN Condizioni fisiologiche (neonati), altre malattie epatiche (Wilson, emocromatosi, deficit di alfa1-antitripsina), pancreatite, emolisi in vivo e in vitro, abuso alcolico.

Aumento di AST/ALT di origine epatica Associato a lieve incremento di altri test indica un'epatite: – Infettiva – A/B/C, CMV, EBV ed altri ALT meglio di AST per il monitoraggio dell'epatite cronica B/C – Autoimmune – autoanticorpi – Tossine Epatite alcolica non comune (bevitori occasionali) Farmaci – paracetamolo ed altri (spesso idiosincrasia) Metalli – rame (malattia di Wilson), ferro (emocromatosi) Veleni – funghi etc. Rigetto post-trapianto

Bilirubina Vero liver function test Viene coniugata a livello epatico ed escreta nella bile Differenziazione tra bilirubina coniugata e non coniugata: – Malattia epatica ostruttiva, iperbilirubinemia coniugata – Insufficienza epatica, quadro misto (pochi epatociti e alterata escrezione) – Iperbilirubinemia non coniugata nel neonato (immaturità degli epatociti)

Cause non-epatiche di aumento della bilirubina Bilirubina viene prodotta dalla distruzione dei globuli rossi (emolisi eccessiva o distruzione cellulare – di solito non coniugata) – Emoglobinopatie – sickle cell disease, sferocitosi, etc – Emolisi intravascolare da altre cause Tossine – rame (Wilson) può causare distruzione RBC (anemia normocitica) Infezioni – malaria Altro – CBP (cirrosi biliare primitiva), epatite autoimmune e alcolica

Sindrome di Gilbert Coniugazione della bilirubina è mediata da UDP- glucoronosil transferasi 1A Condizione benigna autosomica dominante con lieve iperbilirubinemia non coniugata Inserzione TA nel TATA repeat box del gene promoter. L'omozigosi riduce la capacità di espressione genica – In condizioni normali non vi sono conseguenze ma in situazioni di aumentata richiesta (malattie, infezioni, digiuno) si può verificare un marcato aumento della bilirubina

Alkaline phosphatase (ALP) Gruppo di enzimi che idrolizzano esteri di fosfato in soluzioni alcaline Geni differenti codificano per isoenzimi non-tessuto specifici e isoenzimi tessuto-specifici (placenta, intestino, cellule germinali) Modificazioni post-traslazionali (glicosilazione) producono diverse isoforme (epatica, renale, ossea) La differenziazione delle isoforme può assumere importanza e può essere ottenuta mediante elettroforesi con PAGE o mediante dosaggi immunometrici specifici (per esempio, BAP bone alkaline phosphatase)

Aumento della ALP sierica Di origine epatica per ostruzione delle vie biliari intraepatiche: –Meccanica – calcoli, neoplasie (pancreatiche/biliari) –Restringimenti – cirrosi biliare primitiva (PBC), colangite sclerosante (PSC), cirrosi criptogenetica –Ipertensione portale Di origine non-epatica: –Isoforma ossea (osteoblasti) –Fisiologico – gravidanza –Iperfosfatasemia transitoria

Iperfosfatasemia transitoria Originariamente descritta nei bambini, si può verificare anche negli adulti ed in gravidanza Incremento marcato della ALP fino a parecchie migliaia di IU/L Transitoria con ritorno alla normalità in 4-6 settimane Associata con infezioni, soprattutto del tratto gastroenterico Si pensa sia dovuta a modificazione delle catene laterali glicidiche che provocherebbero una ridotta eliminazione con aumento dell'emivita

Cause di aumento della fosfatasi alcalina Fisiologiche Gravidanza (terzo trimestre), infanzia Patologiche > 5x ULN Morbo di Paget (osteoblasti), Osteomalacia, Colestasi, Cirrosi < 5x ULN Tumori ossei, iperparatiroidismo primario, fratture ossee, tumori epatici, epatiti, malattia infiammatoria intestinale

Gamma-glutamil transpeptidasi o gamma- glutamil transferasi (GGT) Prodotta negli epatociti e nelle cellule dell'epitelio biliare Enzima microsomiale (induzione da parte di farmaci che agiscono sul citocromo P450) responsabile del trasferimento di gruppi glutamici tra peptidi Presente anche in altri organi: –Cuore, reni, polmoni, pancreas, vescicole seminali –Nel plasma la forma predominante è l'isoenzima epatico

Aumento di GGT - 1 Farmaci –Induzione - alcol, anti-epilettici etc. –Meccanismi diversi antibiotici statine FANS Erbe e altri prodotti omeopatici Methotrexate

Aumento di GGT - 2 Steatosi (accumulo di grasso) –Correlata all'alcol, obesità, diabete mellito, NASH (non- alcoholic steatohepatitis) Fibrosi/cirrosi (accumulo di matrice extracellulare e collagene) –Cirrosi alcolica, PBC, PSC, emocromatosi, deficit di alfa-1- antitripsina, malattia di Wilson (accumulo di rame) etc. Lesioni occupanti spazio –Tumori (carcinoma epatocellulare o metastasi) –Malattie granulomatose (sarcoidosi, tubercolosi)

Cause di aumento di GGT >10x ULN Colestasi, malattia epatica alcolica 5-10x ULN Epatiti, Cirrosi, pancreatiti <5x ULN alcol, farmaci induttori

Proteine plasmatiche La maggior parte delle proteine (eccetto le immunoglobuline) sono prodotte dal fegato La più significativa è rappresentata dalla ALBUMINA che contribuisce alla regolazione dell'osmolarità plasmatica Le proteine di fase acuta sono prodotte a livello epatico Proteine di trasporto di metalli e vitamine (transferrina, ceruloplasmina, Vitamin D binding protein) sono sintetizzate e immagazzinate nel fegato

Albumina Per mantenere concentrazioni ottimali di albumina è sufficiente che vi siano solo il 10% degli epatociti funzionanti Una bassa concentrazione plasmatica di albumina deve far pensare ad una malattia epatica dopo aver escluso una ridotta ingestione e/o una aumentata perdita renale o gastrointestinale

INR International normalised ratio E' un reale liver function test dinamico INR aumentato indica deficit di fatori II, VII, IX o X o di Vitamina K Un INR > 3.0 costituisce una controindicazione per la biopsia epatica ed altre manovre invasive (rischio di sanguinamento)

Altri test biochimici AFP (alfa-fetoproteina) per tumori primitivi del fegato –Aumenta anche nel fegato in rigenerazione come nella cirrosi CA19-9 per tumori delle vie biliari –Aumenta anche in tumori del colon-retto e del pancreas Ferritina per l'emocromatosi (accumulo di ferro) Urea e colesterolo –La produzione risulta molto ridotta nell'insufficienza epatica

LFTs: i pro e i contro VANTAGGI –Poco costosi, ampiamente disponibili e conosciuti da tutti –Possono guidare indagini successive SVANTAGGI –Vecchi marcatori (vi sono molte malattie di recente riconoscimento per le quali essi non hanno un valore diagnostico) –Scarso valore prognostico –Scarsa efficacia nella valutazione della risposta al trattamento –Non danno una valutazione funzionale quantitativa o dinamica

Cosa c'è di nuovo tra i marcatori biochimici di funzionalità epatica?

Nuove aree di interesse Biologia molecolare –Malattie ereditarie o genetiche –(deficit di alfa-1-antitripsina, malattia di Wilson) Test per valutare l'assunzione di alcol –Carbohydrate deficient transferrin (CDT) Biomarcatori di fibrosi –PIIINP

Carbohydrate deficienct transferrin Transferrina : glicoproteina con p.m. 80,000 Singola catena polipeptidica di 679 aminoacidi Due siti di legame per il Ferro, emivita 6-12 giorni Due unità di catene laterali oligosaccaridiche con 3-4 residui di acido sialico (funzione di stabilizzazione della molecola e di regolazione dell'affinità per il recettore) Eliminazione per via epatica (degradazione lisosomiale) L'alcol interfersice direttamente con l'enzima che aggiunge o rimuove i residui di acido sialico e provoca un aumento delle forme asialo, mono- e di-sialo

Senbilità e specificità di nuovi marcatori di danno epatico da alcol Test Sensibilità Specificità Cut-off CDT % mAST U/L GST* IU/L AST/ALT IU/L *Glutatione-S-transferasi

Confronto tra GammaGT e CDT CDT GGT CDT+GGT Sensibilità Mediana68.5% 61% 92% Range Specificità Mediana95.5% 77.5% 83% Range Litten et al Alcohol Clin Exp Res 1995

Biomarcatori di fibrosi epatica - 1 Collagene/procollagene Tipo% nel fegato normale% nel cirrotico I 40 – – 70 III 40 – – 30 IV 1 1 – 2 V – 10 VI

Componenti della matrice extracellulare Fibronectina (molecola di adesione) Vitronectina (molecola di adesione) Laminina(componente principale delle membrane basali cellulari) Acido ialuronico Biomarcatori di fibrosi epatica - 2

Collagene di tipo I e III Collageni a struttura fibrillare con tripla elica (300 nm). Sintetizzati sotto forma di propeptidi ad entrambe le estremità delle fibrille (larghezza di nm). La timozione dei propeptidi promuove la crescita delle fibrille. I propeptidi possono essere trattenuti nella matrice extracellulare (tipo I) o rilasciati in circolo (III). Sono disponibili immunodosaggi di PICP (propeptide C-terminale di tipo I), PINP (N-terminale), PIIINP (N- terminale di tipo III). PIIINP appare il migliore nell'individuazione della fibrogenesi epatica.

PIIINP Concentrazioni circolanti aumentate si riscontrano in numerose malattie epatiche: –Cirrosi alcolica, carcinoma epatocellulare, cirrosi biliare primitiva, epatite virale cronica da HCV Possono aumentare anche in malattie non-epatiche con alterazioni del metabolismo del collagene: –Mielofibrosi, sclerosi sistemica, metastasi ossee da carcinoma mammario, ipertiroidismo

Anatomia renale Corteccia Midollare Pelvi Verso la vescica Capsula Uretere Arteria e vene renali Piramide midollare 11cm 6 cm 3cm

Quali sono le funzioni dei reni? Regolazione del volume e dell'osmolarità dei liquidi corporei Regolazione del bilancio elettrolitico Regolazione dell'equilibrio acido-base Escrezione di prodotti del metabolismo (urea, creatinina) e di sostanze esogene (farmaci) Sintesi ed escrezione di ormoni Gluconeogenesi

Arteria renale Glomerulo Capsula di Bowman Tubulo prossimale Tubulo distale Dotto collettore Ansa di Henle Arteriola afferente Vasa Recta –L'unità funzionale è il NEFRONE – 10 6 nefroni/rene

Filtrazione glomerulare Membrana capillare glomerulare Spazio vascolare Spazio di Bowman Pressione media a livello dei capillari di sangue Pressione spazio di Bowman Pressione oncotica Pressione idrostatica netta 2,000 Litri al giorno (25% della gettata cardiaca) 200 Litri al giorno GFR 110 mL/min

Fattori che influenzano la filtrazione Dimensioni e forma delle molecole ( 70 KDa improbabile) Carica negativa. La membrana basale ha una carica negativa Pressione effettiva di filtrazione: - –Un aumento della resistenza nei vasi efferenti determina un incremento della pressione nei vasi afferenti –Contro-pressione è rappresentata dalla pressione oncotica (dovuta principalmente alle proteine plasmatiche) –Il passaggio di sangue attraverso i glomeruli fa aumentare la pressione oncotica e così riduce la pressione di filtrazione

Processo dinamico 200 litri di filtrato passano nei nefroni ogni giorno, ma solo 1-2 litri di urina vengono prodotti, per cui oltre il 99% del filtrato viene riassorbito. Riassorbimento –attivo o passivo –avviene praticamente a tuttti i livelli o segmenti funzionali del nefrone.

Cosa passa nel filtrato glomerulare? Liberamente filtrati –H 2 O –Na +, K +, Cl -, HCO 3 -, Ca ++, Mg +, PO 4, etc. –Glucosio –Urea –Creatinina –Insulina Meno facilmente filtrati* 2 -microglobulina# –RBP (retinol- binding protein) 1 -microglobulin –Albumina * proteine di basso PM # talora usato come indicatore di funzionalità renale Di solito non filtrati* –Immunoglobuline –Ferritina –Cellule * dimensioni più grandi

Quindi, le funzioni dei tubuli renali sono: Riassorbimento selettivo o escrezione di acqua e ioni al fine di mantenere costante la composizione idro- elettrolitica dellorganismo. Riassorbimento attivo di composti filtrati, quali glucosio ed aminoacidi.

RIASSORBIMENTO DAL FILTRATO GLOMERULARE % riassorbimento Acqua99.2 Sodio99.6 Potassio92.9 Cloruri99.5 Bicarbonato99.9 Glucosio100 Albumina95-99 Urea50-60 Creatinina0 (o negativo)

Riassorbimento tubulare e secrezione di sostanze organiche Attivo –Glucosio –Aminoacidi –Proteine (pinocitosi) –3 sistemi secretori finora identificati: per acidi organici (per es. Penicilline) per basi organiche forti (per EDTA)

Passivo –Urea: segue lacqua e, perciò, segue Na + & Cl - lenta diffusione attraverso la membrana, per cui vi è una escrezione netta. Flusso più rapido causa una maggiore escrezione. –Acidi e basi deboli: Diffusione non-ionica attraverso i lipidi della membrana. Riassorbimento tubulare e secrezione di sostanze organiche

Regolazione dellequilibrio acido-base Secrezione attiva di ioni idrogeno –Asse renina-aldosterone Riassorbimento di bicarbonato. Generazione di bicarbonato. Generazione di ammoniaca.

Recupero di Bicarbonato Carbonico Deidratasi o Anidrasi è lenzima chiave* H + scambiati con Na + H + + HCO 3 - = H 2 CO 3 H 2 CO 3 * H 2 O +CO 2 CO 2 per diffusione rientra nelle cellule dove si forma più bicarbonato

Generazione di HCO 3 - Idrogenioni scambiati con sodio ma intrappolati per interazione con sistemi tampone presenti nel filtrato (B - ) Perdita netta di H +

Generazione di ammoniaca Glutamina diretta verso la Gluconeogenesi NH 3 intrappolata nel filtrato dalla reazione con idrogenioni

Funzioni endocrine del rene Ormoni prodotti a livello renale –Renina (apparato iuxta-glomerulare) –Callikreina –Prostaglandine –Medullolipina (azione anti-ipertensiva, renal medullary vasodepressor) –1,25 di-idrossi-colecalciferolo (vitamina D3) –eritropoietina

Perchè valutare la funzionalità renale? Per identificare una disfunzione renale. Per diagnosticare una malattia renale. Per monitorare la progressione della malattia. Per monitorare la risposta al trattamento. Per valutare alterazioni della funzionalità che possono influenzare alcune terapie (per es., digossina, chemioterapia).

Segni e sintomi di insufficienza renale Sintomi delluremia (accumulo di prodotti tossici) (nausea, vomito, letargia) Disordini della minzione (frequenza, nocturia, ritenzione, disuria) Disordini del volume di urine (poliuria, oliguria, anuria) Alterazioni della composizione delle urine (ematuria, proteinuria, bacteriuria, leucocituria, calcoli) Dolore Edema (ipoalbuminemia, ritenzione di acqua e sali)

Indagini biochimiche di funzionalità renale Esame delle urine –Aspetto e colore (sangue, torbidità) –Osmolalità e peso specifico –pH (di solito acido) –Glucosio / Corpi chetonici –Proteine –Analisi del sedimento (cellule, batteri, cristalli, cilindri*) *particelle che si formano come stampo mucoproteico dei tubuli del nefrone Misurazione del filtrato glomerulare (GFR glomerular filtration rate): capacità del rene di rimuovere prodotti del catabolismo dal sangue –Test di clearance –Creatinina (insieme con urea e altri nitro-composti costituisce l'azotemia) Test di funzionalità tubulare

Analisi delle urine Glucosio –Aumento del glucosio plasmatico –Bassa soglia renale o altri disordini dei tubuli Proteinuria –Normale 300mg/L –Cause: - Iperafflusso (aumento di proteine a basso PM nel plasma) Perdita glomerulare Ridotto riassorbimento tubulare Proteine di origine renale

Determinazione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR ) Analisi più frequentemente utilizzata per valutare la funzionalità renale. La misurazione è basata sul concetto di clearance: determinazione del volume di plasma dal quale una sostanza viene rimossa attraverso la filtrazione glomerulare

Determinazione della Clearance Clearance = (U xV)/P ove U è la concentrazione urinaria della sostanza x V è la velocità di formazione delle urine (mL/min) P è la concentrazione plasmatica della sostanza x Unità di misura = volume/unità di tempo (mL/min) Clearance = GFR, allora la sostanza x deve possedere le seguenti proprietà: - –viene filtrata liberamente dal glomerulo –il glomerulo rappresenta lunica via di escrezione dal corpo (no secrezione o riassorbimento tubulare) –non è tossica ed è facilmente misurabile

1-2% della creatina muscolare viene convertita a creatinina ogni giorno La quantità prodotta è correlata alla massa muscolare Viene liberamente filtrata a livello glomerulare Lieve escrezione tubulare Clearance della creatinina

Raccolta temporizzata delle urine per la determinazione della creatininuria (di solito 24h) Un campione di sangue prelevato entro il periodo di raccolta delle urine Problemi: - problemi pratici di unaccurata raccolta delle urine Variabilità intra-soggetto = 11%, Differenza critica = 33% Interferenze sulla misurazione della creatinina (reazione di Jaffè: bilirubina, Hb, sostanze ossido-riducenti) Clearance della creatinina

Concentrazione plasmatica della Creatinina Difficoltà: - La concentrazione dipende dal bilancio tra entrate ed uscite. La produzione è determinata dalla massa muscolare, correlata a età, sesso e peso corporeo. Elevata variabilità inter-individuale nella popolazione a fronte di una minore variabilità intra-soggetto. La concentrazione è inversamente proporzionale al GFR. –Piccole variazioni della creatinina portano a grandi variazioni del GFR.

Cistatina-C Newman et al Kidney Int 1995;47: Inibitore della cisteina-proteinasi C (PM 13000) Liberamente filtrato dal glomerulo Produzione costante da parte di tutte le cellule nucleate Non note vie di escrezione extra-renali Non influenzata dalla massa muscolare, dalla dieta o dal sesso La concentrazione sierica ha una forte correlazione negativa con il GFR

Il marcatore endogeno ideale di GFR Tasso di produzione costante (creatinina dipende da massa muscolare, sesso, dieta, esercizio fisico,…) Rimosso dal circolo solo per filtrazione glomerulare (la creatinina viene eliminata anche per via intestinale e cutanea) Liberamente filtrato a livello glomerulare (è lunico criterio soddisfatto dalla creatinina) Non riassorbito nè secreto dai tubuli renali (la creatinina ha un certo grado di riassorbimento e secrezione tubulare) La cistatina C soddisfa tutti i 4 criteri, richiede solo un prelievo di sangue, ma è un test più costoso ed ancora poco conosciuto …

Test di funzionalità tubulare (poco usati) N-acetyl- -D-glucosaminidase (NAG) Tubulo prossimale –Riassorbimento di fosfati –Aminoaciduria –Glicosuria –Escrezionale frazionale di HCO 3 - Tubulo distale –Acidificazione (carico con cloruro dammonio) –Concentrazione

Microalbuminuria – rapporto albumina:creatinina (ACR) 2.5 mg/mmol (uomo) or 3.5 mg/mmol (donna) o albumina 20 mg/l Proteinuria – rapporto albumina:creatinina 30 mg/mmol o - albumina 200 mg/l

Insufficienza renale acuta Ritenzione di: - –Urea & creatinina –Na & acqua –Potassio (iperkaliemia) –Acidi (acidosi metabolica) Cause: Pre-renali –Ridotta perfusione Intrinsiche renali –vascolari –infiammatorie –infiltrative –tossicità Post-renali –ostruzione

Definizione di insufficienza renale cronica

Insufficienza renale cronica: Cause Glomerulonefrite Diabete mellito Ipertensione Pielonefrite cronica Rene policistico Etc.

Alterazioni degli esami di laboratorio nellinsufficienza renale cronica Aumento di creatinina Iperkaliemia Acidosi metabolica Ipocalcemia Iperfosfatemia Osteodistrofia (aumento della fosfatasi alcalina) Anemia normocromica normocitica