Dalla sequenza alla struttura

Presentazione sul tema: "Dalla sequenza alla struttura"— Transcript della presentazione:

1 Dalla sequenza alla struttura

2 Dalla sequenza alla struttura
VLSEGEWQLVLV O2 Sequenza Struttura Funzione

3 Che informazioni offre la struttura?
Conformazione dei siti attivi e di legame Orientazione dei residui conservati Interpretazione di meccanismi Visualizzazione di cavità Calcolo di potenziale elettrostatico …

4 Esempio FtsZ – divisione cellulare in procarioti, mitocondri e cloroplasti. Tubulina – componente strutturale dei microtubuli – comunicazione intracellulare e divisione cellulare. FtsZ e Tubulina hanno bassa similarità di sequenza e non sembrerebbero omologhe.

5 FtsZ e tubulina sono omologhe?
Proteine che hanno conservato la struttura tridimensionale possono derivare da un progenitore comune anche se la divergenza della sequenza non permette più di riconoscere l’omologia.

6 Burns, R., Nature 391: Picture from E. Nogales

7 Un altro esempio α-lattalbumina e lisozima possiedono: Stesso fold
Moderata similarità Diversa funzione

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9 ALA TRP PRO

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11 Esempi di folding: up-and-down barrel greek key jelly-roll

12 Domìni

13 Struttura quaternaria

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17 Cristallografia a raggi X
Ottenere cristalli della proteina mm Le singole molecole sono ordinate in modo periodico, ripetitivo. La struttura è determinata dai dati di diffrazione.

18 Diffrazione a raggi X

19 Image from http://www-structure.llnl.gov/Xray/101index.html

20 Schmid, M. Trends in Microbiology, 10:s27-s31.

21 Cristallografia a raggi X
Le proteine devono cristallizzare Grande quantità Solubili Accesso a radiazione adatta Tempo di calcolo per risolvere la struttura

22 Instrumentation or synchrotron X-rays

23 Instrumentation ESRF - Grenoble

24 Instrumentation Elettra - Trieste

25 Dalla densità elettronica al modello strutturale
= Densità iniziale Interpretazione Struttura 3D La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione. • La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.

26 Risoluzione

27 NOE (Nuclear Overhauser Effect)
NMR Campo magnetico NOE (Nuclear Overhauser Effect)

28 Il campo magnetico Magnete a 400 MHz Magnete a 900 MHz
Costo commerciale di uno spettrometro a 900 MHz: ca. 5 M € n. di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10

29 Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)
Proteine in soluzione Limite di dimensione ~ 40 kDa Proteine stabili a lungo Marcatura con 15N, 13C, 2H. Strumentazione molto costosa Tempo per assegnare le risonanze

30 Regions of the 1H NMR Spectrum are Further Dispersed by the 3D Fold
What would the unfolded protein look like?

31 Resolve Peaks By Multi-D NMR
A BONUSregions in 2D spectra provide protein fingerprints If 2D cross peaks overlap go to 3D or 4D …..

32 Conformational Ensemble Representing an NMR Structure

33 Pro e contro X-ray NMR Richiede cristalli, problematico
Non ha limiti (teorici) di grandezza Piú preciso Risoluzione Struttura può essere deformata dai cristalli, rigida Una “soluzione“ NMR Possibile in soluzione, più semplice Limitato a proteine fino a circa 300 residui Meno preciso Numero di vincoli Struttura nativa in soluzione, flessibile Molti modelli

34 X-ray NMR

35 Protein Data Bank (PDB)
URL: Coordinate 3-D di strutture proteiche Formato unico Tutte le strutture risolte con i raggi X e NMR Più vecchia della maggior parte degli altri database Strutturata male a causa dello sviluppo storico

36 Il Protein Data Bank

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40 Crescita del PDB

41 Motivi strutturali depositati ogni anno

42 Superfamiglie depositate ogni anno

43 Formato PDB I HEADER ONCOGENE PROTEIN 06-JUN-91 121P 121P 2
COMPND H-RAS P21 PROTEIN COMPLEX WITH GUANOSINE-5'-[B,G-METHYLENE] 121P 3 COMPND 2 TRIPHOSPHATE P 4 SOURCE HUMAN (HOMO SAPIENS) CELLULAR HARVEY-RAS GENE TRUNCATED AND 121P 5 SOURCE 2 EXPRESSED IN (ESCHERICHIA COLI) P 6 AUTHOR U.KRENGEL,K.SCHEFFZEK,A.SCHERER,W.KABSCH,A.WITTINGHOFER, P 7 AUTHOR 2 E.F.PAI P 8 ... REMARK P 17 REMARK 1 REFERENCE P 18 REMARK 1 AUTH U.KRENGEL,I.SCHLICHTING,A.SCHEIDIG,M.FRECH,J.JOHN, 121P 19 REMARK 1 AUTH 2 A.LAUTWEIN,F.WITTINGHOFER,W.KABSCH,E.F.PAI P 20 REMARK 1 TITL THE THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE OF P21 IN THE P 21 REMARK 1 TITL 2 CATALYTICALLY ACTIVE CONFORMATION AND ANALYSIS OF P 22 REMARK 1 TITL 3 ONCOGENIC MUTANTS P 23 REMARK 1 REF NATO ASI SER.,SER.A V P 24 REMARK 1 REFN ASTM NALSDJ US ISSN P 25 SEQRES MET THR GLU TYR LYS LEU VAL VAL VAL GLY ALA GLY GLY 121P 56 SEQRES VAL GLY LYS SER ALA LEU THR ILE GLN LEU ILE GLN ASN 121P 57 SEQRES HIS PHE VAL ASP GLU TYR ASP PRO THR ILE GLU ASP SER 121P 58

44 Formato PDB II X Y Z B-factor HELIX 1 A1 LYS 16 GLN 25 1 121P 80
HELIX 2 A2 SER THR P 81 ... SHEET 1 S 6 GLU ILE P 85 SHEET 2 S 6 GLU THR O LEU N LYS P 86 SHEET 3 S 6 THR VAL N LEU O ASP P 87 TURN T1 ALA VAL P 91 TURN T2 ILE GLU P 92 TURN T3 ALA ASN P 93 ATOM N MET P 104 ATOM CA MET P 105 ATOM C MET P 106 ATOM O MET P 107 ATOM CB MET P 108 ATOM CG MET P 109 ATOM SD MET P 110 ATOM CE MET P 111 ATOM N THR P 112 ATOM CA THR P 113 ATOM C THR P 114 HETATM PG GTO P1427 HETATM O1G GTO P1428 HETATM O2G GTO P1429 HETATM O3G GTO P1430 X Y Z B-factor

45 ATOM CA GLU HXN 170 ATOM C GLU HXN 171 ATOM O GLU HXN 172 ATOM N SER HXN 173 ATOM CA SER HXN 174 ATOM C SER HXN 175 ATOM O SER HXN 176 ATOM CB SER HXN 177 ATOM OG SER HXN 178 ATOM N THR HXN 179 ATOM CA THR HXN 180 ATOM C THR HXN 181 ATOM O THR HXN 182 ATOM CB THR HXN 183 ATOM OG1 THR HXN 184 ATOM CG2 THR HXN 185

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