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FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI Sono un gruppo.

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1 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano sulla interazione di radiazione elettromagnetica con la materia Da tempo sono tra i metodi di rivelazione e quantificazione più impiegati in Chimica Analitica Clinica Esistono diversi tipi di metodi, basati sia su interazioni con specie molecolari che atomiche Assorbimento: la luce viene assorbita da un atomo, ione o molecola portandoli ad un più alto stato di energia Emissione: rilascio di un fotone da parte di un atomo, ione o molecola portandoli ad un più basso stato di energia

2 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA MECCANISMO DELLINTERAZIONE Assorbimento: la luce viene assorbita da un atomo, ione o molecola portandoli ad un più alto stato di energia Emissione: rilascio di un fotone da parte di un atomo, ione o molecola portandoli ad un più basso stato di energia In funzione del tipo di interazione utilizzato, possiamo distinguere metodi di assorbimento e di emissione.

3 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA LE RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA

4 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA LA RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA Energia del fotone = h h = costante di Planck (6,626 x J s) = frequenza (s -1 ) Allaumentare di la frequenza e lenergia del fotone diminuiscono = c c = velocità della luce Unità di più comuni: nm = m Å = m m = m

5 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA LA RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA TipoLunghezza dondaEnergiaInterazione < 0,1 nmemissione nucleare raggi X0,1-10 nmtransizioni elettroniche (elettroni interni) UV nmtransizioni elettroniche (elettroni di valenza) Vis nmtransizioni elettroniche (elettroni di valenza) IR800 nm-100 mtransizioni vibrazionali Microonde100 m- 1 cmtransizioni rotazionali onde radio1 cm- metriassorbimento nucleare

6 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA LO SPETTRO ELETTROMAGNETICO = c / E = h Energia Ultravioletto Visibile Infrarosso Raggi cosmiciRaggi gamma Raggi XUltravioletto VisibileInfrarosso Microonde RadarTelevisione NMR RadioUltrasuoni Suoni (udibile) Infrasuoni Frequenza [Hz] Lunghezza donda [m]

7 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO Una sostanza assorbe la luce solo quando lenergia della radiazione corrisponde a quella necessaria per far avvenire una transizione Le transizioni possono essere: Elettroniche Vibrazionali Rotazionali Le ultime due riguardano solo le molecole

8 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Transizioni elettroniche Provocano modifiche nella distribuzione degli elettroni di un atomo o di una molecola: Molecola (ridistribuzione degli elettroni negli orbitali molecolari) * n n* Atomo (ridistribuzione degli elettroni negli orbitali atomici) IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO

9 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA SPETTRO DI ASSORBIMENTO ATOMICO Anche con atomi, che è il caso più semplice, si ha un processo di assorbimento relativamente complesso. Latomo di idrogeno presenta uno spettro di assorbimento a righe complesso dovuto a transizioni elettroniche allinterno dei sottolivelli s,p,d,f

10 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Lassorbimento della luce da parte delle molecole è un processo molto complesso In una molecola ogni livello di energia elettronica è suddiviso in un certo numero di sottolivelli vibrazionali In aggiunta ciascun sottolivello vibrazionale è ulteriormente suddiviso in sottolivelli rotazionali IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO

11 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Transizioni vibrazionali Causano modifiche nella lunghezza di un legame e quindi nella separazione media di due nuclei (IR) A B A B Transizioni rotazionali Causano modifiche dellenergia di una molecola quando essa ruota rispetto al suo centro di gravità (microonde) A----B A----B IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO

12 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO Livelli Elettronici (interazioni UV) Sotto-livelli Vibrazionali (interazioni IR) Sotto-livelli Rotazionali (interazioni microonde)

13 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Linterazione con una molecola e lassorbimento coinvolgono quindi non solo livelli elettronici, ma anche sotto-livelli vibrazionali e rotazionali. Le interazioni con altre molecole avranno anchesse un effetto, con il risultato che lo spettro di assorbimento sarà a bande (ci saranno talmente tante transizioni che sarà impossibile distinguere le une dalle altre). ASSORBIMENTO MOLECOLARE

14 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE ASSORBIMENTO MOLECOLARE E S0S0 S1S1 S2S2 I Energia dei livelli elettronici Energia dei livelli vibrazionali Energia dei livelli rotazionali Transizioni elettroniche

15 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA UV/Vis, IR La identificazione di un composto si può effettuare sulla base del suo spettro di assorbimento, mediante confronto con lo spettro di un materiale noto o di uno standard di riferimento. Ciò viene fatto principalmente con la tecnica IR poiché lo spettro IR contiene più informazioni rispetto a quello UV e Vis. ANALISI QUALITATIVA

16 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Lassorbimento di radiazioni nel UV, Vis e IR copre un ampio range di lunghezze donda. Eseguendo una scansione, cioè misurando lassorbimento alle diverse lunghezze donda, si ottiene lo spettro di assorbimento della sostanza in esame SPETTRI UV/Vis, IR Esempio di spettro di assorbimento molecolare: Lunghezza donda UVVisible Near IR ANALISI QUALITATIVA

17 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Locchio umano vede il colore complementare di quello assorbito COLORE E TRASMISSIONE DELLA LUCE

18 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA ASSORBIMENTO E COLORE COMPLEMENTARE rosso arancio giallo-verde verde verde-bluastro blu-verdastro blu violetto blu-verde blu-verdastro porpora rosso-porpora rosso arancio giallo giallo-verde Lunghezza donda (nm)Colore assorbitoColore complementare

19 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Lanalisi quantitativa spettrofotometrica è basata principalmente sullo studio degli spettri UV/Vis. La legge fondamentale su cui si basano i metodi di assorbimento è quella di Lambert e Beer. Questa legge dice che: la quantità di luce assorbita da una soluzione è funzione della concentrazione della sostanza assorbente e della lunghezza del cammino ottico. ANALISI QUANTITATIVA

20 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Dove: P = potenza della radiazione incidente N = numero di molecole che assorbono nel cammino ottico K = costante di proporzionalità ANALISI QUANTITATIVA PP - dP dN

21 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA ANALISI QUANTITATIVA

22 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA ANALISI QUANTITATIVA Poiché N dipende sia dalla concentrazione c che dal cammino ottico b si ha: K è comunemente definita come assorbività ed include anche il termine di conversione dei logaritmi da base e a base 10:

23 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA P/P 0 è anche denominata Trasmittanza (T) -logT = A dove A viene definita Assorbanza A = bc Il rapporto P/P 0 è la misura della luce che passa attraverso la soluzione e non viene assorbita ANALISI QUANTITATIVA P0P0 c b P

24 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Lassorbanza è il termine utilizzato nellequazione di Lambert e Beer, ma in realtà è la trasmittanza che viene direttamente misurata dalle strumento ASSORBANZA vs TRASMITTANZA Assorbanza % Trasmittanza

25 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Ogni strumento presenta caratteristiche diverse quindi è meglio determinare lassorbività utilizzando standard E possibile utilizzare qualsiasi unità di concentrazione: Molarità, Normalità, ppm, ecc. Se la concentrazione viene espressa in Molarità ed il cammino ottico in cm, lassorbività viene definita come assorbività molare ( ) ed ha unità M -1 cm -1 DETERMINAZIONE DELLA ASSORBIVITA

26 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA I calcoli relativi allassorbanza sono relativamente semplici La determinazione della concentrazione di una soluzione può essere effettuata mediante due approcci di base: 1.Lassorbività della sostanza è nota od è stata già determinata mediante standards 1.Metodo del rapporto: si basa sulla misura dellassorbanza di uno standard noto e del campione incognito ALTRI ESEMPI

27 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA EQUAZIONI FONDAMENTALI

28 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA LA LEGGE DI LAMBERT E BEER Concentrazione Assorbanza

29 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA In genere si cerca di eseguire le misure al valore della lunghezza donda corrispondente al massimo dellassorbanza ( max ) Questo è il punto di massima risposta corrispondente alla più alta sensibilità e più basso limite di rivelazione Permette inoltre di ridurre il più possibile lerrore associato alla misura legato ad una eventuale scarsa riproducibilità della lunghezza donda MISURA DELL ASSORBANZA

30 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Se si ha una piccola variazione di durante le misure e non si è al valore di max si potrebbe ottenere una notevole variazione nella risposta. MISURA DELL ASSORBANZA Piccolo errore Piccolo errore Grande errore Grande errore Stessa variazione di lunghezza donda Stessa variazione di lunghezza donda

31 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Deviazione dalla relazione lineare Molte sostanze danno una risposta lineare solo in un certo ambito di concentrazione. MISURA DELL ASSORBANZA Il metodo deve essere utilizzato solo in questo ambito Ambito lineare

32 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA MISURA DELL ASSORBANZA Questo segnale potrebbe essere dovuto al fondo, ad una interferenza o ad una mancanza di sensibilità Questo segnale potrebbe essere dovuto ad un auto-assorbimento o ad un insufficiente passaggio della luce attraverso la soluzione Ambito lineare

33 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA La scelta di una lunghezza donda in una spalla dello spettro di assorbimento può aumentare lambito dinamico di un metodo evitando anche fasi di diluizione del campione. La sensibilità e la precisione possono essere però in parte compromesse. COME AUMENTARE LAMBITO DINAMICO Assorbanza (AU) Assorbanza misurata (AU) Lunghezza donda (nm)Concentrazione (mg/ml) Spironolattone mg/ml

34 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Sebbene nella legge di Lambert e Beer compaia lassorbanza della soluzione, la grandezza fisica che viene effettivamente misurata è la trasmittanza. Lerrore nella determinazione di una concentrazione mediante una misura spettrofotometrica ( c) è quindi legato allerrore che si ha nella misura della trasmittanza ( T). Applicando la legge sulla propagazione degli errori alla legge di Lambert e Beer si ha: c/c = ( / TlogT) T ERRORE NELLA MISURA DELL ASSORBANZA

35 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Landamento di c/c in funzione di T è il seguente: E consigliabile quindi operare in un ambito di trasmittanza compreso tra %T al fine di minimizzare lerrore spettrofotmetrico. Errore relativo in funzione della %T Errore relativo su conc. 80% 20% %T ERRORE NELLA MISURA DELL ASSORBANZA

36 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Con il termine luminescenza si indicano tutti quei processi (fluorescenza, fosforescenza) che comportano lemissione di radiazione da parte delle molecole. La luminescenza può essere indotta da diversi processi, fra i quali lassorbimento di radiazione. In tal caso si parla di fluorescenza e fosforescenza, che si verificano ad una energia inferiore a quella alla quale la radiazione viene assorbita, e lo spettro di emissione è approssimativamente limmagine speculare di quello di assorbimento. Intensità di emissione (M -1 cm -1 ) assorbimentoemissione SPETTROFLUORIMETRIA-LUMINESCENZA

37 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA SPETTRO DI FLUORESCENZA

38 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA E possibile dimostrare che, quando lassorbanza della soluzione è sufficientemente bassa (A 0,05) esiste una proporzionalità diretta fra lintensità dellemissione P F e la concentrazione: dove P 0 è la potenza della radiazione incidente e k è una costante che contiene, fra laltro, il valore della resa quantica di emissione dellanalita Le misure di emissione non sono misure assolute: le intensità di emissione ottenute su diversi strumenti non sono in genere confrontabili fra di loro Per effettuare misure quantitative è quindi indispensabile utilizzare una curva di calibrazione concentrazione PFPF A 0,05 ASPETTI QUANTITATIVI Inoltre è possibile aumentare lintensità del segnale di emissione aumentando la potenza della radiazione di eccitazione (in assorbimento il segnale è invece indipendente dalla potenza della radiazione utilizzata)

39 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA SPETTROFLUORIMETRIA vs. SPETTROFOTOMETRIA SpettrofotometriaSpettrofluorimetria ApplicabilitàAmpiaRistretta (relativamente poche sostanze emettono) Intervallo di linearitàAmpioRistretto Sensibilità (oppure Media Elevata limite di rivelazione) (è possibile utilizzare rivelatori più sensibili o aumentare P 0 )

40 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Si parla di chemiluminescenza quando lemissione non è indotta da assorbimento di radiazione ma da una reazione chimica. Il numero di analiti naturalmente luminescenti è relativamente ristretto. In molti casi è però possibile rendere luminescenti analiti non emittenti mediante derivatizzazione, ovvero attraverso una reazione chimica indicatrice che comporta il legame dellanalita ad una specie luminescente. APPLICAZIONI DELLA LUMINESCENZA A + B C * C + h - Luminol (used to detect blood) - phenyl oxalate ester (glow sticks)

41 FACOLTA DI SCIENZE FF.MM.NN. – EUROBACHELOR IN CHIMICA E CHIMICA DEI MATERIALI - CHIMICA ANALITICA Luciferin (firefly) Glowing Plants Luciferase gene cloned into plants Bioluminescenza APPLICAZIONI DELLA LUMINESCENZA


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