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La regolazione dellespressione genica Anno scolastico 2005/06.

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Presentazione sul tema: "La regolazione dellespressione genica Anno scolastico 2005/06."— Transcript della presentazione:

1 La regolazione dellespressione genica Anno scolastico 2005/06

2 Il cromosoma procariote E formato da una catena continua (circolare) di DNA a doppio filamento dello spessore di 2 nm di diametro; in E.coli contiene quasi 4,7 milioni di coppie di basi azotate ed è lungo più di 1 mm se completamente svolto. E formato da una catena continua (circolare) di DNA a doppio filamento dello spessore di 2 nm di diametro; in E.coli contiene quasi 4,7 milioni di coppie di basi azotate ed è lungo più di 1 mm se completamente svolto.

3 I controllori dei geni Le cellule controllano lespressione genica, ossia quali prodotti genici si ottengono, quando e in quali quantità. Le cellule controllano lespressione genica, ossia quali prodotti genici si ottengono, quando e in quali quantità. Proteine regolatrici e molecole segnale (come gli ormoni) appartengono ai sistemi di controllo: interagiscono tra loro, con il DNA, con lRNA, con i prodotti genici Proteine regolatrici e molecole segnale (come gli ormoni) appartengono ai sistemi di controllo: interagiscono tra loro, con il DNA, con lRNA, con i prodotti genici I sistemi di controllo negativi bloccano unattività cellulare, quelli positivi la promuovono; i loro effetti sono reversibili I sistemi di controllo negativi bloccano unattività cellulare, quelli positivi la promuovono; i loro effetti sono reversibili

4 I sistemi di controllo nei procarioti Sono a breve termine e riguardano soprattutto la velocità di trascrizione degli enzimi che agiscono nella digestione e nelle altre attività correlate alla crescita Sono a breve termine e riguardano soprattutto la velocità di trascrizione degli enzimi che agiscono nella digestione e nelle altre attività correlate alla crescita Il modello è quello delloperone studiato da Jacob e Monod Il modello è quello delloperone studiato da Jacob e Monod Francois Jacob, Jacques Monod, Andrè Lwoff gli scienziati francesi che hanno studiato la regolazione genica e formulato il modello delloperone (Nobel 1965)

5 Operone batterico I geni vengono distinti in regolatori e strutturali Geni regolatori codificano per proteine che gestiscono il programma (repressori o induttori della sintesi di proteine enzimatiche) Geni regolatori codificano per proteine che gestiscono il programma (repressori o induttori della sintesi di proteine enzimatiche) Geni strutturali codificano per le proteine enzimatiche. Geni strutturali codificano per le proteine enzimatiche. OPERONE gruppo di geni che sintetizzano enzimi coinvolti in una catena di reazioni controllati dagli stessi geni regolatori OPERONE gruppo di geni che sintetizzano enzimi coinvolti in una catena di reazioni controllati dagli stessi geni regolatori

6 Il lattosio Il lattosio è un disaccaride formato da galattosio e glucosio Rappresenta per la cellula una fonte di glucosio da cui ricavare energia Lutilizzo del lattosio da parte del batterio richiede più enzimi (βgalattossidasi, permeasi) codificati da geni strutturali controllati dagli stessi geni regolatori = operone lac

7 Operone per il lattosio GENI regolatore promotore operatoreGeni strutturali RNApolimerasi DNA RNA Proteina repressore attiva repressore inattiva lattosio RNA trascrizione traduzione Il gene regolatore sintetizza la proteina repressore; può essere anche lontano dalloperone

8 Successione eventi: la repressione repressore attivato Induttore (lattosio) repressore legato alloperatore RNA polimerasi non può legarsi: trascrizione bloccata Il repressore viene codificato da un gene regolatore Promotore lac 1- in assenza del substrato (lattosio) la proteina repressore si lega a un tratto di DNA (gene operatore) e blocca laccesso alla RNApolimerasi al gene promotore dal quale inizia la trascrizione dei geni strutturali

9 Induttore (substrato) legato al repressore RNApolimerasi si lega al promotore Inizia la trascrizione dei geni strutturali mRNA trascritto 2- In presenza del substrato (induttore), questo si lega alla proteina repressore e libera loperatore. 3- RNApolimerasi si lega alloperatore e inizia la trascrizione Linduzione

10 Operone per il triptofano E controllato da un repressore che è inattivo quando si trova da solo, per essere attivo deve combinarsi con il triptofano, un aminoacido essenziale per la sintesi proteica. E controllato da un repressore che è inattivo quando si trova da solo, per essere attivo deve combinarsi con il triptofano, un aminoacido essenziale per la sintesi proteica. Se occorre E.coli può produrre autonomamente il triptofano ma, quando è possibile lo assorbe direttamente dallambiente Se occorre E.coli può produrre autonomamente il triptofano ma, quando è possibile lo assorbe direttamente dallambiente

11 Operone con induttori Gli induttori agiscono rendendo più facile per lRNA polimerasi il legame con il promotore, invece che bloccare lRNA polimerasi come fanno i repressori Gli induttori agiscono rendendo più facile per lRNA polimerasi il legame con il promotore, invece che bloccare lRNA polimerasi come fanno i repressori

12 Sistemi di controllo negli eucarioti Negli eucarioti esistono anche sistemi di controllo a lungo termine e la regolazione genica è più complessa. Negli eucarioti esistono anche sistemi di controllo a lungo termine e la regolazione genica è più complessa. Il differenziamento cellulare è la conseguenza di un espressione selettiva dei geni nelle diverse cellule Il differenziamento cellulare è la conseguenza di un espressione selettiva dei geni nelle diverse cellule Il controllo si effettua prima, durante e dopo la trascrizione Il controllo si effettua prima, durante e dopo la trascrizione

13 Lespressione dei geni può essere regolata a diversi livelli nella via che porta da DNA a RNA DNARNA transcriptmRNA mRNA inattivo Proteina NUCLEO CITOPLASMA 1 Controllo di trascrizione 2 RNA processing 3 RNA trasporto 4 controllo traduzione 5 mRNA degradazione

14 Geni e loro funzioni Gene regolatore Gene regolatore Gene promotore Gene promotore Gene operatore Gene operatore Geni strutturali Geni strutturali Proteina repressore Proteina repressore Sito di avvio della trascrizione del DNA in mRNA Sito di avvio della trascrizione del DNA in mRNA Sito di inserimento per repressore: blocco della sintesi dell mRNA Sito di inserimento per repressore: blocco della sintesi dell mRNA enzimi enzimi RNA polimerasi promotore operatore

15 Il cromosoma eucariote Per stare in queste ridotte dimensione il DNA utilizza delle strutture proteiche attorno alla quale si compatta (istoni e proteine non istoni). I nucleosomi sono formati da un ottamero di istoni e su ognuno di essi si avvolge un filamento di DNA contenete 200bp. Essi poi si condensano ulteriormente in nucleofilamenti che si associano in anse su una struttura polisaccaridica detta Scaffold.

16 I livelli di condensazione della cromatina: schema che illustra le immagini al microscopio elettronico a trasmissione Il DNA della cellula interfasica forma delle anse su proteine Impalcatura.

17 Le cellule specializzate conservano tutto il loro potenziale genetico Esperimento di J.B.Gurdon: asporta i nuclei di cellule intestinali di girino e li impianta in cellule uovo di rana private del proprio nucleo. Esperimento di J.B.Gurdon: asporta i nuclei di cellule intestinali di girino e li impianta in cellule uovo di rana private del proprio nucleo. Le cellule uovo danno origine a nuove rane con le caratteristiche del girino donatore del nucleo i nuclei delle cellule intestinali contengono tutte le informazioni necessarie per tutte le cellule dellorganismo Le cellule uovo danno origine a nuove rane con le caratteristiche del girino donatore del nucleo i nuclei delle cellule intestinali contengono tutte le informazioni necessarie per tutte le cellule dellorganismo

18 Condensazione del cromosoma ed espressione genica Lespressione genica è correlata al grado di condensazione del cromosoma Lespressione genica è correlata al grado di condensazione del cromosoma La cromatina che durante linterfase si despiralizza maggiormente è detta eucromatina, mentre quella che rimane più condensata e non viene trascritta è detta eterocromatina La cromatina che durante linterfase si despiralizza maggiormente è detta eucromatina, mentre quella che rimane più condensata e non viene trascritta è detta eterocromatina Uno dei 2 cromosomi X delle femmine di mammifero rimane sempre spiralizzato (corpo di Barr) Uno dei 2 cromosomi X delle femmine di mammifero rimane sempre spiralizzato (corpo di Barr)

19 Leterocromatina, ossia la cromatina più condensata dei nuclei interfasici, deriva dalla complessazione con proteine non istoniche. Ad esempio, a livello dei telomeri si legano alcune proteine che silenziano una regione più ampia di DNA

20 Gatta calicot Nelle sue cellule un cromosoma X porta lallele dominante per la melanina, mentre laltro specifica la pelliccia gialla Nelle sue cellule un cromosoma X porta lallele dominante per la melanina, mentre laltro specifica la pelliccia gialla Allo stadio di embrione, uno dei due cromosomi è stato disattivato in modo casuale in ciascuna delle cellule presenti in quel momento. Allo stadio di embrione, uno dei due cromosomi è stato disattivato in modo casuale in ciascuna delle cellule presenti in quel momento. In tutti i discendenti di quelle cellule è rimasto disattivato lo stesso cromosoma, lasciando funzionante un solo allele per il colore della pelliccia. In tutti i discendenti di quelle cellule è rimasto disattivato lo stesso cromosoma, lasciando funzionante un solo allele per il colore della pelliccia. Le macchie di colore differente dipendono da quale allele è stato disattivato Le macchie di colore differente dipendono da quale allele è stato disattivato

21 Cromosomi giganti Le cellule salivari delle larve di ditteri mostrano dei cromosomi giganti (per duplicazioni successive di DNA non seguite da divisione cellulare) Le cellule salivari delle larve di ditteri mostrano dei cromosomi giganti (per duplicazioni successive di DNA non seguite da divisione cellulare) Questi si presentano a bande scure e chiare, indice di una diversa condensazione del DNA e mostrano dei rigonfiamenti (puff) la cui posizione varia nel corso dello sviluppo Questi si presentano a bande scure e chiare, indice di una diversa condensazione del DNA e mostrano dei rigonfiamenti (puff) la cui posizione varia nel corso dello sviluppo I puff corrispondono a regioni di intensa sintesi di RNA e sono il segnale visibile dellattivazione e disattivazione di specifici geni durante lo sviluppo I puff corrispondono a regioni di intensa sintesi di RNA e sono il segnale visibile dellattivazione e disattivazione di specifici geni durante lo sviluppo

22 Fattori di trascrizione Un gene che codifica per una proteina può possedere un grande assortimento di sequenze di DNA coinvolte nella regolazione della trascrizione. Queste sequenze vengono definite elementi di regolazione e possono essere localizzate sia a monte sia a valle del punto dinizio della trascrizione dellRNA. Questi elementi regolatori possono legare dei fattori trascrizionali specifici,cioè proteine coinvolte nellattivazione o nella repressione della trascrizione di un gene. Gli elementi regolatori in posizione più distale sono chiamati enhancers e sono necessari per ottenere il massimo grado di trascrizione per un dato gene. Esistono degli elementi, chiamati silencer, che hanno caratteristiche simili agli enhancer, ma che reprimono la trascrizione anziché attivarla.

23 Controllo post-trascrizionale I trascritti primari dei geni che specificano gli RNA sono generalmente delle molecole di RNA precursore o pre-RNA. Terminata la trascrizione, per ottenere degli RNA funzionali, le molecole di pre-RNAdevono essere modificate. Possiamo individuare due tipi di modificazioni principali: Modificazioni chimiche,nelle quali vengono modificate le basi (sia negli eucarioti che nei procarioti). Processamento dellRNA, per il quale sequenze presenti nel pre-RNA sono eliminate in modo specifico e preciso (solo eucarioti).

24 Aggiunta di cappuccio e coda allmRNA Lestremità 5 è modificata dallaggiunta di un cappuccio in seguito ad un processo chiamato 5 CAPPING, questo comporta laggiunta di una guanina (7-metilguanosina) al nucleotide terminale in 5, mediante un insolito legame 5-5, in contrapposizione al consueto legame 5-3.Il CAP serve per il corretto attacco al ribosoma. Allestremità 3 viene aggiunta una sequenza di A importante per la stabilità dellm-RNA

25 Splicing Generalmente lintrone inizia con GU al 5 e finisce con AG al 3. Viene effettuato un taglio alla giunzione in 5. Lestremità 5 libera dellintrone si piega su se stessa formando un occhiello e si unisce ad una A, che fa parte di una sequenza chiamata sequenza del punto di Ramificazione. Taglio al sito di giunzione 3 di splicing e ligazione delle due sequenze codificanti. Il processamento avviene in complessi specifici Spliceosoma costitutite da molecole ribonucleoproteiche

26 Alfa-tropomiosina: splicing alternativo specifico per tessuto

27 Controllo a livello della traduzione Tempo di sopravvivenza dellmRNA: Tempo di sopravvivenza dellmRNA: Può variare da qualche ora a qualche settimana Può variare da qualche ora a qualche settimana maggiore è il tempo di sopravvivenza, più alto è il numero di proteine prodotte maggiore è il tempo di sopravvivenza, più alto è il numero di proteine prodotte Presenza di proteine inibitrici che impediscono la traduzione dellmRNA in proteina (es. produzione di emoglobina in assenza del gruppo eme) Presenza di proteine inibitrici che impediscono la traduzione dellmRNA in proteina (es. produzione di emoglobina in assenza del gruppo eme) Suddivisione del polipeptide in segmenti finali più piccoli e attivi (es. insulina) Suddivisione del polipeptide in segmenti finali più piccoli e attivi (es. insulina) Demolizione selettiva delle proteine Demolizione selettiva delle proteine

28 La disponibilità di fattori della traduzione regola lespressione genica

29 Il silenziamento genico è stato scoperto da botanici che cercavano di rendere più intenso il colore dei petali della petunia: introdussero nelle piantine alcune copie aggiuntive di un gene noto per codificare un enzima chiave nella colorazione dei petali. Sorprendentemente, molte piantine così trattate non presentavano gli attesi colori intensi ma erano privi di colore. Senza volere, disattivando i geni che conferivano colore, avevano scoperto uno dei meccanismi con cui le cellule cercano di eliminare i genomi virali….

30 I MECCANISMI DEL SILENZIAMENTO GENICO (è il caso del colore della petunia) Controllo post-trascrizionale (2 modalità)

31 Piccoli RNA a interferenza e micro-RNA reprimono la traduzione di mRNA bersaglio. I microRNA inibiscono in maniera reversibile la traduzione; gli RNA a interferenza causano la degradazione dellmRNA complementare. Questo meccanismo si è evoluto come difesa nei confronti dei virus.

32 RNA interferenza RNA interferenza è un meccanismo di silenziamento post-trascrizionale: un RNA a doppio-filamento (dsRNA) blocca, in modo specifico, lespressione di geni omologhi attraverso lappaiamento con lmRNA bersaglio e la degradazione dello stesso. Questo processo rappresenta in piante e animali un sistema di difesa naturale contro infezioni causate da virus a RNA, nonché un possibile meccanismo di regolazione dei geni durante la crescita e lo sviluppo. RNA interferenza è un meccanismo di silenziamento post-trascrizionale: un RNA a doppio-filamento (dsRNA) blocca, in modo specifico, lespressione di geni omologhi attraverso lappaiamento con lmRNA bersaglio e la degradazione dello stesso. Questo processo rappresenta in piante e animali un sistema di difesa naturale contro infezioni causate da virus a RNA, nonché un possibile meccanismo di regolazione dei geni durante la crescita e lo sviluppo.

33 Il sistema iRNA La sua scoperta ha permesso ai ricercatori Andrew Fire, docente di patologia e genetica presso la Stanford University, e Craig Mello, ordinario di medicina molecolare alla University of Massachussets, di aggiudicarsi il premio Nobel 2006 per la medicina. La sua scoperta ha permesso ai ricercatori Andrew Fire, docente di patologia e genetica presso la Stanford University, e Craig Mello, ordinario di medicina molecolare alla University of Massachussets, di aggiudicarsi il premio Nobel 2006 per la medicina. Quasi tutte le cellule vegetali e animali hanno meccanismi interni che utilizzano forme insolite di RNA per silenziare in modo naturale i geni a uno a uno mediante l'RNAi. Limportanza di questa scoperta consiste anche nella possibilità mettere a punto di nuovi protocolli terapeutici, basati appunto sul silenziamento di geni collegati a malattie. Quasi tutte le cellule vegetali e animali hanno meccanismi interni che utilizzano forme insolite di RNA per silenziare in modo naturale i geni a uno a uno mediante l'RNAi. Limportanza di questa scoperta consiste anche nella possibilità mettere a punto di nuovi protocolli terapeutici, basati appunto sul silenziamento di geni collegati a malattie. Dagli esperimenti condotti sui vermi nematodi, Fire e Mello hanno scoperto che il meccanismo noto come RNAi viene attivato quando nella cellula sono presenti molecole di RNA a doppio filamento. L'RNA a doppio filamento innesca un processo che degrada le molecole di mRNA che contengono una sequenza complementare a quella dell'RNA a doppio filamento. Quando queste molecole di mRNA scompaiono, il gene corrispondente viene silenziato e non viene prodotta alcuna proteina del tipo codificato. Quando un gene estraneo, virus o trasposone compare nella cellula, questa, riconoscendolo come estraneo, attraverso un meccanismo che ancora non è stato compreso, lo induce a convertire il suo mRNA in RNA a doppio filamento, inducendo di conseguenza la risposta di inibizione. Dagli esperimenti condotti sui vermi nematodi, Fire e Mello hanno scoperto che il meccanismo noto come RNAi viene attivato quando nella cellula sono presenti molecole di RNA a doppio filamento. L'RNA a doppio filamento innesca un processo che degrada le molecole di mRNA che contengono una sequenza complementare a quella dell'RNA a doppio filamento. Quando queste molecole di mRNA scompaiono, il gene corrispondente viene silenziato e non viene prodotta alcuna proteina del tipo codificato. Quando un gene estraneo, virus o trasposone compare nella cellula, questa, riconoscendolo come estraneo, attraverso un meccanismo che ancora non è stato compreso, lo induce a convertire il suo mRNA in RNA a doppio filamento, inducendo di conseguenza la risposta di inibizione.

34 Meccanismo LRNA a doppio filamento incontra un enzima chiamato "Dicer", il quale taglia il lungo RNA in pezzi di circa nucleotidi, gli siRNA. Lenzima taglia entrambi i filamenti in maniera leggermente sfalsata, così da lasciare due nucleotidi che sporgono ad ogni estremità. Successivamente i due filamenti dellsiRNA si separano e uno dei due entra a far parte di un complesso proteico, chiamato RISC, ossia Complesso di silenziamento indotto dallRNA (RNA-Induced Silencing Complex). Unopportuna disposizione dellsiRNA allinterno del complesso fa in modo che gli mRNA presenti in ogni momento nella cellula possano urtare contro di esso. Ma solo lRNA messaggero perfettamente o quasi perfettamente complementare ad esso potrà aderire alla sua sequenza nucleotidica. Quando ciò si verifica un enzima chiamato "Slicer" taglia in due il filamento di mRNA, rendendolo inattivo e procede oltre, libero di catturare un altro mRNA. In tal modo il sistema iRNA utilizza i frammenti di mRNA a doppio filamento per identificare e inattivare gli RNA messaggeri corrispondenti. LRNA a doppio filamento incontra un enzima chiamato "Dicer", il quale taglia il lungo RNA in pezzi di circa nucleotidi, gli siRNA. Lenzima taglia entrambi i filamenti in maniera leggermente sfalsata, così da lasciare due nucleotidi che sporgono ad ogni estremità. Successivamente i due filamenti dellsiRNA si separano e uno dei due entra a far parte di un complesso proteico, chiamato RISC, ossia Complesso di silenziamento indotto dallRNA (RNA-Induced Silencing Complex). Unopportuna disposizione dellsiRNA allinterno del complesso fa in modo che gli mRNA presenti in ogni momento nella cellula possano urtare contro di esso. Ma solo lRNA messaggero perfettamente o quasi perfettamente complementare ad esso potrà aderire alla sua sequenza nucleotidica. Quando ciò si verifica un enzima chiamato "Slicer" taglia in due il filamento di mRNA, rendendolo inattivo e procede oltre, libero di catturare un altro mRNA. In tal modo il sistema iRNA utilizza i frammenti di mRNA a doppio filamento per identificare e inattivare gli RNA messaggeri corrispondenti.

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36 RNA come silenziatore: i microRNA Sono stringhe di acido nucleico lunghe basi non codificanti proteine Sono stringhe di acido nucleico lunghe basi non codificanti proteine Sono direttamente coinvolti nella genesi di molti tumori Sono direttamente coinvolti nella genesi di molti tumori Queste molecole hanno la capacità di inibire la traduzione dellmRNA in proteine. Sono regolatori endogeni dellespressione genica che si attivano quando unenzima li stacca da una molecola di RNA più lunga, tagliandola in punti strategici Queste molecole hanno la capacità di inibire la traduzione dellmRNA in proteine. Sono regolatori endogeni dellespressione genica che si attivano quando unenzima li stacca da una molecola di RNA più lunga, tagliandola in punti strategici Una volta liberati individuano il loro bersaglio: lmRNA che sta per essere tradotto in proteina Una volta liberati individuano il loro bersaglio: lmRNA che sta per essere tradotto in proteina Se non cè perfetta complementarietà di basi con il bersaglio ne bloccano la traduzione legandosi ad esso. Se la complementarietà è totale ne causano la degradazione Se non cè perfetta complementarietà di basi con il bersaglio ne bloccano la traduzione legandosi ad esso. Se la complementarietà è totale ne causano la degradazione Il bersaglio possono essere mRNA che derivano da oncogeni o oncosopressori. Nel primo caso la perdita di microRNA attiva geni che sarebbe meglio restassero silenti. Nel secondo caso vengono silenziati geni protettivi che impediscono lo sviluppo tumorale. Il bersaglio possono essere mRNA che derivano da oncogeni o oncosopressori. Nel primo caso la perdita di microRNA attiva geni che sarebbe meglio restassero silenti. Nel secondo caso vengono silenziati geni protettivi che impediscono lo sviluppo tumorale.

37 Regolazione dellespressione genica durante lo sviluppo I meccanismi di regolazione dellespressione genica durante lo sviluppo non sono del tutto noti, ma si può delineare un modello valido in linea generale I meccanismi di regolazione dellespressione genica durante lo sviluppo non sono del tutto noti, ma si può delineare un modello valido in linea generale

38 Geni omeotici Sono gruppi di geni pressocchè identici che controllano labbozzo generale dellorganismo in specie animali anche molto diverse Sono gruppi di geni pressocchè identici che controllano labbozzo generale dellorganismo in specie animali anche molto diverse Hanno in comune una sequenza simile di circa 180 nucleotidi detta homeobox Hanno in comune una sequenza simile di circa 180 nucleotidi detta homeobox Sono attivati durante lo sviluppo sempre nello stesso ordine che corrisponde allordine con cui essi sono disposti nel cromosoma, ossia dallestremità posteriore a quella anteriore del corpo Sono attivati durante lo sviluppo sempre nello stesso ordine che corrisponde allordine con cui essi sono disposti nel cromosoma, ossia dallestremità posteriore a quella anteriore del corpo

39 Sequenza di trasduzione del segnale Serie di cambiamenti che trasformano un segnale chimico che arriva su una cellula in una risposta specifica della cellula bersaglio Serie di cambiamenti che trasformano un segnale chimico che arriva su una cellula in una risposta specifica della cellula bersaglio La cellula che trasmette il messaggio secerne una molecola segnale La cellula che trasmette il messaggio secerne una molecola segnale La molecola si lega a un recettore sulla membrana della cellula bersaglio La molecola si lega a un recettore sulla membrana della cellula bersaglio Il legame attiva delle proteine amplificatrici Il legame attiva delle proteine amplificatrici Viene attivato un fattore di trascrizione che attiva la trascrizione di uno specifico gene Viene attivato un fattore di trascrizione che attiva la trascrizione di uno specifico gene


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