 Proteine  Proteine globulari che catalizzano le reazioni chimiche nelle cellule (62 residui aa 4- ossolocrotonato tautomerase a > 2500 residui in acidi.

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1  Proteine  Proteine globulari che catalizzano le reazioni chimiche nelle cellule (62 residui aa 4- ossolocrotonato tautomerase a > 2500 residui in acidi grassi sintetasi )  Esistono un ridotto numero di catalizzatori biologici che agiscono nel ribosoma: RNA- enzimi o ribozimi  L’attività enzimatica viene determinata dalla loro struttura tridimensionale  Una piccola porzione dell’enzima (3-4 aminoacidi) è coinvolta direttamente nella catalisi: Sito attivo dell’enzima ENZIMI

2 Un catalizzatore (enzima) è semplicemente un composto che accelera la reazione senza apportare cambi durante essa Profilo generale d’una reazione chimica

3 InterazioniEnzima-Substrato InterazioniEnzima-Substrato InterazioniEnzima-Substrato InterazioniEnzima-Substrato

4 Triose Phosphate Isomerase Meccanismi enzimatici Catalisi Acid-Base

5 Meccanismi enzimatici Catalisi elettrostatica

6 trypsin, chymotrypsin, and elastase Meccanismi enzimatici Catalisi covalente

7 Strategie dattivazione per Proteasi

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9 ENZYMEREACTION CATALYZED Kinases catalyze the addition of phosphate groups to molecules. Protein kinases are an important group of kinases that attach phosphate groups to proteins. Phosphatases catalyze the hydrolytic removal of a phosphate group from a molecule. Oxido-Reductases general name for enzymes that catalyze reactions in which one molecule is oxidized while the other is reduced. Enzymes of this type are often called oxidases, reductases, and dehydrogenases. ATPases hydrolyze ATP. Many proteins with a wide range of roles have an energy-harnessing ATPase activity as part of their function, for example, motor proteins such as myosin and membrane transport proteins such as the sodium– potassium pump.

10 ENZYMEREACTION CATALYZED Hydrolases general term for enzymes that catalyze a hydrolytic cleavage reaction. Nucleases break down nucleic acids by hydrolyzing bonds between nucleotides. Proteases break down proteins by hydrolyzing bonds between amino acids. Synthases general name used for enzymes that synthesize molecules in anabolic reactions by condensing two smaller molecules together. Isomerases catalyze the rearrangement of bonds within a single molecule. Polymerases catalyze polymerization reactions such as the synthesis of DNA and RNA.

11 INIBIZIONE SUICIDA Una classe particolare di inibitori irreversibili è quella degli inibitori suicidi, relativamente poco reattivi se non quando raggiungono il sito attivo di un dato enzima. Questi inibitori portano avanti le prime tappe di una normale reazione, ma invece di essere trasformati nel prodotto previsto, vengono convertiti in prodotti molto reattivi che si combinano in maniera irreversibile con l’enzima. ESEMPIO: Inibizione suicida del CYP2B11 da parte del cloramfenicolo Legame covalente

12 ENZIMI NELLA DIAGNOSI DI PATOLOGIE La misura di variazioni della concentrazione serica di numerosi enzimi è alla base di analisi diagnostiche Sono utilizzati enzimi epatici quali: amino trasferasi (ALT e AST); lattato deidrogenasi (LDH1, LDH2, LDH3, LDH4 e LDH5); creatina chinasi (CPK1, CPK2, CPK3); e  -glutamil transpeptidasi (GGT) In seguito al danno tissutale può verificarsi il rilascio di enzimi nel sangue APPLICAZIONI: Epatiti virali (rapporto ALT/AST › 1) Danno cardiaco (AST) Infarto al miocardio (LDH, CK) Danni muscolari (CK) Danni cerebrali (CK)

13 Nucleotidi, acidi nucleici, DNA e RNA

14 Basi azotate

15 Lo scheletro del DNA (backbone) è un polimero costituito dall’alternanza di residui zucchero-fosfato. Ciascun desossiribosio è legato al precedente e al successivo mediante gli idrossili in posizione 3’ e 5’ grazie ad un residuo fosforico che funge da ponte. Il legame che si insatura fra zucchero e fosfato prende il nome di legame fosfodiesterico

16 Il DNA è costituito da una doppia elica. Le due catene sono antiparallele (5’-3’ e 3’- 5’) e la struttura è stabilizzata da legami idrogeno intercatena che coinvolgono coppie di basi complementari

17 Complementarietà delle basi azotate legame H ingombro sterico

18 Le due catene si avvolgono su se stesse a formare un’elica destrorsa e le basi sono rivolte internamente alla struttura esponendo sulla superficie i gruppi fosforici polari

19 A-DNA B-DNA Z-DNA Right-handed helix Right-handed Left-handed Short and broad Long and thin Longer and thinner Helix Diameter 25.5A 23.7A 18.4A Rise / base-pair 2.3A 3.4A 3.8A Base-pair / helical turn ~ 11 ~ 10 ~ 12 Helix pitch 25A 34A 47A Tilt of the bases 20 deg -1 deg -9 deg Strutture DNA

20 L‘RNA è composto da una sola catena nucleosidica Lo zucchero è un ribosio La timina del DNA viene rimpiazzata dall’uracile nell’RNA Strutture RNA

21 Strutture secondaria e terziaria del RNA

22 DNA e geni DNA ricombinante è sinonimo di manipolazione genetica Tecniche di DNA ricombinante alla base dello sviluppo di farmaci biotecnologici DNA e RNA target farmacologici?

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24 Miscellaneous drug targets  Building blocks biosintetici Vancomycine (antibatterico) cattura il L-Lys-D-Ala-D-Ala building block e previene la sua incorporazione nella frazione di crescita della membrana batterica

25  Processi biosintetici Puromycin (antibiotico) finisce la crescita della catena proteica durante la traslazione. Mima l’aminoacile terminale di un aminoacil-tRNA

26 Miscellaneous drug targets  Interazioni proteine-proteine Diversi ed importanti processi cellulari coinvolgono l’associazione di due o più proteine Farmaci che possono interferire con questi processi Inibizione dell’interazione proteina-proteina dei processi di trasduzione del segnale: agenti anticancro La prevenzione della formazione dei complessi di fattore di trascrizione può prevenire la trascrizione di geni specifici Anticorpi prevengono la PPI in una famiglia di proteine extracellulare: integrine (coagulazione del sangue, infiammazione, protezione cellulare e risposta immune) L’interazione proteina-proteina coinvolge una grande area superficiale ricondotta ad un piccolo numero d’interazioni particolarmente importanti coinvolgendo relativamente piccole aree “Hot spot”

27 Miscellaneous drug targets Inibitori dell’interazione proteina-proteina PPBIs Agenti anticancro Agenti antivirali Agenti antiinfiammatori Agenti autoimmuni?? Osteoporosis Approcci al disegno PPBIs  Disegnare un peptide mimetico d’un regione peptidica crociale per il binding con l’altra proteine  Peptido mimetici  Mimetici di strutture secondarie:  -elica,  -sheets  Small molecules

28 Miscellaneous drug targets  Lipidi Farmaci che interagiscono con lipidi agiscono alterando la struttura lipidica della membrana cellulare anestetici generali agente antitumorale: cefalostatina I antibiotico: daptomycin

29 Daptomycin

30 Miscellaneous drug targets Molecole “tunnelling” Farmaci che interagiscono con lipidi delle membrane costruendo tunnel in essa Amphotericin B Gramicidin A peptide Magainins polipeptide Nanotubi killer: peptidi ciclici capaci d’auto assemblaggio nella membrana cellulare dei batteri formando tunnel

31 Amphotericin B Struttura e meccanismo d’azione

32 Miscellaneous drug targets Trasportatori ionici Farmaci che interagiscono con lipidi delle membrane trasportando ioni Valiomycin: struttura ciclica catene idrofobiche all’esterno (capace di legarsi ai lipidi attraverso forze di Van der Waals) e idrofiliche all’interno (permette di accomodare uno ione e stabilizzarlo attraverso legame con il gruppo carbossiamine). Questo farmaco introduce un incontrollato sistema di trasporto ionico fatale per la cellula

33 Altri trasportatori ionici Nigericin Monensin A Iasalocid A Polymyxin B trasporta piccole molecole (nucleoside) e non ioni

34 Miscellaneous drug targets  Carboidrati  Carboidrati legati a lipidi (glicolipidi) Costituenti delle membrane cellulari. La porzione lipidica si inserisce nella membrana; il glicano si proietta nella fase acquosa  Carboidrati legati a proteine(glicoproteine o preoteo glicano) O-linked formate per glicosilazione di residui di Ser o Thr con vari glicani (mucine, proteoglicani) N-linked contengono un cuore comune (GlcNAc-b) collegato a residui di asparagina in una tripletta Asn-Xxx-Ser/Thr Sono presenti nelle membrane, nel siero, nella matrice extracellulare, nel citoplasma e nel nucleo

35 Funzioni biologiche dei carboidrati Funzioni intrinseche di glicani Costituenti componenti strutturali (Membrane, matrice estracellulare(ECM) Stoccaggio d’energia ed strutturale (glycogeno cellulosa)) Modificatori delle proprietà delle proteine (Solubilità, stabilità) Funzioni che risultano dalla interazione glicano-lectine Traffico diretto di glicoconiugati (inter- e extra cellulare) Mediatori e modulatori della adesione cellulare (Cellula –cellula, cellula-matrice) Mediatori e modulatori della segnalizzazione cellulare (inter- e extra- cellulare) Interazione carboidrato-carboidrato

36 Interazioni carboidrati-proteine nella superficie cellulare gioca un importante ruolo nei processi di riconoscimento cellulare Interazione cellula-cellula Infiammazione fertilizzazione Interazione zucchero-proteine come target Sviluppo di probes, diagnostica e farmaci

37 Miscellaneous drug targets  Antigeni ed anticorpi  Molecole tag nel riconoscimento agiscono come antigeni se la cellula è introdotta in un individuo differente  Possiamo ipotizzare che un anticorpo specifico per questo antigene risulterà efficace nella distruzione della cellula Anticorpo ????? La terapia del cancro con anticorpi sta basata su farmaci biotecnologici che hanno come obbiettivo certi antigeni over espressi sulla superficie della cellula tumorale L’antigene così diventa il marcatore sia del target molecolare capace, quindi, di provocare la morte cellulare sia della specificità del delivering de farmaci

38 Farmaci multi-target  Terapia combinata : somministrazione di più di un farmaco con target diversi Cancro Infezione HIV  Disegno di farmaci che possono agire selettivamente con diversi target disegno di un farmaco con attività agonista per un determinato sottotipo recettoriale ed attività antagonista per un altro il farmaco non inibisca enzimi metabolici o non agisca su target che possano provocare tossicità

39 Precauzione nella scelta del target  I sistemi biologici nel corpo umano sono altamente complessi: per una determinata funzione ci sono differenti messaggeri, recettori, ed enzimi coinvolti nel processo Ipertensione: b-adrenoreceptori, canali di Ca 2+ canali di K +, enzima convertitore di angiotensine (ACE), antagonisti di renina…..  L’importanza di un target può modificarsi con il tempo e l’acquisizione di nuova informazione Nausea …… recettore D 2 il più potente antagonista risultò essere poco attivo, implicando un differente recettore come modulatore della nausea più importante……5HT 3

40 Specificità e selettività del target Specificità e selettività di target tra le specie Specificità e selettività di target all'interno del corpo Farmaci targeting specifici organi e tessuti  Farmaci che hanno come target sottotipi specifici di recettori possono essere farmaci per specifici organi o per aree specifiche del cervello.  I vari sottotipi recettoriali non sono distribuite uniformemente nel corpo, ma sono spesso concentrati in particolari tessuti  Raggiungere selettività per un sottotipo recettoriale è particolarmente importante per i farmaci che hanno lo scopo di imitar neurotrasmettitori. I neurotrasmettitori vengono rilasciati vicino ai loro recettori bersaglio e una volta che hanno trasmesso il loro messaggio, sono rapidamente disattivati ​​ e non hanno la possibilità di accedere recettori più lontani.  In molte malattie, vi è un ' anomalia di trasmissione ' ad un particolare tessuto o in una particolare regione del cervello.