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ENZIMI. Importanza degli enzimi in Medicina 1.Chiave per capire errori del metabolismo 2.Importanti nelle reazioni di detossificazione 3.Targets di chemioterapia.

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1 ENZIMI

2 Importanza degli enzimi in Medicina 1.Chiave per capire errori del metabolismo 2.Importanti nelle reazioni di detossificazione 3.Targets di chemioterapia 4.Essenziali per formulare il razionale di un farmaco 5.Punto di riferimento nella diagnosi e nel monitoraggio terapeutico 6.Il ruolo primario delle vitamine è svolto come cofattori di enzimi

3 Tutti gli enzimi sono proteine**** **** alcuni RNA catalitici o ribozimi possono essere classificati come enzimi -hanno un peso molecolare tra 15 kDa – 1000 kDa -mostrano le stesse proprietà fisiche e chimiche delle proteine: 1. denaturazione 2. precipitazione 3. sensibilità alle proteasi

4 Gli enzimi sono caratterizzati da tre proprietà distintive: 1.CAPACITA CATALITICA 2.SPECIFICITA DI SUBSTRATO 3.REGOLAZIONE I residui amminoacidici che formano il sito di legame sono disposti in modo tale da reagire specificamente con il substrato mediante forze attrattive

5 Molti enzimi necessitano di componenti chimici addizionali detti cofattori I cofattori possono essere ioni inorganici (Fe 2+, Mg 2+, Zn 2+ ) coenzimi (molecole organiche o metallo-organiche)

6 I coenzimi legati covalentemente allenzima sono chiamati gruppi prostetici GRUPPO PROSTETICO + APOENZIMA = OLOENZIMA

7 Fe 2+ o Fe 3+ Catalasi Perossidasi Cu 2+ Citocromo ossidasi Zn 2+ Anidrasi carbonica Alcol deidrogenasi Mg 2+ Glucosio-6-fosfatasi Piruvato chinasi Mn 2+ Ribonucleotide reduttasi Ni 2+ Ureasi MoDinitrogenasi SeGlutatione perossidasi Esempi di enzimi che contengono come cofattori ioni inorganici

8 Esempi di enzimi e coenzimi che trasferiscono gruppi chimici coenzimagruppi trasferitienzimi FAD NAD atomi di idrogeno ione idruro deidrogenasi coenzima Agruppi acilici acil-transferasi tiamina pirofosfatogruppi idrossialchil. decarbossilasi piridossalfosfatogruppo amminico amminotransferasi biotinaCO 2 carbossilasi tetraidrofolatoformil, metilen, metil transferasi C 1

9 A P (spontanea) [A] t v== K[A] La velocità è proporzionale alla concentrazione di A e K è la costante di proporzionalità o costante di velocità Poiché v è proporzionale ad A (unico reagente), la reazione è detta reazione di primo ordine (reaz. unimolecolare) Invece nella reazione: A P A + B C + D v=K[A] [B] Poiché v è proporzionale al prodotto di due concentrazioni, la reazione è di secondo ordine. Studio della velocità delle reazioni enzimatiche

10 La reazione A + B C + D si verifica perché ad ogni istante dato sia A che B hanno lenergia necessaria per raggiungere una condizione reattiva nota come stato di transizione. Energia libera media (stato iniziale) (Energia richiesta per aumentare lE media di una mole di reagenti)

11 aumento della temperatura:aggiunta di un catalizzatore: Ci sono due modi per accelerare una reazione chimica: P aumenterà lenergia media dei reagenti diminuendo così lenergia necessaria a raggiungere lo stato di transizione. A P il catalizzatore abbassa il G combinandosi temporaneamente con i reagenti in modo da promuovere il loro ingresso nella condizione reattiva dello stato di transizione

12 CINETICA DELLE REAZIONI ENZIMATICHE Il cambiamento nella velocità di reazione in funzione della variazione della concentrazione del reagente è una delle misure principali dellanalisi cinetica

13 Curva di saturazione del substrato per una reazione enzimatica A bassa [S], v è proporzionale a [S] (reazione di primo ordine) Ad alta [S], v diviene indipendente da [S] e si avvicina ad un limite massimo. Il valore di v a questo limite è indicato come Vmax. La reazione enzimatica obbedisce ora ad una cinetica di ordine zero, cioè la velocità è indipendente dalla [reagente] e dipende direttamente dallenzima. Quando v non aumenta anche se [S] aumenta, il sistema è saturato dal substrato (A)

14 lo stadio precoce della reazione è mostrato in scala maggiore E + S K1K1K1K1 K -1 ES K2K2K2K2 E+P K -2 Teoria generale di azione degli enzimi proposta da Michaelis e Menten: lenzima E ed il suo substrato S si associano reversibilmente per formare un complesso ES. Il prodotto si forma in un secondo stadio quando ES si rompe per dare E+P

15 Lequazione di Michaelis-Menten K m = costante di Michaelis-Menten V o = velocità iniziale V max = velocità allo stato stazionario La velocità di una reazione enzimatica v in qualsiasi istante è determinata dal rapporto fra due costanti Km e Vmax e la concentrazione del substrato in quellistante. Il valore di Km è definito dalla concentrazione di substrato che dà una velocità pari alla metà della velocità massima: quando [S]= Km, v= Vmax/2

16 Km è anche una misura dellaffinità dellenzima per il suo substrato: se un enzima ha un piccolo valore di Km, vuol dire che raggiunge la massima efficienza catalitica a basse concentrazioni di substrato (bassa Km = alta affinità) Significato della costante di Michaelis Lequazione di Michaelis-Menten descrive una curva chiamata iperbole rettangolare

17 La Commissione Internazionale sugli Enzimi definisce lUnità Internazionale di Enzima come la quantità che catalizza la formazione di una micromole di prodotto in un minuto. Il numero di turnover di un enzima, Kcat, è una misura della sua massima attività catalitica. Kcat = numero di molecole di substrato convertite in prodotto per molecola di enzima per unità di tempo quando lenzima è saturato con il substrato

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19 Il riconoscimento enzima-substrato e gli eventi catalitici che seguono sono fortemente dipendenti dal pH Loptimum di pH può non coincidere con lambiente naturale in cui lenzima si trova: risposta al pH = regolazione intracellulare dellattività enzimatica

20 Effetti della temperatura sullattività enzimatica La diminuzione dellattività a temperature superiori a 50° è dovuta alla denaturazione termica.

21 Lequazione di Michaelis-Menten descrive una curva chiamata iperbole rettangolare A causa della forma iperbolica del grafico di v in funzione di [S] la determinazione precisa del valore di Vmax non è possibile. La maniera migliore per ottenere i valori di Vmax è rimaneggiare lequazione di MM per ottenere un grafico lineare.

22 Dallequazione di Michaelis-Menten si possono ottenere grafici lineari: prendendo i reciproci di entrambi i membri dellequazione di M-M 1 V = Km + [S] Vmax [S] = Km Vmax [S] [S] + Vmax [S] 1 V = Km Vmax [S] + Vmax 1

23 Grafico dei doppi reciproci di Lineweaver-Burk questa equazione descrive una linea retta y= x=

24 Inibizione enzimatica inibizione reversibile linibitore interagisce con lenzima attraverso reazioni non covalenti di associazione/dissociazione inibizione irreversibile linibitore causa alterazioni covalenti stabili dellenzima competitiva non competitiva I due tipi di inibizione si possono distinguere dal particolare tipo di andamento che si ottiene quando i dati cinetici sono analizzati in diagrammi lineari di Lineweaver-Burk

25 La Succinato deidrogenasi – un esempio classico di inibizione competitiva INIBIZIONE REVERSIBILE

26 inibizione competitiva Km aumenta Il substrato e linibitore competono per lo stesso sito di legame sullenzima (sito attivo) Laumento della [S] aumenta la probabilità che sia S a legarsi allenzima invece dellinibitore. Alti valori di [S] possono annullare leffetto di I. Vmax è invariata La caratteristica di questo tipo di inibizione è che Vmax non è influenzata da I (tutte le rette mostrano la stessa intercetta sullasse y) INIBIZIONE REVERSIBILE

27 inibizione non competitiva Km invariata Vmax diminuisce (diminuzione dellenzima attivo) INIBIZIONE REVERSIBILE Linibitore ed il substrato si legano a siti diversi dellenzima e il legame di I non influenza il legame di S Linibizione non può essere superata aumentando la [S]

28 - linibitore si lega irreversibilmente allenzima (per es. con un legame covalente). -tipo di cinetica osservata: simile allinibizione non competitiva - differenza: la diluizione non è efficace a dissociare il complesso E-I e non ripristina lattività enzimatica INIBIZIONE IRREVERSIBILE

29 Substrati suicidi: sono inibitori analoghi del substrato che si legano covalentemente allenzima con specificità ed alta affinità. la penicillina è un inibitore irreversibile dellenzima glicoproteina transpeptidasi che crea i legami crociati nelle catene di peptidoglicano durante la sintesi della parete cellulare batterica.

30 La specificità è il risultato del riconoscimento molecolare Il sito attivo dellenzima comprende solo una parte della sua struttura, una speciale tasca complementare alla struttura del substrato

31 Adattamento indotto il complesso cataliticamente attivo enzima-substrato è una struttura interattiva: -la forma del sito attivo dellenzima si modifica in seguito al legame di S -lenzima induce il substrato ad adottare una forma che mimi lo stato di transizione della reazione processo di riconoscimento dinamico fra E e S

32 Controllo dellattività enzimatica 1.accumulo del prodotto (dimin. velocità di sintesi di P) 2.disponibilità del substrato 3.controllo genetico 4.modifica covalente 5.isozimi 6.proteine modulatrici 7.enzimi allosterici reversibile irreversibile

33 Gli enzimi regolati mediante modifiche covalenti sono chiamati enzimi interconvertibili Modificazioni covalenti reversibili: FosforilazioneAdenilazioneUridililazioneADP-RibosilazioneMetilazione Fosforilazione 4.

34 enzimi proteolitici del tratto digestivo Lattivazione proteolitica del chimotripsinogeno Modificazioni covalenti irreversibili: Proteolisi (zimogeni)

35 coagulazione del sangue

36 Controllo dellattività enzimatica 1.accumulo del prodotto 2.disponibilità del substrato 3.controllo genetico 4.modifica covalente 5.isozimi 6.proteine modulatrici 7.enzimi allosterici reversibile irreversibile

37 5. Isozimi Gli isozimi della lattato deidrogenasi Numerosi enzimi esistono in più strutture quaternarie che differiscono nelle proporzioni di associazione di due subunità A e B. (M 4 ) (H 4 )

38 Enzima Enzima Lattico deidrogenasi (infarto del miocardio, epatite virale) Isocitrico deidrogenasi (epatiti virali) Glucosio-6-fosfato deidrogenasi (anemia) Glutammico deidrogenasi (affezioni epatiche) Aspartico transaminasi (infarto del miocardio) Creatina chinasi (indice di infarto e distrofia muscolare) Acetilcolinesterasi (anestesia) Colinesterasi (indice di funzionalità epatica) Fosfatasi alcalina (affezioni epatiche e dellapp. scheletrico) Enzimi di interesse clinico che si presentano in forme multiple

39 Controllo dellattività enzimatica 1.accumulo del prodotto 2.disponibilità del substrato 3.controllo genetico 4.modifica covalente 5.isozimi 6.proteine modulatrici 7.enzimi allosterici reversibile irreversibile

40 6. Proteine modulatrici La proteina chinasi AMP ciclico dipendente (PKA)

41 Controllo dellattività enzimatica 1.accumulo del prodotto 2.disponibilità del substrato 3.controllo genetico 4.modifica covalente 5.isozimi 6.proteine modulatrici 7.enzimi allosterici reversibile irreversibile

42 7. Enzimi allosterici la loro cinetica non obbedisce allequazione di Michaelis-Menten Grafico sigmoide di V in funzione di [S]

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45 Il modello della regolazione enzimatica: la glicogeno fosforilasi 1. In condizioni normali, lattività di questo enzima nel muscolo è regolata allostericamente da metaboliti che riflettono lo stato energetico cellulare (AMP, ATP, glucosio 6 fosfato) 2. In caso di stress ladrenalina stimola una cascata di reazioni che culminano nella fosforilazione (attivazione) dellenzima

46 DIMERO DELLA GLICOGENO FOSFORILASI STRUTTURA DEL MONOMERO DELLA GLICOGENO FOSFORILASI

47 Curve di v in funzione di [S] per la glicogeno fosforilasi b) LATP è un inibitore a feed-back che influenza lattività dellenzima per il substrato c) LAMP è effettore eterotropico positivo; si lega allo stesso sito dellATP (in competizione) ed influenza laffinità dellenzima per il substrato Livelli significativi di AMP indicano che lo stato di energia della cellula è basso e che dovrebbe essere prodotta più energia (ATP). I cambiamenti nelle concentrazioni cellulari di ATP e AMP e la loro competizione per il legame allo stesso sito con effetti opposti assicura che la produzione di energia sia proporzionata alle esigenze cellulari

48 Meccanismo della modifica covalente e della regolazione allosterica della glicogeno fosforilasi 1. 2.

49 La fosforilazione causa nella fosforilasi un drastico cambiamento conformazionale

50 La glicogeno fosforilasi è regolata da cascate enzimatiche

51 Lattivazione ormonale delladenilato ciclasi

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53 MECCANISMI DI AZIONE DEGLI ENZIMI

54 I tipi di meccanismi catalitici utilizzati dagli enzimi sono stati classificati come: catalisi acido-basica catalisi acido-basica catalisi covalente catalisi covalente catalisi favorita da ioni metallici catalisi favorita da ioni metallici catalisi favorita da effetti di prossimità e di orientamento catalisi favorita da effetti di prossimità e di orientamento

55 catalisi acido-basica (presente in quasi tutte le reazioni enzimatiche): la velocità aumenta se cambia il pH. Esistono di 2 tipi di catalisi acido-basica: catalisi acido-base specifica: gli ioni H + o OH - accelerano la reazione (la concentrazione del tampone non ha alcun effetto sulla reazione) catalisi acido-base generale un acido o una base, diversi da H + o OH - accelerano una reazione (il tampone può donare o accettare protoni, influenzando così la velocità di reazione)

56 Catalisi covalente: alcune reazioni enzimatiche devono gran parte dellaumento della loro velocità alla formazione di legami covalenti fra E ed S X= centro nucleofilo che attacca un centro elettrofilo

57 catalisi favorita da ioni metallici: alcuni enzimi richiedono ioni metallici per svolgere la loro massima attività catalitica lalcol deidrogenasi epatica uno ione zinco del sito attivo dellenzima alcol deidrogenasi stabilizza la formazione di una carica negativa sullatomo di ossigeno dellacetaldeide, portando alla comparsa di una parziale carica positiva indotta sullatomo di carbonio carbonilico

58 catalisi favorita da effetti di prossimità e di orientamento le reazioni chimiche avvengono più velocemente quando i reagenti si trovano in prossimità, cioè vicini gli uni agli altri. Gli enzimi non solo mantengono i substrati e i gruppi catalitici vicini gli uni agli altri, ma li orientano in modo tale da favorire la catalisi

59 MECCANISMI ENZIMATICI Serina proteasi Aspartato proteasi

60 Serina proteasi classe di enzimi proteolitici il cui meccanismo catalitico è basato sulla presenza di un residuo di serina nel sito attivo. -tripsina -chimotripsina -elastasi -trombina -plasmina -attivatore tissutale del plasminogeno -acetil colinesterasi= non è una proteasi ma una serina esterasi il cui meccanismo dazione è correlabile a quello delle serina proteasi. Essa idrolizza il neurotrasmettitore acetilcolina nello spazio sinaptico interneuronico. enzimi digestivi sintetizzati nel pancreas e secreti nellapparato digerente come proenzimi inattivi o zimogeni

61 Tripsina, chimotripsina ed elastasi catalizzano tutti la stessa reazione: la scissione di una catena polipeptidica. Tripsina: agisce su aa basici (arginina, lisina) Chimotripsina: agisce su aa aromatici Elastasi: agisce su piccoli residui di aa neutri

62 Tre residui polari (His 57, Asp 102, Ser 195 ) formano la cosiddetta triade catalitica in corrispondenza del sito attivo il quale è costituito da una depressione sulla superficie dellenzima.

63 Il diisopropilfluorofosfato reagisce con i residui di serina del sito attivo delle serina proteasi e delle serina esterasi (come lacetilcolinesterasi) causando una inattivazione. Le proteasi a serina sono sensibili alla inibizione da parte di fluorofosfati organici complesso covalente enzima-inibitore

64 Acetilcolinesterasi: serina esterasi che degrada il neurotrasmettitore acetilcolina nei neuroni. DIFP: altamente tossico perché inibisce le acetilcolinesterasi. Sarin: molecola simile al DIFP (1995, metropolitana di Tokyo) Gas mortale VX: 10 volte più tossico del Sarin (Inghilterra)

65 Aspartato proteasi classe di enzimi proteolitici il cui meccanismo catalitico è basato sulla presenza di due residui di acido aspartico nel sito attivo. Alcune aspartato proteasi rappresentative NomeSorgenteFunzione PepsinaStomacoDigestione proteine della dieta Catepsina DMilza, FegatoDigestione lisosomiale proteine ReninaReneRegolazione pressione arteriosa Proteasi HIV-1Virus AIDSMaturazione delle proteine del virus dellAIDS A differenza delle serina proteasi, le aspartato proteasi non formano legami covalenti con i loro substrati peptidici.

66 La proteasi del virus HIV-1 dellAIDS è una aspartato proteasi La proteasi HIV-1 scinde la poliproteina originando proteine diverse necessarie alla crescita virale e allinfezione cellulare

67 Gli inibitori delle proteasi prolungano la vita dei pazienti affetti da AIDS Terapia: inibitori proteasi + AZT Struttura dellAZT inibitore della trascrittasi inversa CARATTERISTICHE DI UN FARMACO Biodisponibilità: capacità di raggiungere nellorganismo il luogo di azione desiderato Specificità: per la proteasi dellHIV nei linfociti e non per le altre proteasi Novità: per contrastare i ceppi mutanti dellHIV resistenti agli inibitori delle proteasi (ricerche ancora in corso) Farmaci progettati con un disegno strategico basato sulla struttura: la parte della struttura contenente il gruppo -OH si inserisce fra i due gruppi carbossilici del sito attivo della proteasi


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