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RADICALI LIBERI Il temine radicale chimico (1832), indicava un gruppo di atomi, appartenente ad una molecola di un composto organico (CH 3 -, radicale.

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1 RADICALI LIBERI Il temine radicale chimico (1832), indicava un gruppo di atomi, appartenente ad una molecola di un composto organico (CH 3 -, radicale metile; C 2 H 5 -, radicale etile) Il primo radicale preparato (1900) fu il trifenilmetile (C 6 H 5 ) 3 C Radicale libero (R ) è una specie chimica capace di esistenza indipendente, con uno o più elettroni spaiati nei suoi orbitali. Sono radicali lidrogeno atomico (H ) e quasi tutti i metalli del gruppo di transizione nella tavola periodica

2 Proprietà dei radicali liberi I radicali liberi sono paramagnetici in quanto il numero magnetico totale dei loro elettroni è diverso da zero. I radicali sono generalmente più reattivi delle specie non radicaliche poiché gli elettroni sono più stabili quando sono accoppiati La capacità di alcuni radicali di reagire con estrema velocità rende tali specie estremamente evanescenti e di difficile rilevazione I radicali comprendono anche specie chimiche relativamente stabili come lossido nitrico (NO ), il biossido di azoto (NO 2 ) e lossigeno (O 2 )

3 REAZIONI RADICALICHE Fase iniziale: Trasferimento di un elettrone Rottura omolitica di un legame covalente Fase di propagazione: Addizione ad unaltra molecola Cessione di un elettrone ad unaltra molecola Accettazione di un elettrone da unaltra molecola Estrazione di idrogeno da un legame C-H Fase terminale:

4 Velocità delle reazioni radicaliche Reazioni fra radicali si verificano quando i reagenti si incontrano (Processi controllati dalla diffusione) Il valore di k dipende da vari parametri, fra cui la stabilizzazione interna del radicale In reazioni fra radicali e molecole, k è influenzato dallenergia del complesso attivato

5 TOSSICITA DELLOSSIGENO O 2 è tossico ad alte concentrazioni si rileva in: La pO 2 aumenta per: Aumento del % di O 2 nellaria inspirata (uso di O 2 iperbarico) Aumento della pressione totale (immersioni sottomarine) La tossicità di O 2 si rileva in: Lesioni della retina di prematuri trattati con O 2 in incubatrici (retinopatia del prematuro) Irritazione delle vie respiratorie Convulsioni di tipo epilettico

6 Danni da O 2 Ossigeno iperbarico Ad alte pO 2 (4,6 atm) si evidenziano sintomi di intossicazione del sistema nervoso in pochi minuti Lesposizione ad O 2 puro (p = 1 atm), causa tracheite e tosse in poche ore, danno agli alveoli polmonari in un giorno, morte per ipossia in alcuni giorni. Immersioni Nellimmersione la pressione aumenta di 1 atm per ogni 10 metri di profondità LO 2 puro riduce i disturbi da decompressione, ma è tossico per il sistema nervoso sotto i 10 metri (pO 2 > 2 atm) Laria contenente il 21% di O 2 ha una pO 2 di 1 atm a 40 m, ed è sopportata per tempi brevi A 140 metri la pO 2 è 3,15 atm e danneggia il sistema nervoso in 1-2 ore, per cui a grandi profondità il % di O 2 deve essere ridotto

7 Struttura dellO 2 Radicali con 2 e - spaiati sono nello stato di tripletto (spin 1) o di singoletto (spin 0) ad energia diversa LO 2 è un biradicale che si trova nello stato di tripletto L 3 O 2 può essere eccitato a stati di singoletto ad E maggiore ( 1 g O 2, E =23 kcal/mole; 1 g + O 2, E = 37 kcal/mole)

8 Reattività dellossigeno Il danno da O 2 fu attribuita ad inattivazione enzimatica LO 2 è poco reattivo. Gli elettroni spaiati sono difficili da accoppiare con gli elettroni delle molecole organiche che sono antiparalleli (restrizione di spin) La restrizione potrebbe essere eliminata formando 1 O 2 Si riteneva che la citocromo ossidasi (COX) cedesse gradualmente 4 elettroni allO 2 e gli intermedi di riduzione fossero saldamente legati al suo sito attivo

9 ROS E RNS Le specie parzialmente ridotte dellO 2 non hanno i suoi impedimenti cinetici e sono definite specie reattive dellossigeno (ROS) Specie reattive dellossigeno (ROS) Radicali O 2 - Radicale superossido OH Radicale ossidrile RO Radicale alcossile ROO Radicale perossile Non radicali H 2 O 2 Perossido di idrogeno HOCl Acido ipocloroso 1 O 2 Ossigeno singoletto O 3 Ozono Specie reattive dellazoto (RNS) Radicali NO Ossido nitrico NO 2 Biossido dazoto Non radicali HNO 2 Acido nitroso N 2 O 4 Tetrossido dazoto ONOO - Perossinitrito

10 Riduzione univalente dellossigeno Nel 1954 fu proposto che gli effetti dannosi dell'O 2 erano dovuti alla formazione dei suoi radicali Lipotesi, con la scoperta della SOD, portò alla "teoria del superossido, secondo cui la tossicità dell'O 2 era dovuta alla formazione di O 2 - e la SOD era importante per la difesa cellulare Tuttavia O 2 - non è molto aggressivo, ma può portare alla formazione di altre ROS In ambiente acido O 2 - genera H 2 O 2 per dismutazione spontanea., ma in presenza della SOD la dismutazione si verifica a velocità 10 4 volte più alta H 2 O 2 non è in grado di ossidare DNA, lipidi e la maggior parte delle proteine in ambiente acquoso

11 H 2 O 2 può essere citotossico e, ad alte concentrazioni, è usato come disinfettante Gli effetti sui batteri sono dovuti alla capacità dellH 2 O 2 di generare il radicale OH estremamente reattivo H 2 O 2 reagisce con ioni metallici di transizione in for- ma ridotta formando OH (Reazione di Fenton): OH è responsabile del danno ossidativo a DNA, lipidi e proteine La reattività di OH può essere valutata dalla sua mezza vita a 37°C OH 1· sec O ·10 -6 sec 1 O 2 1 ·10 -6 sec 3 O 2 > 10 2 sec

12 Reazioni di OH Estrazione di idrogeno Un esempio è lestrazione di H da un alcool con formazione di H 2 O e di un radicale idrossialchilico: Il radicale può reagire ulteriormente con O 2 dando un radicale perossilico: Addizione L OH può anche addizionarsi a doppi legami

13 Ossido nitrico Lossido nitrico (NO ) è sintetizzato per azione delle NOS, che convertono larginina in NO e citrullina Esposto allaria, NO reagisce con O 2 formando il gas bruno diossido di azoto o ipoazotide ( NO 2 ) che è un radicale molto più reattivo di NO Lossidazione di NO in soluzione acquosa produce principalmente lo ione nitrito (NO 2 - ): NO reagisce con Fe 2+ delleme (k < 10 8 M -1 s -1 ) NO non è molto reattivo ma può essere convertito a a perossinitrito (ONOO - ) reagendo con il superossido ONOO - provoca deplezione di gruppi –SH, ossidazione di lipidi, rottura delle eliche e nitrazione di basi del DNA, nitrazione di residui di aminoacidi

14 PRODUZIONE DI RADICALI LIBERI Gli organismi aerobi sono sottoposti ad un attacco continuo da parte di radicali liberi derivanti da fonti esogene ed endogene AGENTI ESTERNI Radiazioni elettromagnetiche Particelle atomiche Inquinanti ambientali SITI DI PRODUZIONE INTERNi Mitocondri (catena respiratoria) Citoplasma (xantina ossidasi) Microsomi (P450-b 5 ) Membrana (lipoossigenasi) Perissosomi (enzimi ossidasi) Fagociti (NADPH-ossidasi)

15 Radiazioni Le radiazioni influenzano processi vitali (fotosintesi, fotoperiodismo, ritmi circadiani, visione, formazione della vitamina D) Le radiazioni sono anche responsabili di eventi patologici che a volte coinvolgono radicali liberi: Le radiazioni luminose inducono lazione fotodina- mica Le radiazioni ultraviolette provocano leccitazione di molecole che possono dissociarsi formando radicali liberi Le radiazioni ionizzanti sono: corpuscolari (elettroni, protoni, neutroni, particelle e particelle ) ed elettromagnetiche (raggi x e raggi )

16 Negli organismi viventi le radiazioni ionizzanti formano radicali primari trasferendo energia a componenti cellulari ed in particolare allacqua, che subisce ionizzazione ed eccitazione. Lelettrone è rapidamente idratato lo ione radicalico si decompone la molecola eccitata subisce fissione omolitica dando latomo di idrogeno ed il radicale ossidrile I radicali primari ( OH, H, ed e - aq ), diffondono e reagiscono con vari soluti cellulari generando nuove specie chimiche

17 Inquinanti ambientali Una causa di danno cellulare è NO 2, formato dalla reazione di N 2 con O 2 nella combustione di materiale organico. La reazione può dare NO, ma questo forma NO 2 reagendo ancora con O 2 NO 2 è molto reattivo e la sua formazione è motivo di preoccupazione Nelle città occidentali, la principale sorgente di NO 2 è lemissione degli scarichi dei veicoli NO 2 è pericoloso anche perché è un precursore di O 3, il maggiore responsabile dello smog fotochimico

18 Formazione di O 3 O 3 si forma in reazione a due fasi favorita da irraggiamento solare e T elevata: O 3 si forma in aree inquinate nelle giornate estive O 3 subisce una reazione di abbattimento riformando i prodotti di partenza La reazione è indipendente dalla luce, per cui si ha di notte ed è minore in campagna O 3 provoca ossidazione di metalli e depolimerizza- zione e degradazione di plastiche e gomme interferisce con la funzione clorofilliana e la crescita delle piante irrita e infiamma occhi e prime vie respiratorie. I fenomeni, dopo esposizioni prolungate, provocano danni irreversibili al sistema respiratorio e cardio- vascolare

19 Il fumo delle sigarette contiene ~3000 composti, molti dei quali tossici (nicotina, CO, benzene, HCN, radicali liberi, aldeidi, nitrosammine e benzopirene). Il fumo è separabile in una fase gassosa e nel catrame. Il catrame contiene circa 10 7 radicali/g, per lo più molto stabili, fra cui semichinoni che subiscono interconversioni con chinoni ed idrochinoni Estratti acquosi di catrame generano il radicale superossido, probabilmente per reazione dei semichinoni con O 2 La fase gassosa contiene per ogni boccata più di 10 5 radicali (alcossilici, perossilici e centrati sul carbonio) con vita più breve

20 Catena respiratoria mitocondriale Il 95% dellO 2 è utilizzato dai mitocondri Le sostanze contenute negli alimenti sono ossidate cedendo elettroni a trasportatori di elettroni come NAD +, FMN e FAD. I prodotti della reazione sono riossidati dallO 2 nei mitocondri, producendo ATP Lossidazione si verifica in tappe successive, che coinvolgono centri redox organizzati in 4 complessi immersi nella membrana interna. Gli H + sono espulsi dai mitocondri e lenergia conservata nel gradiente protonico guida la sintesi di ATP attraverso il processo di fosforilazione ossidativa

21 Riduzione tetravalente dellO 2 Gli elettroni dal NADH passano nel complesso I a proteine Fe-S, convertendo Fe 3+ a Fe 2+. Il passaggio degli elettroni al successivo accettore provoca la riconversione di Fe 3+ a Fe 2+ Gli elettroni sono trasferiti al Complesso III attraverso il Coenzima Q, che trasferisce anche gli elettroni derivanti dalla ossidazione, nel Complesso II, del succinato a fumarato Nel Complesso III gli elettroni sono trasferiti mediante citocromi in cui il ferro passa alternativamente tra gli stati +2 e +3 Gli elettroni passano al citocromo c legato alla superficie esterna della membrana interna, che li porta al Complesso IV (COX) La COX rimuove 1 elettrone da ciascuna di 4 molecole di citocromo c e cede i 4 elettroni ad O 2 formando H 2 O

22 Generazione mitochondriale di ROS Componenti della catena respiratoria cedono un elettrone allO 2 (riduzione univalente) trasformandolo nel radicale O 2 - Il superoosido è, a sua volta, trasformato in H 2 O 2 dalla SOD della matrice La velocità della produzione delle ROS aumenta ad alte pO 2 Usando particelle submitocondriali fu calcolato che circa il 2% dell'O 2 è trasformato in ROS, mentre con ADP queste non si formavano Lavori più recenti suggeriscono che il valore è più basso e che laggiunta di ADP non riduce a zero la produzione di ROS

23 Velocità di produzione delle ROS I mitocondri producono ROS a velocità che dipendono dal loro stato metabolico La velocità è più alta durante lo stato 4 e più bassa durante lo stato 3 Infatti la formazione di O 2 - è controllata dallazione di massa: A parità di pO 2, aumenta col crescere della concentrazione dei carriers mitocondriali nella forma ridotta Lenergia degli elettroni, che fluiscono attraverso la catena respiratoria, è convertita in gradiente di H +, che è dissipato attraverso lATP sintetasi formando ATP In assenza di ADP, il movimento di H + attraverso lATP sintetasi cessa, il gradiente di H + aumenta rallentando il flusso elettronico e come conseguenza aumenta il grado di riduzione della catena respiratoria e la velocità di produzione di O 2 -

24 Sistemi di trasporto elettronico microsomali Sul reticolo endoplasmatico vi sono due sistemi di trasporto elettronico Metabolismo degli xenobiotici Il metabolismo degli xenobiotici può essere suddiviso in due fasi: Le reazioni della Fase I introducono un gruppo polare in substrati lipofili Le reazioni della Fase II sono reazioni di coniugazio- ne: una molecola endogena è addizionata al prodotto della reazione della Fase I, a volte direttamente allo xenobiotico. Esempi di reazioni della Fase II sono le coniugazioni con GSH catalizzate da GST Le reazioni della Fase I, oltre al substrato (AH), richiedono un riducente (RH 2 )

25 Ciclo del P450 Il sistema coinvolto nella fase I è costituito da una NADPH-citocromo P450 riduttasi e da citocromi P450 Frazioni microsomali, incubate con NADPH, producono ROS in due modi: intermedi del ciclo sono cortocircuitati e O 2 è ridotto a O 2 - e H 2 O 2 (disaccoppiamento dellattività ossidasica del P450) flavine nellenzima NADPH-P450 riduttasi nella forma semichinonica radicalica cedono elettroni a O 2

26 Sistema desaturasi Laltro sistema, in cui gli elettroni vanno dal NADH al cit b5, introduce doppi legami C=C negli acidi grassi (desaturazione) Esso è costituito da una NADH-citocromo b 5 reduttasi, il citocromo b 5, e lenzima desaturasi La prima proteina catalizza il trasferimento di elettroni dal NADH al b 5 che li dona allenzima desaturasi Questa (chiamata fattore sensibile al cianuro) contiene un ferro non emico per catena polipeptidica e desatura lacilCoA ad enoilCoA riducendo O 2 ad H 2 O Citocromo b 5 e flavoproteina possono ridurre O 2 a O 2 -

27 I sistemi di detossificazione e di desaturazione sono interconnessi La flavoproteina del I sistema (FpI), in alcuni casi, può ridurre il citocromo b 5. Il complesso P450-(RH)-Fe 3+ può accettare un elettrone dal NADPH attraverso FpI o dal NADH attraverso il citocromo b 5

28 Perossidazione lipidica I PUFA dei fosfolipidi subiscono un processo a catena (perossidazione lipidica), che è innescato da qualsiasi radicale che è in grado di estrarre un H da un gruppo metilenico

29 Prodotti della perossidazione lipidica La perossidazione è un processo autocatalitico, capace di convertire diverse centinaia di acidi grassi in idroperossidi, a meno che la fase di propagazione non sia interrotta da un antiossidante cedendo un H a ROO A causa di reazioni di frammentazione della catena, che coinvolgono radicali perossilici, si ottengono prodotti secondari: idrocarburi, esteri, aldeidi, chetoni, alcoli, acidi, epossidi, a cui è dovuto lodore di rancido dei grassi ossidati

30 Conseguenze della perossidazione lipidica Perdita di grassi polinsaturi Diminuzione di fluidità lipidica Alterazione della permeabilità della membrana Danni agli enzimi associati alla membrana Alterato trasporto ionico Produzione di metaboliti tossici degli idroperossidi

31 Danni alle proteine H 2 O 2 ha effetto solo sui gruppi –SH a differenza di OH Gli intermedi radicalici possono reagire con altre proteine generando un nuovo radicale carbonilico e propagando la reazione In assenza di O 2, la reazione 1 non si verifica, e due radicali possono reagire formando un derivato proteina-proteina

32 Con radicali derivanti dalla ossidazione di lipidi e proteine si producono aggregati proteina-lipide: Il legame C-C del radicale alcossilico (reazione 4) si può rompere con frammentazione della proteina I prodotti carbonilici, derivati dalla degradazione dei perossidi lipidici, interagiscono con i residui amino- acidici delle proteine alterandone la natura e la carica elettrica. La MDA può legare due proteine producendo basi di Schiff coniugate rivelabili per fluorescenza

33 Danno ossidativo al DNA L OH può modificare le basi del DNA o scindere lelica del DNA Lossidazione in vitro porta a forme di DNA danneggiato e basi alterate La presenza nei tessuti e l'escrezione con l'urina di tali basi indica un danno in vivo del DNA


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