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Richiami di Bioenergetica. Nei Sistemi Chimici abbiamo a che fare col Potenziale Elettrochimico Il Potenziale Elettrochimico è lEnergia disponibile nelle.

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1 Richiami di Bioenergetica

2 Nei Sistemi Chimici abbiamo a che fare col Potenziale Elettrochimico Il Potenziale Elettrochimico è lEnergia disponibile nelle Reazioni Chimiche per compiere Lavoro

3 Potenziale Elettrochimico J/Mol Unità = Energia/Mole o = G o /mol

4 LEnergia in una Reazione = i prodotti – N i reagenti N i = Rapporto Molare dei Reagenti 1 A + 1 B 2C = C – A – B In generale: Per la nosra particolare reazione:

5 AllEquilibrio: = 0 Equilibrio Energia del Sistema

6 Per una Reazione che va verso lEquilibrio: < 0 Equilibrio Energia del Sistema

7 Il Potenzale Elettrochimico è la risultante di diversi fattori: 1) Composizione Molecolare 4) Pressione Osmotica, … 2) Concentrazione 3) Potenziale Elettrico

8 Energia dovuta alla Composizione Molecolare Energia Conformazionale –Energia Entropica contro Stabilità dei legami Solubilità-Interazione con il Solvente –Coefficiente di Partizione Misurata in Condizioni Standard o

9 Condizioni Standard Concentrazione 1 Molare In Acqua Pura pH=7 Pressione = 1 atmosfera Le Condizioni Standard sono le condizioni della reazione appropriate per lesperimento con i reagenti ad una concentrazione Molare :

10 Energia di Concentrazione LEnergia del Gradiente di Concentrazione: = RT ln([C]/Molare) R = Costante dei Gas (Joules*Mole -1 *K -1 ) T = Temperatura (Kelvin, K)

11 Energia del Potenziale Elettrico LEnergia dovuta alle cariche in un Campo Elettrico: = z F z = Cariche (Moli di Carica/Mole) = Potenziale Elettrico (Energia/Coulomb di Carica) V = J/C F = Costante di Faraday: 10 5 Coulomb/Mole di Carica

12 Potenziale Elettrochimico = o + RT ln + zF [Conc] [Conc] o [Conc] o è la Concentrazione in Condizioni Standard

13 Cambiamento Conformazionale AB = ( o B +RT ln([B]))-( o A + RT ln([A])) = B – A = 0 AllEquilibrio: ( o B + RT ln([B]))-( o A + RT ln([A])) = 0 -RT ln ([B]) + RT ln ([A]) = o B – o A = o

14 -RT ln ([B]) + RT ln ([A]) Distribuzione di Boltzmann AB ( o B + RT ln([B]))-( o A + RT ln([A])) = 0 -RT ln ([B]/[A]) = o [B]/[A]= K eq AllEquilibrio: Risolvendo rispetto a: = exp (- o /RT) Cambiamento Conformazionale

15 Modello di Gating del Canale

16 Le particelle di gating agiscono allinterno della proteina-canale con modalità interpretabili in termini di una distribuzione di Boltzmann. Consideriamo un sistema a due stati nel quale ciascun canale è aperto dal movimento di una singola particella di gating di carica z Secondo il modello di H&H un unico movimento della particella di gating causato da una variazione del campo elettrico provoca un cambiamento conformazionale del canale: Voltaggio-dipendenza del gating Le posizioni e corrispondono a due minimi nel profilo energetico e vi è una singola barriera energetica tra di esse. In una popolazione di N canali simili, n 1 avranno la loro particella di gating in posizione e n 2 in posizione, cosicchè n 1 +n 2 =N. Energia Barriera energetica + +

17 Equazione di Boltzmann della meccanica statistica Mette in relazione le probabilità di una particella di trovarsi nello stato o nello stato con le differenze di energia u 2 -u 1 = u dei due stati: k cost. di Boltzmann T temp. assoluta u 2 -u 1 è espressa in joules La particella spende il minor tempo nello stato ad energia maggiore Stato 1 Stato 2 Energia u

18 In assenza di campo elettrico (E=0) la distribuzione di Boltzmann dellenergia della popolazione di molecole sarà: Dove: n 1 il n o di particelle con energia u 1 in posizione (1) (canale chiuso) n 2 il n o di particelle con energia u 2 in posizione (2) (canale aperto), u 2 -u 1 è la variazione di energia libera ( G) relativa al cambio conformazionale da 1 a 2 Quindi, in assenza di un campo elettrico la differenza di energia conformazionale (u 2 -u 1 ) tra le posizioni 1 e 2 corrisponde al lavoro chimico (w) per muovere ciascuna particella di gating da 1 a 2. 1 o caso: il campo elettrico transmembrana è zero

19 Se esiste un campo elettrico (E 0) la componente energetica posseduta dalla particella in quanto elettricamente carica sarà: -zeV z n o di cariche in ciascuna particella di gating e carica elementare dellelettrone (=4.8· ues=1.6· coulomb V potenziale elettrico Quindi, includendo la componente di energia (lavoro) elettrica, avremo: Se nel nostro sistema il canale è aperto quando la particella di gating è in (2) e chiuso quando è in (1), la frazione di canali aperti è anche uguale alla frazione di particelle in (2): 2 o caso: il campo elettrico transmembrana è da zero

20 Fraz. di canali aperti P o Ponendo si ottiene: dove V 1/2 è il voltaggio V al quale metà dei canali sono aperti (Po=0.5). Notare che quanto più è elevata la carica z, tanto maggiore è la pendenza della curva Ritorniamo allequazione: Ricordiamo che w corrisponde al lavoro per muovere ciascuna particella di gating dalla posizione 1 alla 2 ovvero, la differenza di energia tra le due posizioni in assenza di un potenziale di membrana. Lequazione di Boltzmann dà una curva sigmoide in un grafico lineare di Po in funzione di V. Quanto più elevata è z tanto maggiore è la pendenza della curva

21 Fittando i dati sperimentali di H&H per il Na e per il K con lequazione si ottiene z(K) 3.9 e z(Na) 4.8 Z=4.8 (Na) Z=3.9 (K) C o n d u t t a n z a ( S ) Voltaggio (mV) P r o b. c a n a l e a p e r t o G max

22 1)Semplicemente potrebbe essere la quantità di carica mossa da un lato allaltro della membrana durante il processo di gating. 2)Potrebbero però esistere più particelle di gating per canale. Che significato ha il valore di z? Per esempio con quattro particelle che si muovono indipendentemente, il valore di z ottenuto applicando la precedente equazione si riferirebbe a ciascuna singola particella e la carica di gating per lintero canale sarebbe 4z.

23 R= joule·K -1 ·mol -1 k= · joule·K -1 R=N A ·k (6.0222·10 23 mol -1 · · joule·K -1 ) N A Numero di Avogadro: n. di molecole contenute in una mole (6.0222·10 23 mol -1 ) F=96490 C·mol -1 V=statVolt (299.8 volt)=erg/ues=10 -7 joule/0.333 ·10 -9 C e o carica elementare dellelettrone ( · C) o = G o /mol F/RT=e o /kT Alcune definizioni…..

24 A 0 mV Lattività del canale è caratterizzata dalla relativa stabilità dello Stato Attivato rispetto a quello chiuso e non dipende dalla posizione delle cariche rispetto al campo elettrico, dal momento che non cè un gradiente di potenziale elettrico.

25 A ) = o( A ) C) = o(C) Bagno Citoplasma Membrana EMEM 0 mV Distribuzione di Boltzmann Basata solo su o E M Nessun Effetto E M Nessun Effetto A ) = o( A ) C) = o(C) + + (Gate) = z G · F · 0 mV = 0 C A Energia

26 A -70 mV Lattività del canale è caratterizzata dalla relativa stabilità dello Stato Chiuso e dipende dalla posizione delle cariche rispetto al campo elettrico, dal momento che cè un gradiente di potenziale elettrico.

27 A ) Bagno Citoplasma C Membrana EMEM -70 mV La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo stato C E M Stabilizzante + + A (Gate) = z G · F · 0 mV = 0 (Gate) = z G · F · -70 mV < 0 E M Destabilizzante o( A ) o(C) Energia C)

28 a +40 mV Lattività del canale è caratterizzata dalla relativa stabilità dello Stato Attivato e dipende dalla posizione delle cariche rispetto al campo elettrico, dal momento che cè un gradiente di potenziale elettrico.

29 Bagno Citoplasma Membrana E M Destabilizzante + + EMEM +40 mV La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo Stato A C A (Gate) = z G · F · 0 mV = 0 (Gate) = z G · F · 40 mV > 0 E M Stabilizzante A ) = o( A ) C) = o(C) A ) C) Energia

30 Il gating dei canali voltaggio-dipendenti Come fa il voltaggio ad aprire i canali? Il controllo dellattività dei canali per mezzo del voltaggio è la chiave che sta alla base delleccitabilità neuronale e del signalling ovvero

31 Canali ionici voltaggio-dipendenti Famiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM) Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunità Ciascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P) Vi appartengono: Canali voltaggio-dipendenti del Na +, Ca 2+ e K + Canali del K + Ca 2+ -attivati Canali cationici attivati dalliperpolarizzazione, ecc. Questa è una delle 4 (pseudo)subunità H5 I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio

32 X 4

33 Nel canale del K + Shaker, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici regolarmente distribuiti ogni 3 aa. Canale chiuso: la 2 a Arg di S4 è seppellita nel bilayer Canale aperto: la 2 a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4 o e 5 o residui basici si muovono dal citosol allinterno del bilayer Attiva la spirale

34 Il movimento del sensore del voltaggio, facendo aprire il canale, produce una corrente ionica +50 mV -100 mV 1000 pA Corrente Ionica

35 +50 mV -100 mV Corr. di Gating Soluzione senza K pA 10 pA 1 ms Corrente Ionica Il movimento del sensore del voltaggio produce anche una corrente di gating come è possibile smascherare la corrente di gating?

36 +50 mV -100 mV 10 pA 1 ms Carica totale di gating Numero dei canali = cariche elementari / canale Corr. di Gating Soluzione senza K + Il movimento del sensore del voltaggio produce una corrente di gating I g = dq g /dt q g = I g dt

37 Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL q/n (e - charges) R K R neutral AA R=arginina K=lisina

38 ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL q/n (e - charges) R K R neutral AA Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica

39 Nel canale del K + Shaker la presenza di 4 segmenti S4 che fungono da sensori del voltaggio intrinseci spiega la ripida dipendenza dellattivazione del canale dal voltaggio. Le 4 subunità identiche si muovono verso il lato extracellulare in due fasi distinte: 1)Prima indipendentemente luna dallaltra; 2)Poi in maniera cooperativa, portando allapertura.

40

41 MacKinnon_Nature01473.pdf MacKinnon_Nature01580.pdf MacKinnon_Nature01581.pdf

42 Struttura del Canale K + Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix La visione del tetramero del canale K + è dal lato intracellulare. Ciascuna subunità è colorata separatamente e contiene 6 -eliche (etichettate S1-S6 alle loro estremità N- terminali nella subunità blu). Le eliche S5-S6 formano il poro e il filtro di selettività per il K +. Le eliche S4 formano i sensori del voltaggio. Gli ioni K + sono colorati in verde.

43 Struttura del Canale K + Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix Visione laterale. È indicato lo spessore della membrana (40 A)

44 Conformazioni del Sensore del Voltaggio Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K + ; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata lossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K +. Chiuso: V r =-100 mV

45 Conformazioni del Sensore del Voltaggio Aperto: depolarizz. Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K + ; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata lossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K +.

46 Lo stato chiuso prevale al potenziale di riposo della cellula (~ -100 mV). Lo stato aperto è favorito da una depolarizzazione della membrana. In questo modello, S2 è assunto rimanere inalterato durante lo switch; S3a e S3b subiscono dei riarrangiamenti sostanziali; si ipotizza che anche la connessione tra S4-S5 sia rimodellata.

47 Ingrandimento del Sensore del Voltaggio chiuso Una Subunità, Chiusa: Delle eliche S2-S4 è mostrata lossatura. Le arginine che conferiscono la sensibilità al voltaggio, sono mostrate come bastoncini colorati. Sono mostrati anche lossatura del filtro di selettività e gli ioni K +.

48 Ingrandimento del Sensore del Voltaggio In aggiunta al movimento della paletta sensore del voltaggio", notare nello stato aperto la formazione di un ponte salino (legame ionico) tra lAsp 80 e lArg 133. aperto

49 Accessibilità dei Residui Interno Nella conformazione chiusa, i residui evidenziati in magenta sono esposti allo spazio interno.

50 Accessibilità dei Residui Nella conformazione aperta, i residui evidenziati in rosso sono vicini allo spazio esterno (10 Å) o si estendono verso di esso. Esterno

51 La struttura del canale del K + KvAP è descritta in: A. Jiang Y, Lee A, Chen J, Ruta V, Cadene M, Chait BT, & MacKinnon, R. (2003) "X-Ray Structure of a Voltage- Dependent K + Channel". Nature 423: 33 I movimenti delle palette del voltaggio sono descritti in: B. Jiang Y, Ruta V, Chen J, Lee A, & MacKinnon, R. (2003) "The principle of gating charge movement in a voltage- dependent K + Channel". Nature 423: 42 [1ORQ.pdb & 1ORS.pdb]

52 FINE


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