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Genomica e modelli animali di malattie umane Mariateresa Mancuso BIOTEC-MED I giovedì della cultura scientifica “Etica e sperimentazione animale nella.

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Presentazione sul tema: "Genomica e modelli animali di malattie umane Mariateresa Mancuso BIOTEC-MED I giovedì della cultura scientifica “Etica e sperimentazione animale nella."— Transcript della presentazione:

1 Genomica e modelli animali di malattie umane Mariateresa Mancuso BIOTEC-MED I giovedì della cultura scientifica “Etica e sperimentazione animale nella ricerca biomedica”

2 Piccole dimensioni: facile da manipolare, bassi costi di mantenimento Similarità fisiologica e genetica con l’uomo Alto tasso di fertilità: progenie multipla ottenibile ogni 9 settimane Mus Musculus : organismo modello nella ricerca biomedica Organismo complesso

3 Confronto tra il genoma del topo e dell’uomo   14% più piccolo (2.5 bilioni di basi versus 2.9)  Entrambi contengono circa geni codificanti proteine  80% dei geni in omologia Il genoma del topo è facilmente manipolabile   > 90% di sintenia 350 regioni conservate Topo Uomo Cromosomi di topoCromosomi umani

4 TOPI INBRED Accoppiamento tra fratello-sorella per generazioni successive  98.6% di omozigosi a tutti i loci  Minima variabilità genetica in una popolazione  Possibilità di fissare uno specifico fenotipo Suscettibilità o resistenza allo sviluppo di tumori spontanei

5 La suscettibilità e/o la resistenza all’insorgenza di un particolare tumore può essere ottenuta tramite un programma di accoppiamento selettivo bidirezionale mediante applicazione di un protocollo di cancerogenesi chimica a due stadi Selezione genetica delle linee Car-S e Car-R F0 Car-R(F16) Car-S(F19 ) A DBA/2 PSWR SJL CBABALB/cC57BL/6 F1F1F1F1 F2 F2 DMBA-TPA- Basse dosi DMBA-TPA- Alte dosi Differenza in termini di suscettibilità > di 100 volte Alcuni geni coinvolti nella suscettibilità e nella resistenza sono stati identificati

6 Mutazioni multiple casuali introdotte nella linea germinale mediante l’utilizzo di cancerogeni chimici permettono di identificare singole mutazioni responsabili dell’insorgenza di un determinato fenotipo …primi tentativi di manipolazione genetica del genoma murino Primo modello animale utilizzato per studi quantitativi e meccanicistici dell’induzione di neoplasie intestinali Topi Min (Multiple intestinal neoplasia) Ottenuti mediante mutagenesi germinale con ENU C57Bl/6 Adenocarcinomi intestinali Fenotipo primario trasmesso alla progenie Poliposi adenomatosa familiare Ch18. Mutazione non-senso nel codone 850 del gene murino Apc Mutazione Min Mutazione eterozigote del gene APC (oncosoppressore) Topi Min (Multiple intestinal neoplasia) Ottenuti mediante mutagenesi germinale con ENU C57Bl/6 Adenocarcinomi intestinali Fenotipo primario trasmesso alla progenie Poliposi adenomatosa familiare Ch18. Mutazione non-senso nel codone 850 del gene murino Apc Mutazione Min Mutazione eterozigote del gene APC (oncosoppressore)

7  Impossibilità di controllare i geni bersaglio da modificare  Necessità di vasti programmi di allevamento  Difficoltà di identificare i fenotipi recessivi Lo sviluppo delle nuove metodologie per manipolare il genoma murino ha rivoluzionato la capacità di generare modelli animali di malattie umane Animali geneticamente modificati Knockout patologie dovute ad assenza di funzione Transgenici patologie dovute ad alterazione di funzione

8 Promotore ATG P(A) Gene/cDNA di interesse TOPI FONDATORI Il modello che meglio rappresenta la malattia umana deve essere selezionato osservando la progenie di vari topi fondatori Possono differire per numero di copie inserite (2-50) Effetto posizionale Alterazione dell’espressione di un gene endogeno TOPI TRANSGENICI Patologie dovute ad alterazione di funzione Femmina balia Microiniezione In grado di trasmettere il carattere per via ereditaria Analisi del DNA

9 Neo Costrutto TOPI KNOCKOUT Patologie dovute ad assenza di funzione Selezione delle cellule KO mediante trattamento con la neomicina Microiniezione Knockout omozigote (-/-) Impianto in una femmina balia Chimera Knockout eterozigote (+/-) L’assenza di funzione di un gene è spesso incompatibile con la vita Cellule ES Elettropolazione Ricombinazione Cellula ES con un gene mutato

10 La speranza è che il topo mutante esibisca sintomi simili ai soggetti umani e che la patogenesi sia simile in entrambe le specie  Studiare gli stadi precoci prima della comparsa dei sintomi  Possibilità di individuare in vivo i bersagli di farmaci in via di sperimentazione

11 Malattie metaboliche e ormonali Fibrosi cistica Ipercolesterolemia familiare Arteriosclerosi K K,T K Cftr Ldlr Fmr1 Malattie immunologiche ed ematologiche Emofilia A Talessemia  Talessemia  KKKKKK C/8 Hba Hbb Malattie della vista e dell’udito Retinite pigmentosa Degenerazioni della retina TTTT Rho Prph2 Disfunzioni della cresta neurale Albinismo oculocutaneo Sindrome di Waardenburg TKTK Tyr Mitf mi Malattie neurologiche e neuromuscolari Morbo di Alzheimer Ataxia telangiectasia Sindrome X fragile K,T K App Atm Fmr1 Sindromi familiari di predisposizione al tumore Retinoblastoma familiare Poliposi adenomatasa del colon Sindrome di Li-fraumeni Sindrome di Gorlin KKKKKKKK Rb Apc p53 Ptch Sono centinaia i modelli animali di malattie umane a carattere monogenico attualmente disponibili

12 SINDROME DI GORLIN Predisposizione alla tumorigenesi spontanea e radioindotta Medulloblastoma (10%) Sarcomi Fibromi ovarici Basalioma (dopo irraggiamento) Malattia ereditaria autosomica dominante con una incidenza stimata pari a 1/ Difetto costituzionale in una delle due copie di un gene soppressore tumorale (Patched1) BASALIOMA MEDULLOBLASTOMA RI  Identificazione e caratterizzazione molecolare delle lesioni preneoplastiche  Dipendenza dall’età al momento dell’irraggiamento  Possibilità di identificare la cellula bersaglio  Sperimentare terapie farmacologiche e geniche Numerose anomalie nello sviluppo Ritardo mentale Crescita eccessiva del corpo Ptch1 -/- letale Ptch1 +/- fenocopia della sindrome di Gorlin

13 Cre è una ricombinasi sito-specifica che riconosce la sequenza lox P del fago P1. Quando due siti lox P vengono inseriti nel DNA, la proteina Cre promuove la rimozione del frammento di DNA compreso tra i lox P. Questa strategia viene utilizzata per produrre modelli knockout condizionali in cui è possibile accendere o spegnere l’espressione di un gene in un determinato tipo cellulare. Estremamente vantaggiosa quando sono coinvolti geni la cui mutazione risulterebbe letale. Incrociando un topo che porta il gene di interesse, fiancheggiato da due sequenze lox P, con uno in cui il gene Cre si trova sotto il controllo di un promotore tessuto-specifico, si ottiene un organismo in cui il gene verrà rimosso solo nelle cellule che esprimono Cre. TOPI KNOCKOUT CONDIZIONALI: il sistema Cre/lox P

14 Nel 50% dei casi di tumore mammario familiare sono state riscontrate mutazioni del gene Brca1. La mancanza di Brca1 causa una precoce mortalità embrionale Mutante condizionale in cui si determina la rimozione dell’esone 11 di Brca1 solo nelle cellule epiteliali del tessuto mammario Tumore mammario Bassa frequenza Lunga latenza Quali altri geni sono coinvolti nello sviluppo del tumore mammario ? Mutanti condizionali per Brca1 e p53 +/- : il 73% sviluppa il tumore La perdita di p53 accelera lo sviluppo tumorale delle ghiandole mammarie di topi che presentano una specifica delezione di Brca1 MUTANTI CONDIZIONALI PER LO STUDIO DEL TUMORE MAMMARIO

15 CONCLUSIONI  La progressione della malattia può essere seguita in ambiente altamente controllato  Ci permettono di studiare la malattia in numerosi individui con un background omogeneo.  Anche quando il modello animale non ricapitola pienamente la malattia umana, può comunque fornire importanti indicazioni delle differenze interspecifiche e della suscettibilità individuale  Disporre di un modello animale premette di testare l’azione di nuovi farmaci e pone le basi per una possibile terapia genica Malattie a carattere poligenico: obiettivo primario nel futuro della ricerca biomedica Come fareste senza di me?


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