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Studio SAS dell’equilibrio monomero-dimero della ß-lactoglobulina Seminario XVIII Ciclo Dottorato in Fisica-Universita’ di Perugia Dottoranda: Maria Grazia.

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1 Studio SAS dell’equilibrio monomero-dimero della ß-lactoglobulina Seminario XVIII Ciclo Dottorato in Fisica-Universita’ di Perugia Dottoranda: Maria Grazia Ortore Tutore: Prof. Giuseppe Onori

2 Struttura delle proteine sequenza funzionalità conformazione La catena peptidica è costituita da 20 tipi di aminoacidi (a) Struttura primaria(b) Struttura secondaria (c) Struttura terziaria(d) Struttura quaternaria  elica foglietto  dominio

3 Protein Unfolding: perchè usare la pressione? 1895 Royer scoprì che un’elevata pressione idrostatica può inibire la crescita di batteri Hite utilizza la pressione per la conservazione del latte Bridgman nota che il bianco dell’uovo sembra cotto dopo un trattamento in pressione. Benché non sia intuitivo, anche le proteine denaturano con la pressione. Questa modifica la compressibilità, il volume, la flessibilità e di conseguenza la funzionalità della proteina.

4 Trattamento termico Agenti chimici denaturanti Trattamento in pressione  le eccitazioni termiche modificano le interazioni  si modifica la cinetica  a basse concentrazioni hanno un effetto indiretto modificando le caratteristiche del solvente  ad alte concentrazioni possono rompere i ponti salini (acidi), i legami idrogeno e disolfuro (urea)  modificano l’attività enzimatica  agisce fondamentalmente modificando i volumi

5 Panorama termodinamico Capacità termica C p = (  H/  T) p kT C p = T > 2 Fattore di compressibilità  = -1/V(  V/  p) T kT  V= > 2 Fattore di espansione  = -1/V(  V/  T) p kT  V = > 2 P T  S=0  V=0 Smeller (BBA 2002) Teoria di Hawley  G = G U -G N  G =  G 0 –  S 0 (T-T 0 ) –  C p [(T-T 0 )+ln(T/T 0 )]+  V 0 (p-p 0 ) +  /2(p-p 0 ) 2 +  (p-p 0 )(T-T 0 )  G=0

6 Quali tecniche usare? Vantaggi del SAS: perturbo poco il sistema ottengo informazioni sia sulle caratteristiche strutturali, sia sulle interazioni in condizioni sperimentali molto diverse (pH, temperatura, pressione, forza ionica)

7 SANS o SAXS? SANS SAXS Densita’ di lunghezza di scattering isotopico b e magnetico B Densita’ elettronica Sorgenti dal flusso deboleAlta brillanza delle sorgenti 0.2  10 Angstrom0.5  2 Angstrom Diversi segnali da H e da DPoca visibilita’ degli H Bassa lunghezza di penetrazione all’interno del campione Possibile danneggiamento del campione

8 due monomeri costituiti ciascuno da 162 aminoacidi e di peso Da appartiene alla famiglia delle lipocaline è contenuta nel latte  -Lactoglobulina

9 funzionalità struttura Interazioni proteina-proteina in soluzione Aspetti energetici e geometrici del riconoscimento molecolare

10 A temperatura ambiente e pH neutro la  -Lg è un dimero (la carica teorica del monomero è –8). A pH acido (condizione fisiologica) si perde la struttura quaternaria, ma i monomeri conservano le proprie caratteristiche strutturali. A pH acido (pH=2.3) una forza ionica variabile è in grado di modificare l’equilibrio monomero-dimero. Curve SAXS per la  -Lg a concentrazione 10mg/ml, pH=2.3 e forza ionica crescente. F.I.=7mM R g =17.9±0.3 F.I.=507mM Rg=20.7±0.3 Macromolecules (1999), 32,

11 Kratky plot di curve SAXS: Beta-lactoglobulina 10mg/ml pH=2.3 T=20°C F.I.=7-507 mM Frazione di monomeri di beta-lactoglobulina A) in funzione della concentrazione C di proteina stessa (le bande sono ottenute dall’analisi dei coefficienti di diffusione, i punti da dati SAXS) B) in funzione della forza ionica e a C=10mg/ml (le bande sono ottenute da dati SAXS, i punti dall’analisi dei coefficienti di diffusione) Macromolecule (1999), 32,

12 Approccio teorico alla tecnica SAS: Consideriamo il solvente come un dielettrico continuo ed uniforme e utilizziamo un modello a due ‘macroioni’ Assumiamo interazioni solo a simmetria sferica Richiami alla teoria generale: Sezione d’urto differenziale Utilizzando un modello a due fasi:  : contrasto elettronico p:numero di specie di proteine V i, n i :volume e densità numero della specie iesima F i (Q) : fattore di forma S ij (Q): fattore di struttura parziale g ij (r): funzione di distribuzione di coppia g ij (r)=exp(-  W ij (r)) W ij (r): potenziale di forza media

13 interazione fra le specie i-j interazione fra le specie i-j e le altre macroparticelle in soluzione Potenziale a sfere dure Potenziale Coulombiano K D : lunghezza di schermo di Debye (dipende in maniera nota da forza ionica e controioni)  : costante dielettrica del mezzo Deve esserci un’interazione attrattiva responsabile dell’aggregazione dei monomeri in dimeri contributo non elettrostatico, parametro libero nell’analisi di best fit

14 Curve SAXS e relativi fit : Beta-lactoglobulina 10mg/ml pH=2.3 T=20°C Funzioni di distribuzione di coppia risultanti dall’analisi delle curve SAXS. A sinistra approssimazione ordine 0, a destra di ordine 1. Puntini: monomero monomero, tratteggio: monomero dimero, linea: dimero dimero. Biophysical Journal (2002), 82,

15 Ethylene Glycol: HOCH 2 CH 2 OH

16 Andamento della costante dielettrica in funzione della percentuale di glicol-etilenico in soluzione

17 Esperimenti preliminari pH=2.3 forza ionica: 0÷200 mM glicol etilenico: 0÷50% w/w T=10÷50°C P=1÷1800 bar Analisi preliminare : approssimazione di Guinier Valida per con Ad esempio per una sfera di raggio R : ~

18 A termocoppia B cella a pressione dove arriva il fascio C sensori per la pressione D valvola pneumatica che equilibra i due circuiti a pressione E valvola a doppio braccio F pompa per generare alte pressioni G motore per la pompa Cella a pressione ad Elettra (Trieste)

19 Studio in pressione in presenza di solvente organico

20 Esperimento in preparazione: SANS LABORATOIRE LEON BRILLOUIN,Saclay, France Cella a pressione : 1÷7Kbar

21 Esperimenti futuri Verificare quanto sia significativo il parametro  r utilizzando alcool in diversa percentuale come solventi; Analizzare il panorama sperimentale a pressioni piu’ elevate; Migliorare il metodo di analisi dati.


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