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2° PARTE: ATTIVAZIONE DI LINFOCITI E DI MAST CELLS Rafts seminario.

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1 2° PARTE: ATTIVAZIONE DI LINFOCITI E DI MAST CELLS Rafts seminario

2 ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI B Lipid rafts

3 Struttura dei recettori per l’antigene e vie di segnalazione I recettori per l’antigene sulle cellule B (B-cell receptor, BCR) e T (T-cell receptor, TCR) sono complessi multiproteici fatti da catene di legame con l’antigene variabili clonalmente che sono associate con proteine accessorie invarianti. Catene immunoglobuliniche pesante e leggera nel BCR Catene TCRα e TCRβ nel TCR chains in the T-cell receptor. Le catene invarianti sono necessarie sia per il trasporto dei recettori fino alla superficie cellulare che, in modo più importante, per iniziare il processo di segnalamento quando i recettori si legano ad un ligando extracellulare. Il legame di un antigene con un recettore genera segnali che portano come conseguenza finale l’attivazione di fattori di trascrizone nucleari che accendono una nuova espressione genica e spengono geni tipicamente espressi nelle cellule non attivate.

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5 Attivazione dei linfociti B (1)

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7 Attivazione dei linfociti B (2) In seguito alla maturazione nel midollo osseo e milza, le cellule immunocompetenti B rimangono nei tessuti periferici finchè non incontrano un antigene e vengono attivate. L’attivazione delle cellule B richiede due segnali distinti e dà origine al differenziamento delle cellule B in “cellule B della memoria” o in plasmacellule. Il primo segnale di attivazione ha luogo dopo legame dell’antigene a “B cell receptors”, (BCRs). Dopo legame con il BCR l’antigene viene internalizzato mediante endocitosi mediata da recettore, digerito, e complessato con molecole di MHC II sulla superficie delle cellule B.

8 Attivazione dei linfociti B (3) Il secondo segnale di attivazione ha luogo sia mediante meccanismi timo- dipendenti o indipendenti. La maggior parte delle risposte delle cellule B all’antigene richiedono l’interazione delle cellule B con cellule “T helper” (attivazione timo- dipendente). La presentazione di una complesso antigene-class II MHC da una cellula B le permette di agire come cellule presentatrice di antigene (APC) alle cellule T. I “T cell receptors”, TCR) sulle cellule “T helper” si legano alla molecola MHC di classe II complessata all’antigene sulla superficie della cellula B provocando l’attivazione della cellula T. La cellula T attivata a sua volta fornisce un secondo segnale alla cellula B, che può avere luogo mediante una gran varietà di proteine. Viceversa, ci sono alcuni tipi di antigeni che possono fornire direttamente un secondo segnale di attivazione per le cellule B (attivazione timo-indipendente). Questi antigeni includono componenti di della parete cellulare di alcuni batteri (ad es. lipopolisaccaride) o antigeni contenenti molecole altamente ripetute (ad es. flagellina batterica).

9 Attivazione dei linfociti B (4) Una volta attivate, le cellule B proliferano e formano centri germinali dove si differenziano in cellule B della memoria o in plasmacellule. In seguito al differenziamento in plasmacellule, segnali addizionali iniziano la comutazione della classe di anticorpi della plasmacellule e regolano la secrezione degli anticorpi. La funzione principale delle plasmacellule è la secrezione di anticorpi specifici per il clone di cellule B. Ogni plasma cellula secerne anticorpi contenenti una regione di legame con l’anticorpo unica clonalmente riunita ad una regione costante definente l’isotipo di immunoglobulina (Ig).

10 Attivazione dei linfociti B (5) Delle chinasi della famiglia Src sono associate ai recettori per l’antigene e fosforilano le tirosine negli ITAMs Le chinasi della famiglia Src legate alla membrana Fyn, Blk, e Lyn si associano con il “B-cell antigen receptor” mediante legame ai motivi ITAMs, sia mediante i loro N-terminali o, come illustrato, mediante legame a tirosine fosforilate singole tramite i loro domini SH2. Dopo legame con il ligando e aggregazione dei recettori, essi fosforilano le tirosine negli ITAMs delle catene citoplasmatiche di Igα e Igβ.

11 The function of the BCR in B-cell activation Following antigen binding (a), the B-cell receptor (BCR) triggers a signal-transduction cascade (b), which leads to the transcriptional activation of genes associated with B-cell activation. The BCR is internalized (c) and either degraded (d) or trafficked to an intracellular compartment termed the MIIC (e), where newly synthesized major histocompatibility complex class II (MHC) molecules and peptides derived from the antigen bound to the BCR are formed into complexes. The antigen-processing and BCR-degradation pathway might not be identical and are shown here to occur in two different endosomal compartments. The peptide–MHC complexes are subsequently transported to the cell surface, where they are recognized by the T-cell receptor (TCR) of T-helper cells (f), leading to T-cell activation (g). The activated T cell provides 'help' to the B cell, leading to full B-cell activation (h) through both secreted cytokines and cell–cell interactions mediated by receptor pairs such as CD40–CD154. Ig, immunoglobulin.CD40CD154 Nat Rev Immunol Feb;2(2): Lipid rafts and B-cell activation. Pierce SK.

12 Pierce SK. Lipid rafts and B-cell activation. Nat Rev Immunol Feb;2(2): Modello del ruolo dei rafts nel segnalamento mediato dal recettore FcRI (recettore per le IgE) -- 1 A. Nelle cellule non stimolate, la IgE monomerica si lega al suo recettore. La tirosina chinasi Lyn, un non recettore, può associarsi costitutivamente a piccoli rafts, instabili. L’autofosforilazione è necessaria per un’attività di Lyn efficace. Nelle cellule non stimolate. L’attività di Lyn è mantenuta bassa dai suoi frequenti incontri con fosfatsi non-associate ai rafts.

13 Brown DA. Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Physiology (Bethesda) Dec;21: Modello del ruolo dei rafts nel segnalamento mediato dal recettore FcRI (recettore per le IgE) -- 2 B: stimulation by binding of multivalent antigen clusters IgE receptors and induces formation of larger, stabilized rafts that contain both IgE receptor and Lyn. The presence of Lyn in these rafts shields the kinase from non-raft-targeted phosphatases, increasing its activity and enhancing phosphorylation of the IgE receptor and other substrates, leading to downstream signaling..

14 Pierce SK. Lipid rafts and B-cell activation. Nat Rev Immunol Feb;2(2):

15 Simons K, Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol Oct;1(1):31-9.

16 Attivazione dei linfociti B (2) In seguito alla maturazione nel midollo osseo e milza, le cellule immunocompetenti B rimangono nei tessuti periferici finchè non incontrano un antigene e vengono attivate. L’attivazione delle cellule B richiede due segnali distinti e dà origine al differenziamento delle cellule B in “cellule B della memoria” o in plasmacellule. Il primo segnale di attivazione ha luogo dopo legame dell’antigene a “B cell receptors”, (BCRs). Dopo legame con il BCR l’antigene viene internalizzato mediante endocitosi mediata da recettore, digerito, e complessato con molecole di MHC II sulla superficie delle cellule B. Il secondo segnale di attivazione ha luogo sia mediante meccanismi timo-dipendenti o indipendenti. La maggior parte delle risposte delle cellule B all’antigene richiedono l’interazione delle cellule B con cellule “T helper” (attivazione timo-dipendente). La presentazione di una complesso antigene-class II MHC da una cellula B le permette di agire come cellule presentatrice di antigene (APC) alle cellule T. I “T cell receptors”, TCR) sulle cellule “T helper” si legano alla molecola MHC di classe II complessata all’antigene sulla superficie della cellula B provocando l’attivazione della cellula T. La cellula T attivata a sua volta fornisce un secondo segnale alla cellula B, che può avere luogo mediante una gran varietà di proteine. Viceversa, ci sono alcuni tipi di antigeni che possono fornire direttamente un secondo segnale di attivazione per le cellule B (attivazione timo-indipendente). Questi antigeni includono componenti di della parete cellulare di alcuni batteri (ad es. lipopolisaccaride) o antigeni contenenti molecole altamente ripetute (ad es. flagellina batterica).

17 ATTIVAZIONE LINFOCITI T

18 Clustering of the T-cell receptor and a co-receptor initiates signaling within the T cell When T-cell receptors become clustered on binding MHC:peptide complexes on the surface of an antigen-presenting cell, activation of receptor-associated kinases such as Fyn leads to phosphorylation of the CD3γ, δ, and ε ITAMs as well as those on the ζ chain. The tyrosine kinase ZAP-70 binds to the phosphorylated ITAMs of the ζ chain, but is not activated until binding of the co-receptor to the MHC molecule on the antigen-presenting cell (here shown as CD4 binding to an MHC class II molecule) brings the kinase Lck into the complex. Lck then phosphorylates and activates ZAP-70.antigen Fyntyrosine kinaseZAP-70co-receptorCD4Lck

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20 T-cell receptor, TCR

21 Signalling in rafts mediato da T-cell antigen receptor (TCR) Simons K, Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol Oct;1(1):31-9.

22 Segnalamento mediato dal recettore per l’antigene dei linfociti T (1) Anche il «T-cell antigen receptor» (TCR) è un recettore multisubunità per la risposta immune che si inserisce nei rafts lipidici durante il processo di segnalamento. IL TCR è composto da eterodimeri αβ che si associano con il complesso CD3 (γδε) e con l’omodimero ζ. Mentre le subunità α e β contengono i siti extracellulari di legame per peptidi che sono presentati dal complesso di proteine di classe I e II del complesso di maggiore istocompatibilità «MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX» (MHC) sulla superficie di cellule presentatrici di antigene (“ANTIGENPRESENTING CELLS2, APCs), le subunità CD3 e ζcontengono motivi citoplasmatici ITAMs. Simons K, Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol Oct;1(1):31-9.

23 Segnalamento mediato dal recettore per l’antigene dei linfociti T (2) L’evento di segnalamento più precoce dopo il collegamento con il TCR è la fosforilazione dei residui di tirosina dei motivi ITAM da tirosina chinasi Src-like doppiamente acilate (non recettrici), Lyn e Fyn. Quando ZAP-70 si lega agli ITAMs fosforilati viene attivata e asua volta fosforila LAT, una proteina transmembrana che accoppia l’attivazione mediata dal TCR a diverse altre vie di segnalamento. Diverse proteine GPI-linked e molecole acessorie aiutano ad amplificare gli eventi di attivazione delle cellule T. Le fosfatasi sono anche esse richieste per accendere o spegnere quelle vie. Simons K, Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol Oct;1(1):31-9.

24 Segnalamento mediato dal recettore per l’antigene dei linfociti T (3) Una serie complessa di eventi che coinvolgono il citoscheletro di actina porta alla formazione della sinapsi immunologica – zona di contatto fra cellule APC e le cellule T –dove ha luogo l’attivazione delle cellule T. Durante la formazione della sinapsi immunologica, la cellula T polarizza le reti di actina e dei microtubuli verso il sito di contatto e inoltre dirigge il traffico di membrane in quella direzione.

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26 T-cell antigen receptor signaling (1)

27 T-cell antigen receptor signaling (1) Il T cell antigen receptor (TCR) è una molecola che si trova sulla superficie dei linfociti T (T cells). E’ composto da eterodimeti αβ, complesso CD3 (γδε) e omodimero ξ. Le subunità α- e β contengono siti di legame extracellulare per peptidi che sono presentati dalla maggior parte delle proteine dei complessi di maggiore istocompatibilità (MHC) di classe I e classe II sulla superficie di cellule che presentano l’antigene (antigen presenting cells (APCs)). Le subunità CD3 e ξ- contengono motivi citoplasmatici ITAm. Durante i processi di segnalamento, il legame delle MHCs ai TCRs avvicina due o più recettori. Questo legame incrociato, somigliante al segnalamento da IgE, allora recluta “doubly acylated non-receptor Src-like tyrosine kinases”a fosforilare i residui di tirosina delle ITAMs. Oltre a reclutare Lyn, il segnalamento indotto da TCR recluta anche Fyn.

28 T-cell antigen receptor signaling (2) Successivamente, ZAP-70 (che è pure diversa nel caso da segnalamento mediato da IgE) si lega a ITMS fosforilati, il che porta alla sua stessa fosforilazone e all’attivazione di LAT. L’attivazione di LAT è la sorgente dell’amplificazione del segnale. Un’altra differenza fra il segnalamento modulato da IgE e del TCR è che l’attivazione di Lck svolta dal TCR potrebbe dare origine ad un’aggregazione più stretta e quindi ad una maggiore amplificazione del segnale. Per sotto-regolare il segnale, una possibile via è il legame della Csk citosolica alla proteina associata ai raft CBK. La Csk può allora sopprimere gli effetti indotti dalle chinasi della famiglia Src mediante fosforilazione.

29 Probabili eventi di segnalazione iniziali per un recettore per le IgE (Fc  RI) e per il “T-cell antigen receptor” (TCR) 1.La dimerizzazione del Fc receptor o di TCR/CD3 indotta dal ligando probabilmente aumenta la loro associazione ai rafts; 2.Ciò porta alla fosforilazione dei motivi “immune receptor tyrosine-based activation motifs” (ITAMs) del recettore da parte della famiglia Src delle proteina tirosina chinasi (es. Lyn, Lck e Fyn). 3.Gli ITAMs fosforilati fungono da punti di ancoraggio sulla membrana per la Syk/ZAP-70 citoplasmatica; anche queste sono tirosina chinasi e sono attivate nel raft mediante fosforilazione delle tirosine. 4.La Syk/ZAP-70 può, a sua volta, attivare alter proteine quali LAT, un adattatore associato ai rafts. Mediante crosslinking, la LAT può reclutare altre proteine verso il rafts e amplificare ulteriormente il segnale. La complessa cascata di eventi ulteriori di segnalamento a valle non è nota. 5.Un possibile modo di sottoregolare il segnale può avere luogo mediante legame di Csk citosolica alla proteina assciata ai raft CBP. 6.La csk può allora inattivare le chinasi della famiglia Src mediante fosforilazione. Simons K, Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol Oct;1(1):31-9.

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31 Kabouridisa & Jury, 2008 A model that correlates changes in the plasma membrane with TCR stimulation. In non-stimulated T-cells, the TCR is in monomeric form and its interaction with lipid rafts is transitory and unable to initiate signalling. Upon antigenic challenge, the reorganization of actin cytoskeleton results in formation of TCR microclusters and reduces the mobility of lipid rafts thus creating an environment conducive to long-lasting interactions. Concomitantly, the activity of Lck in lipid rafts increases owing to the action of a pool of CD45 molecules that moves to close proximity. These changes favour phosphorylation of ITAMs and initiation of signalling.

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33 Alonso & Milan, 2001

34 The role of signals 1 and 2 in T-cell activation. ‘Professional’ APCs, such as dendritic cells, provide more-effective costimulation (signal 2) and, therefore, efficently activate T cells. By contrast, even though ‘non-professional’ APCs, such as B cells or activated endothelial cells, can provide signal 1, they are less efficient at providing signal 2 and are more likely to induce anergy. Abbreviations used: APC, antigen-presenting cell; MHC, major histocompatibility complex; TCR, T-cell receptor

35 Probabili eventi di segnalazione iniziali per un recettore per le IgE (Fc  RI) e per il “T-cell antigen receptor” (TCR) 1.La dimerizzazione del Fc receptor o di TCR/CD3 indotta dal ligando probabilmente aumenta la loro associazione ai rafts; 2.Ciò porta alla fosforilazione dei motivi “immune receptor tyrosine-based activation motifs” (ITAMs) del recettore da parte della famiglia Src delle proteina tirosina chinasi (es. Lyn, Lck e Fyn). 3.Gli ITAMs fosforilati fungono da punti di ancoraggio sulla membrana per la Syk/ZAP-70 citoplasmatica; anche queste sono tirosina chinasi e sono attivate nel raft mediante fosforilazione delle tirosine. 4.La Syk/ZAP-70 può, a sua volta, attivare alter proteine quali LAT, un adattatore associato ai rafts. Mediante crosslinking, la LAT può reclutare altre proteine verso il rafts e amplificare ulteriormente il segnale. La complessa cascata di eventi ulteriori di segnalamento a valle non è nota. 5.Un possibile modo di sottoregolare il segnale può avere luogo mediante legame di Csk citosolica alla proteina assciata ai raft CBP. 6.La csk può allora inattivare le chinasi della famiglia Src mediante fosforilazione. Simons K, Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol Oct;1(1):31-9.

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37 Modelli su come il segnalamento potrebbe iniziare nei rafts Simons K, Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol Oct;1(1):31-9.

38 SIGNALLING MEDIATO DA IMMUNOGLOBULINA E NELLA RISPOSTA IMMUNE ALLERGICA

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40 Signalamento indotto dalle IgE Viene attivato quando una IgE si lega, mediante il suo segmento Fc a recettori (FcεRI) che resiedono nella membrana plasmatica di mast cells e basofili. Il crosslinking del FcεRI da antigeni oligomerici attiva il processo di segnalamento transmembrana, portando come risultato finale al rilascio dei mediatori chimici delle reazioni allergiche. Simons K, Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol Oct;1(1):31-9.

41 Signaling da IgE (1) – Mast cells, basofili

42 Signaling da IgE (2) La IgE prima si lega, mediante il segmento Fc, a recettori Fc-epsilon (FcεR) che risiedono nella membrana plasmatica di mast cells e basofili. Il FcεR è un tetramero che consiste di una catena α, una β e due γ. E’ monomerico e si lega ad una molecola di IgE. La catena α si lega a IgE e le altre tre catene contengono motivi di attivazione “immune receptor tyrosine-based activation motifs ( ITAMs). Antigeni oligomerici si legano alla IgE legata al recettore per formare legami incrociati tra due o più recettori. I legami incrociati a loro volta reclutano la “doubly acylated non-receptor Src-like tyrosine kinase Lyn” per fosforilare gli ITAMs. A questo punto, componenti della famiglia Syk di tirosina chinasi si legano a questi residui fosforilati degli ITAMs per iniziare le cascate di fosforilazione. Il Syk can, a sua volta, attivare altre proteine come la “linker for activation of T cells” (LAT). Mediante legami incrociati, la LAT può reclutare altre proteine verso il raft e ampliare ulteriormente il segnale.

43 Modelli su come il segnalamento potrebbe iniziare nei rafts Simons K, Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol Oct;1(1):31-9.

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45 Nakayama H, Ogawa H, Takamori K, Iwabuchi K. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) Feb 28. GSL-Enriched Membrane Microdomains in Innate Immune Responses Many pathogens target glycosphingolipids (GSLs), which, together with cholesterol, GPI-anchored proteins, and various signaling molecules, cluster on host cell membranes to form GSL-enriched membrane microdomains (lipid rafts). These GSL-enriched membrane microdomains may therefore be involved in host–pathogen interactions. Innate immune responses are triggered by the association of pathogens with phagocytes, such as neutrophils, macrophages and dendritic cells. Phagocytes express a diverse array of pattern-recognition receptors (PRRs), which sense invading microorganisms and trigger pathogen- specific signaling. PRRs can recognize highly conserved pathogen-associated molecular patterns expressed on microorganisms. The GSL lactosylceramide (LacCer, CDw17), which binds to various microorganisms, including Candida albicans, is expressed predominantly on the plasma membranes of human mature neutrophils and forms membrane microdomains together with the Src family tyrosine kinase Lyn. These LacCer-enriched membrane microdomains can mediate superoxide generation, migration, and phagocytosis, indicating that LacCer functions as a PRR in innate immunity. Moreover, the interactions of GSL-enriched membrane microdomains with membrane proteins, such as growth factor receptors, are important in mediating the physiological properties of these proteins. Similarly, we recently found that interactions between LacCer-enriched membrane microdomains and CD11b/CD18 (Mac-1, CR3, or aMb2-integrin) are significant for neutrophil phagocytosis of non-opsonized microorganisms. This review describes the functional role of LacCer-enriched membrane microdomains and their interactions with CD11b/CD18.


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