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Alcuni argomenti trattati sono disponibili in formato PowerPoint al seguente indirizzo web: www.unipv.it/tslmra22 I recettori a sette domini transmembrana.

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1 Alcuni argomenti trattati sono disponibili in formato PowerPoint al seguente indirizzo web: I recettori a sette domini transmembrana

2 Forme di Signaling Cellulare (A) Gli ormoni prodotti dalle ghiandole endocrine sono secreti nel flusso sanguigno e possono essere distribuiti allintero organismo. (B) I messaggeri paracrini sono rilasciati dalle cellule nel mezzo extracellulare e possono diffondere e agire localmente. (C) I segnali nervosi sono trasmessi lungo gli assoni a cellule bersaglio remote. (D) Il signaling contatto-dipendente richiede che le cellule siano a contatto luna con laltra membrana contro membrana. Le differenze cruciali tra le varie modalità riguardano la velocità e la selettività con cui I segnali sono trasmessi alle cellule bersaglio. (A) ENDOCRINO (B) PARACRINO (C) NEUROCRINO(D) CONTATTO-DIPENDENTE cellula endocrina Flusso sanguigno recettore cellula bersaglio ormone cellule bersaglio mediatore locale cellula segnalatrice neurone sinapsi cellula bersaglio corpo cellulare assone neurotrasmetttore cellula segnalatrice cellula bersaglio messaggero legato alla membrana

3 Trasduzione del Segnale da Recettori di Superfice ormone citochina fattore di crescita recettore accoppiato a proteina G recettore tirosin chinasi recettore per le citochine via dellAMPc via dellIP 3 via del PI 3-kinasi via delle MAP kinasi via del JAK-STAT

4 recettore tsqi G proteina cAMP Ca 2+ messaggero intracellulare enzimacanale effettore Signalling mediante recettori accoppiati a proteine G

5 Regioni Idrofobiche e idrofiliche dei lipidi di membrana Lipide di membrana Idrofobico + Idrofilico = Anfipatico Glicerofosfolipide Sfingomielina Glicosfingolipide Colesterolo Diacilglicerolo Ceramide Anelli idrocarburici Alcool fosforilato Fosforilcolina Residui glucidici Gruppo OH di C 3 Glicerofosfolipide Glicosfingolipide Colesterolo

6 Lipidi di Membrana semplice organizzazione di molecole anfipatiche Lipidi di Membrana Sezione di un bilayer di glicerofosfolipidi idrofilico idrofobico

7 Tutte le membrane biologiche sono bilayers lipidici Le proteine conferiscono proprietà uniche a ciascun tipo di membrana

8 Proteine Acilate e Prenilate acido grasso legato mediante legame estere a una Cys; aggiunto in fase post-traslazionale Esempi: recettore per linsulina recettore beta-adrenergico rodopsina Acido palmitico Isoprenoide (farnesil;geranilgeranil) Isoprenoide legato mediante legame tioetere a una Cys vicina allestremità C-terminale; aggiunto in fase post-traslazionale Esempio: subunutà di proteina G (membrana plasmatica) Acido miristico acido grasso legato mediante legame amidico a una Gly; aggiunto in fase co-traslazionale Esempio: subunutà di proteina G (membrana plasmatica)

9 I Recettori Accoppiati a Proteine G (GPCR) rappresentano una famiglia di > 1000 membri strutturalmente correlati. Queste proteine sono anche chiamate Recettori a 7 Domini Transmembrana. Recettori accoppiati a proteine G (GPCR) siti di glicosilazione (legame tramite Asn) siti di fosforilazione ancoraggio lipidico citosol extracell.

10 Recettori Accoppiati a Proteine G 1. Hanno tutti 7 domini transmembrana (ad es. rodopsina) 2. Ci sono circa 1000 GPCRs nel genoma. (di molti di essi non si conosce ancora il ligando) 3. I singoli recettori rispondono a: un neurotrasmettitore come la serotonina o la dopamina, una piccola proteina (8-40 amminoacidi, un peptide) come le endorfine uno stimolo olfattorio la luce, nellocchio

11 Caratteristiche generali dei GPCRs comprendono: domini transmembrana ad -elica, ancoraggio ai lipidi che ne stabilizza la conformazione, siti di fosforilazione citosolici che ne regolano lattività, e siti di glicosilazione extracellulare che permettono linterazione con molecole extracellulari e altre cellule. Struttura Generale dei Recettori a 7 DT siti di glicosilazione (legame tramite Asn) extracell. citosol ancoraggio lipidico siti di fosforilazione dominio transmembrana

12 Rodopsina PDB 1F88 La Rodopsina è stato il primo membro della famiglia dei recettori a 7 DT ad avere la sua struttura determinata mediante cristallografia ai raggi-x

13 Gli effetti di queste interazioni includono alterata affinità per il ligando, dimerizzazione del recettore che può aumentarne o alterarne lattività, alterata localizzazione del recettore, ecc. Varie proteine interagiscono con I GPCR o Recettori a 7-DT per modularne lattività

14 RUOLO DELLA -ARRESTINA NELLA REGOLAZIONE DEI RECETTORI ACCOPPIATI A G-PROTEINE legame del messaggero fosforilazione del recettore interazione con -ARR associazione con CLATRINA Formaazione della vescicola endocitosi 1. Dopo un certo tempo che si è stabilito il legame dellagonista al GPCR, una kinasi (GRK) fosforila alcuni residui aminoacidici intracellulari del recettore; 2. La fosforilazione porta a un disaccoppiamento del GPCR dalla G proteina (desensitizzazione) e al reclutamento della b-arrestina; 3. La b-arrestina a sua volta recluta molecole di clatrina; 4. Le molecole di clatrina favoriscono la formazione di una cavità da cui originerà la vescicola 5. La successiva endocitosi della vescicola provocherà linternalizzazione del recettore.

15 Recettore di classe A Recettore di classe B Le Proprietà dellInternalizzazione definiscono due classi di GPCRs. Nel caso dei recettori di classe A ( - Adre), linterazione -arrestina–GPCR è transitoria, e la -arrestina non si localizza con i GPCR negli endosomi. Per i recettori di classe B (Vaso2), linterazione -arrestina–GPCR è più stabile, e recettore e –arrestina co- localizzano negli endosomi.

16 Traffico Cellulare della arr2-GFP con i Recettori 2AR (adre) e V2R (vasopr) Assenza di agonista, la arr2-GFP era omogeneamente distribuita nel citoplasma delle cellule che esprimevano 2AR o V2R. (0 min) Aggiunta di agonista, viene promossa la rapida redistribuzione dal citosol alla membrana plasmatica. (2 min) Una esposizione piu prolungata all agonista produceva una marcata differenza nel traffico della arr2-GFP (15 min): 2AR : rimaneva nella membrana plasmatica (A) V2R : nellarco di 2-3 min, finisce nellevescicole endocitotiche (B) Cellule HEK-293 Co-transfettate con un plasmide contenente il cDNA per arr2-GFP e il cDNA per ciscun recettore Per visualizzare la arr2-GFP fluorescente in cellule prima e dopo il trattamento con agonista (10 M Isoproterenol, 100nM AVP) adren vasopr

17 Colocalizzazione della arr2-GFP con i Recettori 2AR e V2R internalizzati Cellule HEK-293 Co-transfettate con arr2-GFP e ciascun recettore Pre-marcate con rodamina-conj. Anticorpo che marca I recettori trattate per 15 min a 37 C con lagonista (10 M Isoproterenol, 100nM AVP) visualizzazione al confocale del recettore (rosso) e della arr2-GFP (verde) nelle stesse cellule. Colocalizzazione (giallo) del recettore con la arr2-GFP V2R : estesa colocalizzazione 2AR : nessuna colocalizzazione I recettori 2AR e V2R reclutano arrestin con un meccanismo comune durante le fasi iniziali, ma poi cè divergenza. Il complesso arrestin- 2AR si dissocia a livello della membrana. arrestin-V2AR viene intenalizzato in vescicole endocitotiche. adren vasopr

18 esterno interno GTP GDP + P i Il neurotrasmettitore o lormone si lega al recettore Attiva una G proteina Risposta Effettore: enzima o canale Recettori accoppiati a proteine G Quanto veloce? da 100 ms a 10 s Quanto lontano? probabilmente <1 m


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