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Spettrometria di Massa. Cos’è uno spettrometro di massa Lo spettrometro di massa è uno strumento che produce ioni e li separa in fase gassosa in base.

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1 Spettrometria di Massa

2 Cos’è uno spettrometro di massa Lo spettrometro di massa è uno strumento che produce ioni e li separa in fase gassosa in base al loro rapporto massa/carica (m/z). Un’analisi mass spettrometrica può essere rappresentata dai seguenti passaggi: Introduzione del campione – Ionizzazione – Analisi della massa – Rivelazione degli ioni/analisi dei dati.

3 Scopi della spettrometria di massa Determinazione del peso molecolare Delucidazione della struttura molecolare Identificazione di componenti di una miscela Indagini quantitative Studi meccanicistici Studio di interazioni intermolecolari

4 Aree di interesse Proteomica Glicobiologia Genetica e medicina Biologia molecolare e cellulare Scienze ambientali Chimica dei polimeri Antiterrorismo Farmacologia Antidoping Archeologia Astronomia Analisi inorganica …e ancora tante altre

5 Caratteristiche della spettrometria di massa Intervallo di PM fino a centinaia di kDa Sensibilità dell’ordine delle picomoli o inferiore Acquisizione veloce dei dati Interfacce con metodi separativi Alta e bassa risoluzione

6 Spettrometria di massa Le molecole sono molto piccole! Ci vogliono approsimativamente molecole di acqua per fare un grammo! Per pesare le molecole conviene usare il dalton (Da). 1 Da corrisponde alla dodicesima parte dell'atomo di carbonio ( 12 C). In questa scala l'ossigeno ( 16 O) pesa 15,9949 e l'idrogeno ( 1 H) pesa 1, L'acqua pesa quindi circa 18 (18, ).

7 Alcune definizioni Massa Esatta: e' la massa "relativistica" dell'isotopo; non coincide quindi con la somma delle masse esatte dei protoni e neutroni contenuti, ma e' determinata anche dall'energia di legame (nucleare). L'unita' di misura e' ottenuta ponendo uguale a 12 esatto la massa dell'isotopo 12 C. Peso Atomico: (quello usato in stechiometria, per intendersi): e' la media ponderale delle masse esatte degli isotopi presenti in natura di quel particolare elemento.

8 Relative Isotope Abundance of Common Elements: ElementIsotope Relative Abundance Isotope Relative Abundance Isotope Relative Abundance Carbon 12 C C1.11 Hydrogen 1H1H100 2H2H.016 Nitrogen 14 N N.38 Oxygen 16 O O O.20 Sulfur 32 S S S4.40 Chlorine 35 Cl Cl32.5 Bromine 79 Br Br98.0

9 Quali sono i componenti di uno spettrometro di massa? Sistema di introduzione Sorgente ionica analizzatorerivelatore

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11 Spettro di massa

12 Modalità di ionizzazione Ionizzazione chimica –Chemical Ionization (CI) Bombardamento con atomi veloci –Fast Atom Bombardment (FAB) Ionizzazione termospray –Thermospray Ionization (TSP) Ionizzazione elettrospray –Electrospray Ionization (ESI) Ionizzazione chimica a pressione atmosferica –Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Desorbimento laser assistito da matrice –Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI) Hard Ionization: Ionizzazione elettronica –Electron Ionization (EI) Soft Ionization:

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14  Lo ione molecolare può non essere visibile  Eccessiva frammentazione  La sostanza deve essere volatilizzata

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16 Un campo magnetico è in grado di far deviare particelle cariche in movimento, per cui gli ioni provenienti dalla sorgente possono seguire la curvatura del tubo. L’entità della deviazione dipende dall’intensità del campo magnetico, dall’energia fornita dal potenziale elettrostatico e dal rapporto m/z dello ione. In particolare per ogni valore di potenziale elettrostatico e campo magnetico, solo ioni con un ben preciso rapporto m/z riusciranno ad attraversare la fenditura posta alla fine dell’analizzatore, ed arrivare quindi al collettore di ioni, che genera un segnale elettrico dipendente dall’intensità della corrente ionica che lo colpisce. Gli ioni sono accelerati da un intenso potenziale elettrostatico verso l’analizzatore.

17 L'analizzatore a quadrupolo consiste in un tubo rettilineo in cui è fatto il vuoto ed in cui sono presenti quattro barre parallele, disposte simmetricamente intorno all'asse del tubo, di sezione circolare oppure iperbolica. Le barre diametralmente opposte sono in contatto elettrico tra di loro, mentre tra barre adiacenti è applicata un voltaggio formato da due componenti: una differenza di potenziale continua e una oscillante ad alta frequenza. Lo ione entra nell'analizzatore parallelamente all'asse z, ed è spinto dai campi elettrici continuo e oscillante a seguire una traiettoria a spirale.

18  Peso molecolare della sostanza sotto indagine  Frammentazioni

19 H 35 Cl MW 36 (75%) H 37 Cl MW 38 (25%) Picchi isotopici: HCl m/z 36 (75%) m/z 38 (25%) Sorg. Analizzatore MS 6.02  molecole = 1 mol = g BILANCIA

20 Picchi isotopici: EtOH CH 3 CH 2 OH MW 46 CH 3 13 CH 2 OH MW % 13 CH 3 CH 2 OH MW % 6.02  molecole = 1 mol = g BILANCIA m/z 46 m/z 47 (2.2 %) Sorg. Analizzatore MS

21 Picchi isotopici 1.1%  (numero di C)+ 0.36%  (numero di N) M+1 M+2 Cl (33% di M) Br (100% di M) S (4% di M)

22 Sorgente FAB Sorgente MALDI Sorgente ESI Non richiedono volatilizzazione

23 The Nobel Prize in Chemistry 2002 Electrospray Ionization Electrospray Ionization Laser Desorption “For the development of methods for identification and structures analysis of biomolecules”

24 Ionizzazione Elettrospray (ESI)

25 Ionizzazione elettrospray Tecnica di ionizzazione in fase liquida a pressione atmosferica Ionizzazione delicata Molecole di polarità medio-alta Composti con basso ed alto PM fino a Spesso si formano ioni con carica multipla Comune la presenza di ioni addotto La fase mobile deve essere polare

26 Dettaglio dell’ugello elettrospray Guaina di N 2 Sonda riscaldata ESI Ago ESI Pennacchio di ioni ±5 kV Gas di nebulizzazione N 2

27 Meccanismo dell’elettrospray Goccioline contenenti ioni Capillare ±5 kV Col procedere dell ’ evaporazione delle goccioline, il campo aumenta e gli ioni si muovono verso la superficie Raggiungimento del limite di Raleigh ed esplosione coulombica che rilascia gli ioni

28 Ionizzazione elettrospray

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30 ESI-MS Spectrum of Ubiquitin (MW 8564 Da) Nessuna Frammentazione Formazione di Ioni Multicarica

31 Spettro Deconvoluto dell ’ Ubiquitina Ubiquitina Carbossilata Ubiquitina Intatta Ubiquitina Ossidata

32 Prestazioni Generali della Sorgente ESI Vantaggi Funziona bene con analiti volatili e non volatili, ionici e/o polari Informazioni sul peso molecolare Scarsa frammentazione Elevata sensibilità Permette la determinazione di alti pesi molecolari Interfacciamento con Cromatografia Liquida Svantaggi Scarsa frammentazione Non compatibile con l’utilizzo di tamponi non volatili e solventi organici apolari. Ionizzazione inibita da alte concentrazioni saline

33 Ionizzazione Laser Assistita da Matrice (MALDI)

34 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI Il desorbimento mediante laser permette di ottenere ioni in fase gassosa. Le pulsazioni provenienti da un laser a W/cm 2 sono focalizzate sulla superficie del campione solido. Le pulsazioni estraggono materiale dalla superficie e creano un microplasma di ioni e di molecole neutre che possono reagire tra di loro in fase vapore. Le pulsazioni laser sono in grado sia di vaporizzare sia di ionizzare il campione.

35 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI Principi operativi I passaggio: il composto è mescolato ad una matrice che assorbe intensamente la lunghezza d’onda del laser. La miscela è asciugata e qualunque solvente rimosso. Ne risulta una soluzione solida costituita da analita e cristalli di matrice.

36 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI II passaggio: le pulsazioni estraggono la soluzione solida ed inducono il riscaldamento della soluzione e la sublimazione della matrice. Una certa energia è trasferita alle molecole di analita che si ionizzano. Il MALDI permette il desorbimento e la ionizzazione di analiti ad altissimo PM (> Da). E’ usato nell’analisi di proteine ad alto PM, polimeri e biopolimeri.

37 2. Sample plate is introduced into MALDI source 3. Sample spot is irradiated with laser To Time of Flight 1. Sample is mixed with matrix and dried on a sample plate

38 Irradiation Desorption H+H+ Proton transfer Desolvation Matrix Sample MALDI PROCESS Sample Molecules are ionized by proton transfer from the matrix

39 MALDI-TOF Spectrum of Cytocrome C, Ubiquitin and Myoglobin

40 Matrix Selection Solubility in sample-solvent system Absorption at the laser wavelenght Photostability Volatility Reactivity

41 MatrixApplication a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Peptides (<10 KDa), lipids, carbohydrates Sinapinic acid (SA)Peptides and large proteins (10-150KDa), glycoproteins, membrane proteins Gentisic acidPeptides, proteins, carbohydrates, glycoproteins, glycolipids, polymers, lipids, organic molecules Trans-3-indoleacrylic acid (IAA)Synthetic polymers 3-hydroxypicolinic acid (HPA)Oligonulceotides > 3.5KDa 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) Oligonucleotides < 3.5KDa Dithranol (DIT)Polymers

42 Prestazioni Generali della Sorgente MALDI Vantaggi: Analisi di composti con un PM oltre Da Alta Sensibilità (da 100 fmol a 2 pmol) No Ioni multicarica Tolleranza alla presenza di sali, tamponi o altri additivi Analisi di miscele complesse Svantaggi: Analisi di composti con un PM sotto i 600 Da è difficile La risoluzione dell’analizzatore TOF è limitata No analisi di complessi non-covalenti Accoppiamento On-line con un LC or CE è molto difficile.

43 Paragone tra tecniche di ionizzazione MS 200,000 MOLTO POLARE NON POLARE NON POLARE ESI EI/CI FAB PM 15,000 1,000 10


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