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L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo:

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1 L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga CROMATOGRAFIA TEORIA GENERALE (CAS-2) Giorgio Bonaga

2 CROMATOGRAFIA (Tswett’s writing = Tswett’s analysis) … ma chi è Tswett ? Giorgio Bonaga

3 CROMATOGRAFIA ( chromos = colore + graphos = scrittura mediante il colore) L’8 mar Mikhail Semynovich Tswett ( ) Nasce ad Asti (Italia) il 14 maggio 1872, da Siméon, russo, e Maria de Derozza, italiana. Studia a Losanna, poi all’Università di Ginevra, dove si laurea in Scienze nel 1896, discutendo una tesi sulla struttura delle cellule vegetali (protoplasmi e cloroplasti). Nello stesso anno si trasferisce a San Pietroburgo, ma in Russia non gli è riconosciuto il titolo di studio svizzero e pertanto nel 1901 sostiene una nuova tesi di laurea dal titolo “ Struttura fisico-chimica della particella di clorofilla. Studio sperimentale e critico ”. Nel 1901 si trasferisce a Varsavia, in qualità di assistente presso il Dipartimento di Anatomia e Fisiologia Vegetale, per divenire poi “Lettore” in Botanica e Agricoltura presso l’Istituto di Veterinaria ed infine “Lettore Senior” al Dipartimento di Chimica e Mineralogia. Il 21 marzo 1903 Tswett presenta il lavoro che di fatto costituisce la data di nascita della “cromatografia”: l’occasione è un Convegno presso la Sezione di Biologia della Società Naturalistica dell’Università di Varsavia ed il titolo della sua relazione è “ Sulla nuova categoria di fenomeni di adsorbimento e sulle loro applicazioni nell’analisi chimica ”. Nel 1915 ritorna a Mosca, per trasferirsi poi, due anni dopo, all’Università di Tartu (Estonia) in qualità di Full Professor e nel 1918 all’Università di Voronezh (Estonia), città nella quale muore il 26 giugno PER I PIU’ CURIOSI: Karlo Ivanovich Sakodynskii:” Michael Tswett: life and work ”. Carlo Erba Edizioni, Milano ( gratuito, a richiesta ) Giorgio Bonaga

4 Il primo “cromatogramma” Il primo “cromatografo” di Tswett (1903) L = cm d = 2-3 cm P = 0,5 Atm materiale adsorbente (CaCO 3 ) L’IDEA DI TSWETT xantofilla  clorofilla  clorofilla  xantofilla  ‘ xantofilla  eluente (etere di petrolio) Giorgio Bonaga

5 Il “cromatografo” di Tswett per colonne multiple, con sistema di pressione Giorgio Bonaga

6 L’8 mar In uno dei suoi ultimi lavori M. S. Tswett ha scritto (profeticamente): “…tuttavia, è auspicabile un grande sviluppo, nell’ambito dell’analisi cromatografica, di colonne capillari “ colonne capillari Giorgio Bonaga

7 CROMATOGRAFIA setto di vetro poroso allumina granulare (fase stazionaria) eluente (fase mobile) DETECTOR V R segnale del detector cromatogramma Giorgio Bonaga

8 rivelazione degli analiti colonna - fase stazionaria – CROMATOGRAFO A BLOCCHI introduzione del campione serbatoio - fase mobile - gas o liquido iniettori (injector) solido o liquido rivelatori (detector) Giorgio Bonaga

9 Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e l’analisi quali- quantitativa dei componenti di matrici complesse. Nell’indagine biologica sono particolarmente preziose le loro numerose applicazioni nel campo alimentare. In tutti i metodi cromatografici, seppure con alcune differenze, i componenti di una miscela si separano distribuendosi tra due fasi:  una FASE STAZIONARIA (un solido o un liquido su un supporto solido inerte).  una FASE MOBILE (un gas o un liquido) che fluisce in modo continuo sulla fase stazionaria. La separazione è dovuta principalmente a due effetti: 1. distribuzione dei soluti fra la fase stazionaria e la fase mobile ; 2.effetto di trascinamento dei soluti da parte della fase mobile. Giorgio Bonaga

10 CLASSIFICAZIONE DEI PROCESSI CROMATOGRAFICI Giorgio Bonaga

11 Denominazione del metodo Metodo specifico Fase stazionaria Tipo di equilibrio Cromatografia liquida (fase mobile: liquido) (LC) liquido/liquido (LLC = LC) liquido adsorbito su solido partizione tra due liquidi immiscibili liquido/fase legata (BPLC) specie organiche legate alla superficie solida partizione tra liquido e fase legata liquido/solido (LSC e TLC) solidoadsorbimento scambio ionico (IEC/SIC) resina scambiatrice di ioni scambio di ioni esclusione (SEC/GPC/GFC) liquido negli interstizi di un polimero solido partizione/setacciamento Gascromatografia (fase mobile: gas) (GC) gas/liquido (GLC = GC) liquido adsorbito su solido partizione tra gas e liquido gas/fase legata (BPGC) gas/solido (GSC) specie organiche legate alla superficie solida solido partizione tra gas e fase legata adsorbimento Cromatografia con fluidi supercritici (fase mobile: fluido supercritico) fluido supercritico/ fase legata (SFC) specie organiche legate alla superficie solida partizione tra fluido supercritico e fase legata

12 supporto (solido) fase stazionaria (liquido) fase mobile (liquido o gas) CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE (LC o GC) Le molecole di soluti diversi si ripartiscono in modo diverso tra la fase stazionaria liquida (supportata da un solido) e la fase mobile liquida o gassosa. Giorgio Bonaga

13 fase stazionaria (solido) fase mobile (liquido o gas) CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO (LSC o GSC) I siti attivi della fase stazionaria solida “legano” le molecole dei solventi e dei soluti con legami reversibili non polari e polari di “forza” diversa: 1) forze deboli ( tipo Van der Waals ) e dipolo istantaneo-dipolo istantaneo per solventi e soluti non polari; 2) dipoli permanenti per solventi e soluti polari; 3) legami H per molecole con H su eteroatomi (N, O, F); 4) interazioni dielettriche per solventi polarizzabili. siti attivi Giorgio Bonaga

14 PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA La fase stazionaria è costituita da particelle solide o da un film liquido che riveste un supporto solido, contenute all’interno di un tubo lungo e sottile ( cromatografia su colonna ) o depositate su una superficie ( cromatografia planare ). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la fase mobile (m): X m Le due caratteristiche del processo cromatografico sono: 1. Migrazione differenziale 2. Allargamento della banda tempo Giorgio Bonaga XsXs

15 MIGRAZIONE DIFFERENZIALE Costituisce la base del processo di separazione cromatografica ed è strettamente legata alla differenza dei tempi di ritenzione di soluti diversi (selettività). In sintesi, è diversa la velocità di migrazione di soluti diversi lungo la fase stazionaria della colonna. Simuliamo gli equilibri tra i 3 soluti A B C, la fase mobile e una singola particella di fase stazionaria: [Cs] [Cm] [Bs] [As] [Bm] [Am] [Cs]>[Bs]>[As] [Am]>[Bm]>[Cm] Giorgio Bonaga

16 Nell’esempio illustrato, all’equilibrio (in realtà i processi cromatografici sono processi di “ non equilibrio ”, ma per ora è utile considerarli equilibri nella descrizione qualitativa dei fenomeni che intervengono), l’analità A è prevalentemente nella fase mobile, B si ripartisce in modo uguale nelle due fasi e C è prevalentemente nella fase stazionaria. La velocità con cui un analita si muove lungo la colonna dipende dalla frazione di molecole che si trova nella fase mobile ad ogni istante (quelle che interagiscono con la fase stazionaria non si muovono lungo la colonna, se non al sopraggiungere di un nuovo volume di fase mobile). La migrazione differenziale dipende dall’equilibrio di distribuzione di ogni analita tra la fase stazionaria e la fase mobile e perciò essa è controllata dalle 3 variabili sperimentali che influenzano la distribuzione (ossia le variabili che influenzano l’ equilibrio di distribuzione termodinamico del soluto tra le due fasi): COMPOSIZIONE DELLA FASE MOBILE COMPOSIZIONE DELLA FASE STAZIONARIA TEMPERATURA Per modificare la migrazione differenziale allo scopo di migliorare la separazione tra soluti, si deve operare su queste 3 variabili. Giorgio Bonaga

17 COEFFICIENTE DI PARTIZIONE (O DI DISTRIBUZIONE) Esprime la COSTANTE TERMODINAMICA K d, ovvero il rapporto tra la concentrazione molare dell’analita X nella fase stazionaria e la concentrazione molare dell’analita X nella fase mobile. K d (A) = 1/3 = 0,33 (più veloce di B e C) K d (B) = 2/2 = 1,00 (3 volte più lento di A) K d (C) = 3/1 = 3,00 (9 volte più lento di A) Nell’esempio precedente i coefficienti di partizione degli analiti A, B e C sono: K d (X) = CsCs CmCm Giorgio Bonaga

18 Anche le molecole dello stesso soluto si muovono lungo la colonna con velocità differenti: la loro dispersione genera un profilo (banda di eluizione) di tipo gaussiano, il cui apice rappresenta la velocità media del soluto. Il termine comune della banda di eluzione è picco cromatografico. t velocità media Giorgio Bonaga

19 Tempo di ritenzione ( t R ) : tempo necessario ad un soluto per eluire da una estremità all’altra della colonna (ed essere “ visto ” dal detector). Tempo morto (t 0 o t M ): tempo di ritenzione di un soluto che non è trattenuto dalla fase stazionaria e pertanto fluisce alla stessa velocità della fase mobile. W t R t t detector signal TEMPO DI RITENZIONE Giorgio Bonaga

20 Volume di ritenzione (V R ) : volume di fase mobile necessario per eluire il soluto da un’estremità all’altra della colonna. Volume morto (V 0 o V M ) : volume di ritenzione di un soluto che non è trattenuto dalla fase stazionaria. Esso coincide con il volume di fase mobile che occupa la colonna. (es.: colonna di r = 0,5 cm e di lunghezza 100 cm, V 0 = 0,5 cm x 0,5 cm x 3,14 x 100 cm = 25 cm 3 = 25 ml). V R e t R sono tra loro proporzionali se il flusso della fase mobile è costante, in base alla relazione: V R = t R x F F = flusso della fase mobile (volume nell’unità di tempo, espresso in ml/min ) (es.: soluto con t R = 5 min, a F = 30 ml/min, il V R = 5 min x 25 ml/min = 125 ml) Giorgio Bonaga

21 ESEMPIO Dati F = 1,0 ml/min e una colonna di sezioni:  = 2,5 mm/5,0 mm = 0,5 Ag = 2,5 mm 2. 3,14  20 mm 2 = 0,2 cm 2 A = 0,2 cm 2. 0,5 = 0, 1 cm 2 da cui: A = area effettiva della sezione media della colonna (area disponibile per il flusso della fase mobile) A = Ag.  Ag = area geometrica della sezione della colonna  = ( interparticle porosity ) rapporto tra la sezione disponibile per la fase mobile e la  sezione totale della colonna 1,0 cm 3. min -1 0,1 cm v =  10,0 cm/sec 5,0 mm 2,5 mm RELAZIONE TRA FLUSSO (F) E VELOCITA’ MEDIA LINEARE ( v ) La relazione tra F (in ml/min ) e v (in cm/sec ) della fase mobile è: (A x 60) F v = Giorgio Bonaga

22 Nell’esempio precedente, se la lunghezza della colonna L = 100 cm, misurando sul cromatogramma il valore di t 0 = 10” si ottiene: da cui, anche: La velocità lineare media v (in cm/sec ) di flusso della fase mobile è anche espressa dalla relazione: t 0 L v = 10” 100 cm v =  10,0 cm/sec F = 10,0 cm. sec -1. ( 0,1 cm 2. 60)  1,0 ml/min È intuitivo che la velocità media lineare (in cm/sec ) del soluto è espresso dalla relazione: Nell’esempio precedente, con L = 100 cm, misurando sul cromatogramma il valore di t R = 100” si ottiene: t R L v (soluto) = 100” 100 cm v (soluto) =  1,0 cm/sec Giorgio Bonaga

23 Il parametro più significativo per descrivere la velocità di migrazione del soluto lungo la colonna è il fattore di capacità (k’), che esprime il tempo di ritenzione (t R ) di un soluto in funzione del tempo morto (t 0 ): FATTORE DI CAPACITA’ (k’) Retention Factor t0t0 t R – t 0 k’ = tRtR t0 t0 0 t 1’6’ A k’ A = 6 – 1 = 5 1 Giorgio Bonaga

24 Dunque k’ rappresenta un tempo di ritenzione relativo (al segnale del solvente) e consente di confrontare il comportamento di due colonne differenti rispetto le quali un soluto non rivela gli stessi t R e t 0. Il fattore k’ può essere espresso anche utilizzando il volume di ritenzione e il volume morto: V0V0 V R – V 0 k’ = (es.: dati V R = 250 ml e V 0 = 50 ml, il k’ = 250 – 50/50 = 200/50 = 4) Il fattore k’ è anche espresso dal rapporto tra la concentrazione molare del soluto nel volume di fase stazionaria e la concentrazione molare del soluto nel volume di fase mobile (ammesso che si possa parlare di concentrazione in mol/l del soluto in un materiale solido): (es.: dati C S = 20 mol/l, C M = 10 mol/l, V S = 100 ml, V 0 = 50 ml, il k’ = 20/10 x 100/50 = 4) C M. V 0 C S. V S k’ = Giorgio Bonaga

25 Ricordando che: (es.: dati C S = 20 mol/l e C M = 10 mol/l, K d = 2,0) si ottiene: (es.: dati V S = 100 e V 0 = 50, k’ = 2,0 x 100/50 = 4) CMCM CSCS K d = V 0 VSVS k’ = K d. Eguagliando le due espressioni di k’: V0V0 V R – V 0 V 0 VSVS = da cui: + K d. V S V R = V 0 K d. (es.: dati V 0 = 50 ml, K d = 2, V S = 100, V R = ,0 x 100 = 250 ml) Giorgio Bonaga

26 k’ = K d.  Se il soluto ha un valore della K d molto basso (tendente a 0) risulterà V R = V 0, cioè quel soluto è indifferente al processo di ripartizione (analogamente alla fase mobile). Ogni soluto ha un valore caratteristico di k’ in una determinata colonna, dal momento che k’ e K d sono legate dalla relazione: ponendo: si ottiene: V 0 VSVS k’ = K d. V0V0 VSVS =  V0V0 VSVS V0V0 VSVS con V 0 = V S, K’ = K d con V 0 = 0,5V S, K’ = 2. K d  è detto rapporto di fase ed è diverso da colonna a colonna; pertanto ogni soluto ha un k’ caratteristico in funzione della colonna utilizzata. Il k’ ottimale è compreso tra 3-4 Giorgio Bonaga

27 ALLARGAMENTO DELLA BANDA Oltre alla migrazione differenziale dei soluti, il processo cromatografico comporta una allargamento della banda del soluto (cioè di molecole uguali che hanno lo stesso coefficiente termodinamico di partizione K d ) rispetto la sua larghezza iniziale. L’entità dell’allargamento è funzione del tempo che il soluto trascorre nella colonna, ovvero quanto maggiore è il suo tempo di ritenzione tanto maggiore è l’allargamento della banda. t0t0 t1t1 t2t2 Giorgio Bonaga

28 L’allargamento della banda, che corrisponde al picco nel cromatogramma, è dovuto alla diversa velocità di migrazione delle molecole del soluto, per effetto di fattori fisici e cinetici la cui entità dipende dal valore del fattore di capacità k’ del soluto. iniezione W W 2 2 h I fattori fisici e cinetici che determinano l’allargamento della banda sono: 1.TORTUOSITA’ DEI PERCORSI 2.DIFFUSIONE LONGITUDINALE 3.TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE 4.TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE STAGNANTE 5.TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIA t0t0 h tRtR Giorgio Bonaga

29 t0t0 t2t2 t1t1 1. TORTUOSITA’ DEI PERCORSI B A Le molecole di soluto non seguono lo stesso percorso e pertanto impiegano tempi diversi per percorrere la stessa lunghezza di colonna, ovvero nello stesso tempo percorrono lunghezze diverse della colonna. dpdp v Giorgio Bonaga

30

31 2. DIFFUSIONE LONGITUDINALE fase mobile fase mobile (più concentrata) fase mobile (meno concentrata) fase mobile (meno concentrata) È la diffusione delle molecole del soluto, con direzione parallela all’asse longitudinale della colonna, nei versi che vanno dalle zone a maggiore concentrazione di fase mobile alle zone a minore concentrazione.  DmDm v Giorgio Bonaga

32 3. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE DmDm v  dpdp Giorgio Bonaga

33 4. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE STAGNANTE v  DmDm dpdp Giorgio Bonaga

34 5. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIA U d liq Q v Giorgio Bonaga DSDS

35 OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO CROMATOGRAFICO Sono stati discussi la MIGRAZIONE DIFFERENZIALE e, soltanto dal punto di vista qualitativo, l’ ALLARGAMENTO DELLA BANDA. Per la loro trattazione quantitativa, i parametri che influenzano il processo cromatografico possono essere riuniti in macrocategorie, ciascuna delle quali contribuisce, seppure in modo differente, all’aspettopiù importante della performance di una separazione cromatografica, la RISOLUZIONE. 1. FATTORE DI EFFICIENZA 2. FATTORE DI SELETTIVITA’ 3. FATTORE DI CAPACITA ’ RISOLUZIONE Giorgio Bonaga

36 FATTORE DI EFFICIENZA L’efficienza di una colonna è definita dalla forma e dall’allargamento dei picchi cromatografici. Per comprendere nei dettagli il fattore di efficienza occorre introdurre due concetti fondamentali: A) ALTEZZA EQUIVALENTE DI UN PIATTO TEORICO definizione fenomeni fisici e cinetici che contribuiscono al valore dell’HETP equazione di Van Deemter B) NUMERO DI PIATTI TEORICI DI UNA COLONNA definizione equazioni Giorgio Bonaga

37 A) ALTEZZA EQUIVALENTE DI UN PIATTO TEORICO ( Height Equivalent to the Theoretical Plate = HETP) Consideriamo l’avanzamento di un soluto nella colonna cromatografica. Se non vi fosse flusso di fase mobile nel I° tratto di colonna si instaurerebbe un equilibrio di partizione (nel nostro caso K d = 2/8 = 0,25). In realtà la fase mobile fluisce e pertanto il processo di partizione procede lungo la colonna senza il raggiungimento di uno stato di equilibrio permanente. Nel II° tratto di colonna una parte del soluto trasportato dalla fase mobile migra nella fase stazionaria (con una K d = 1,6/6,4 = 0,25). Anche nel III° tratto una parte del soluto migra nella fase stazionaria (con una K d = 1,28/5,12 = 0,25). E così di seguito. HETP I° II° III° 2,0 M 1,6 M 1,28 M 8,0 M 6,4 M 5,12 M 10,0 M Giorgio Bonaga

38 HETP I° II° III° 2,0 M0,4 M 1,6 M 0,32 M 1,28 M 0,256 M 0 M 1,6 M 0 M 1,28 M 0 M 1,024 M Non bisogna dimenticare che la quantità di soluti presenti nella fase mobile e nella fase stazionaria sono espresse dalla concentrazione molare (numero di moli di soluto in un litro di soluzione). È ovvio che la concentrazione molare nella fase stazionaria del I° piatto teorico (M = 2,0) si modifica quando sopraggiunge un volume di fase mobile priva di soluti (M = 0). Dunque avviene una migrazione inversa, che va dalla fase stazionaria alla fase mobile, fino a quando il rapporto tra le concentrazioni molari nelle due fasi non eguaglia il K d = 0,25 (0,4/1,6). In modo analogo avverrà nel II°, III°, ecc., piatto teorico. Giorgio Bonaga

39 Il tratto di colonna nel quale si realizza una condizione “corrispondente” ad uno stato di equilibrio (cioè un equilibrio reversibile di partizione) è detto “ altezza equivalente di un piatto teorico ” (HETP), come se la fase mobile fosse ferma. L’espressione altezza del piatto teorico è mutuata dalla teoria delle colonne di frazionamento per distillazione, data l’analogia tra il processo di distillazione frazionata e il processo di ripartizione cromatografica, entrambi utilizzati per separare i componenti di una miscela. altezza del piatto teorico B (liquido) miscela ( A + B ) percorso liquido in ascesa piatto sfioratore Giorgio Bonaga A (vapore)

40 La diffusione eddy: dipende dalla regolarità dell’impaccamento (“ column packing ”) è direttamente proporzionale al diametro delle particelle di fase stazionaria è indipendente dalla velocità lineare media di flusso della fase mobile FENOMENI FISICI E CINETICI CHE CONTRIBUISCONO AL VALORE DELL’HETP 1. DIFFUSIONE EDDY (tortuosità dei percorsi) È riassunta nell’espressione: H e = 2 d p. = costante legata alla regolarità dell’impaccamento della colonna d p = diametro delle particelle di fase stazionaria Giorgio Bonaga

41 2. DIFFUSIONE LONGITUDINALE È riassunta nell’espressione: H d = 2   = coefficiente dipendente dalla distribuzione delle particelle di fase stazionaria ( fattore di ostruzione = 0,6 per impaccate; 1,0 per capillari) D m = coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile = v = velocità lineare media di flusso della fase mobile DmDm v La diffusione longitudinale: dipende dalla distribuzione delle particelle della fase stazionaria; è direttamente proporzionale al D m del soluto nella fase mobile; è inversamente proporzionale alla velocità lineare media di flusso della fase mobile (maggiore velocità minore tempo disponibile alla diffusione longitudinale). NOTA: la H d è di scarsa importanza nella LC perché i coefficienti di diffusione nei liquidi sono bassi, ma è molto importante nella GC per i valori elevati dei coefficienti di diffusione nei gas. Giorgio Bonaga k T 6  r

42 Giorgio Bonaga RELAZIONE TRA v E DIFFUSIONE LONGITUDINALE v bassa v alta

43 3. e 4. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE E IN FASE MOBILE STAGNANTE È riassunto nell’espressione:  = fattore dipendente dal diametro della colonna (= d c 2 ) d p = diametro delle particelle di fase stazionaria D m = coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile v = velocità lineare media di flusso della fase mobile Il trasferimento di massa in fase mobile (e in fase mobile stagnanate): dipende dal diametro della colonna; è direttamente proporzionale al quadrato del diametro delle particelle; è direttamente proporzionale alla velocità del flusso della fase mobile; è inversamente proporzionale al D m del soluto nella fase mobile; DmDm v H m =  d p 2 Giorgio Bonaga

44 5. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIA È riassunta nell’espressione: Q = fattore dipendente dal tipo e dalla forma delle particelle della fase stazionaria U = costante relativa alla velocità di migrazione del soluto dalla fase stazionaria verso la fase mobile (interazione soluto/fase stazionaria) d liq = spessore del rivestimento liquido depositato sul supporto solido D s = coefficiente di diffusione del soluto nella fase stazionaria v = velocità lineare media di flusso della fase mobile DsDs v Il trasferimento di massa in fase stazionaria: dipende dal diametro e dalla forma delle particelle di fase stazionaria; dipende dalla velocità di migrazione ( desorbimento ) del soluto dalla fase stazionaria verso la fase mobile; è direttamente proporzionale alla velocità lineare media di flusso della fase mobile; è inversamente proporzionale al D m del soluto nella fase stazionaria. H s = Q U d liq 2 Giorgio Bonaga

45 dpdp d liq RAPPRESENTAZIONE DEI TERMINI, , , Q, d p, d liq Q   e  Giorgio Bonaga

46 DsDs DmDm RAPPRESENTAZIONE DEI TERMINI D m, D s, U U Giorgio Bonaga U = velocità di trasferimento del soluto dalla fase stazionaria alla fase mobile (dipende dall’antagonismo tra le interazioni soluto/ fase stazionaria e le interazioni soluto/fase mobile), ovvero dalla velocità di desorbimento del soluto dalla fase stazionaria D m o D s = 6  r k T k = costante di Boltzmann T = temperatura  = viscosità del soluto r = raggio della particella = k = R/N = 1, J/K R = costante universale dei gas N = numero di Avogadro K = temperatura assoluta √ V p 3

47 Dai contributi all’HETP dei vari fenomeni fisici e cinetici si ottiene il valore dell’HETP totale: DsDs Q U 2 2 d p.  2  DmDm v DmDm v  d p 2 HETP = H e + H d + H m + H s = v Ponendo: 2 d p  = A 2  D m = B L’equazione diviene: HETP = A + B + C. v DsDs Q U d liq DmDm  d p 2 + = C v costanti caratteristiche per ogni singola colonna e per una data fase mobile equazione di Van Deemter d liq 2 Giorgio Bonaga

48 v (cm/sec) HETP (cm) velocità ideale ( v = √ B/C ) Diagrammando l’equazione di Van Deemter si ottiene un’iperbole che correla il valore dell’ HETP alla velocità lineare media v di flusso della fase mobile, ma nel diagramma sono identificabili anche le 3 costanti (A, B e C) caratteristiche di una certa colonna e di una data fase mobile. altezza minima C. v A BvBv Giorgio Bonaga retta parallela all’asse x retta con coefficiente angolare C iperbole equilatera

49 Liquid Chromatography Gas Chromatography v (cm/s) CORRELAZIONE TRA v E HETP HETP (mm) v (cm/s) Giorgio Bonaga

50 CORRELAZIONE TRA v E SEPARAZIONE 1,0 ml/min2,0 ml/min 4,0 ml/min5,0 ml/min minuti ,5 1 1,5 Giorgio Bonaga

51 HETP NELLA HPLC TRADIZIONALE, FAST HPLC, UPLC v (mm/sec) HETP (  m)  m (1970) 5  m (1980) 3  m (2000) 1,7  m (2004) UPLC FAST HPLC HPLC Giorgio Bonaga

52 EFFETTI DELL’HETP SULL’EFFICIENZA E SUL TEMPO rrr rrr HPLC UPLC mV t (min) 1,8 minuti 18 minuti flusso: 1,0 ml/min colonna: 4,6 mm i.d. x 150 mm fase stazionaria: C18 (5,0  m) fase mobile: H 2 O/CH 3 CN (50/50) lunghezza d’onda: 254 nm campione (20  l): 1. uracile 2. alcol benzilico 3. benzene 4. toluene 5. alcol etilico flusso: 0,6 ml/min colonna: 2,1 mm i.d. x 50 mm fase stazionaria: C18 (1,8  m) fase mobile: H 2 O/CH 3 CN (50/50) lunghezza d’onda: 254 nm campione (1  l): 1. uracile 2. alcol benzilico 3. benzene 4. toluene 5. alcol etilico Giorgio Bonaga

53 B) NUMERO DI PIATTI TEORICI (N) Il numero di piatti teorici N (ha soltanto un significato matematico, perché il processo cromatografico non è una singola separazione, ma una sequenza continua di stati di equilibrio reversibili) è definito dall’espressione: da cui: N = L HETP HETP = 22 L L = 10 cm HETP = 1 cm N = 10 Tenendo conto che l’effetto dell’eluizione di un soluto è una curva gaussiana, si può correlare l’ampiezza della curva con la varianza   o con la deviazione standard  di una misura. In sintesi si può esprimere il piatto teorico in termini di varianza o di deviazione standard per unità di misura di lunghezza della colonna: HETP = L N HETP = 1 cm L = 10 cm  2 = 10 cm 2 da cui:  = 10 cm 2  3,15 cm HETP. L = 22 Giorgio Bonaga

54 La relazione tra la deviazione standard  (espressa in centimetri) e la deviazione standard  (espressa in secondi) è data dalla velocità lineare media v del soluto ( v = L/t R, espressa in cm/sec). Nel caso precedente, con v = L/t R = 1 (cm/sec), si ottiene che la deviazione standard  = 3,15 secondi, corrispondente alla deviazione standard, che per la colonna considerata è  = 3.15 centimetri Si prenda il tracciato cromatografico con in ascissa il tempo t: la varianza del soluto si ottiene mediante una procedura grafica sul picco del cromatogramma. Si traccino le tangenti al punto di flesso della gaussiana in entrambi i lati del picco e si congiungano: si ottiene un triangolo che ha come base la linea di base e come area il 96% dell’area totale sottesa al picco. Questo 96% è compreso tra due deviazioni standard (± 1  ) rispetto l’apice del picco. Le intercette sono a ±  dal massimo e pertanto l’ampiezza della base del triangolo isoscele risulta essere W b = 4  ovvero  W b /4.  (cm) t R (sec) v L (cm)  = = Giorgio Bonaga

55 L t tR tR     W b =4  =4    96% Sostituiamo il valore di  nella  =  t R /L e risolviamo per   ovvero WbWb  t R L 4 =  L W b 4 t R = Giorgio Bonaga punti di flesso W i  W h  

56 Nell’equazione: sostituiamo il valore trovato di  : 16 tRtR WbWb 2 HETP = L2 Wb2L2 Wb2 L 4 2 t R 2 HETP = = 22 L L Wb2L Wb2 16 t R 2 Nell’equazione: N = L HETP sostituiamo il valore di HETP: N = L L Wb2L Wb2 16 t R 2 = L 16 t R 2 L Wb2L Wb2 = 5,54 tRtR WhWh 2 = La relazione tra W b e W h ( full width at half maximum ) è: W h = 2,35  = 2,35. W b /4 Giorgio Bonaga

57 t R = 17’ W b = 1’42” N = 16 = ’ 1’42” 2 WhWh h2h2 ESEMPIO = 1’ N = 5,54 = ’ 1’ 2 Il numero di piatti teorici (N), ovvero l’altezza equivalente di un piatto teorico (HETP) consente di confrontare l’efficienza di due colonne cromatografiche di differente lunghezza (L). Giorgio Bonaga

58 ESEMPIO In 2 colonne, rispettivamente di L = 75 mm e L = 100 mm, si introduca la stessa quantità di una soluzione contenente il soluto A e si registrino i rispettivi tracciati cromatografici. La colonna più corta risulta più efficiente. t R = 5’ W = 1’ N = 16 = W = 2” t R = 9” N = 16 = HETP = 75 mm/400 = 0,19 mm HETP = 100 mm/300 = 0,33 mm A A Giorgio Bonaga

59 ALLARGAMENTI DEL PICCO NON DOVUTI ALLA COLONNA In un cromatografo, oltre alla colonna, sono presenti i tubi di connessione e le giunzioni della linea di flusso della fase mobile che generano dei fenomeni di turbolenza, ai quali si sommano i fenomeni di diffusione longitudinale. L’effetto finale è un allargamento del picco cromatografico che risulta proporzionale al volume dei circuiti entro i quali passa la fase mobile e quindi anche alla lunghezza dei tubi di connessione. Dunque all’allargamento della banda concorrono numerosi fattori che, sebbene poco influenti rispetto quello dovuto alla colonna, possono essere così riassunti: W T = Wj + W f + W e + W d + W c dove: W T = larghezza totale del picco W j = allargamento dovuto ai volumi morti e alla dispersione del soluto nell’injector W f = allargamento dovuto alle connessioni dopo l’injector e prima del detector W e = allargamento dovuto ai capillari di connessione injector/colonna e colonna/detector W d = allargamento dovuto al detector W c = allargamento dovuto alla colonna Giorgio Bonaga

60 FATTORE DI SELETTIVITA’ È la misura quantitativa dell’entità di separazione tra due soluti e dunque rappresenta la capacità di un “ sistema cromatografico ” di distinguere tra due sostanze. Una colonna cromatografica è tanto più selettiva tra due soluti quanto maggiore è la loro MIGRAZIONE DIFFERENZIALE (sulla quale è utile ricordare che influiscono 3 variabili: composizione della fase mobile, composizione della fase stazionaria, temperatura ). In sintesi la selettività è la capacità di una colonna di differenziare i tempi di ritenzione di due soluti diversi. Il fattore di selettività  è definito dall’espressione: dove: k’ A = fattore di capacità del soluto A k’ B = fattore di capacità del soluto B (con tempo di ritenzione maggiore) Per modificare il fattore di selettività si può agire in 5 modi ( modificazione della fase mobile, variazione del pH della fase mobile, modificazione della fase stazionaria, variazione della temperatura, ricorso a effetti chimici specifici di un determinato soluto ). (t R ) B – t 0  = (t R ) A – t 0 = k’ B k’ A Giorgio Bonaga

61 ESEMPIO Data il cromatogramma dei due soluti A e B, di cui sono noti i tempi di ritenzione t R A e t R B e il tempo di ritenzione del solvente t 0, si può calcolare il fattore di selettività  La variazione di  modifica il t R di uno dei due soluti  t 0 = 1’ t R B = 6’ t R A = 5’  = = 1,25 Giorgio Bonaga t 0 = 1’  = = 1,50 t R B = 7’ t R A = 5’

62 FATTORE DI CAPACITA’ Il fattore di capacità k’ è funzione della composizione della fase mobile. Il soluto interagisce con la fase stazionaria, ma la sua migrazione si ottiene con una fase mobile verso la quale le caratteristiche fisiche e chimiche del soluto risultino intermedie tra quelle della fase mobile e quelle della fase stazionaria. In queste condizioni il soluto si ripartisce tra le due fasi e la variazione del suo k’ è in relazione al tempo che il soluto trascorre nella fase stazionaria. I valori di K’ sono compresi tra 0 e 10 (ottimali: 3-4). A t R = 4’ t R = 6’ t 0 = 1’ k’ A = 4 – 1 = 3 1 k’ A = 6 – 1 = 5 1 A Giorgio Bonaga

63 RISOLUZIONE (R) È l’abilità di una colonna cromatografica di separare soluti diversi, ovvero di produrre cromatogrammi in cui i soluti compaiono come picchi con profili molto stretti e ben separati tra loro. Il fattore di risoluzione (o risoluzione), in generale, si riferisce ai due soluti più difficilmente separabili. Dati i picchi A e B di un cromatogramma, la risoluzione R è espressa da: ESEMPIO Nel primo caso WA = WB, nel secondo WA  WB W B = 8’ W A = 4’ W B = 8’ t R A = 24’ t R B = 33’ R = = 1,5 8 R = = 1, W A = 8’ t R B = 36’ t R A = 24’ 2  t 2 (t RB –t RA )  t (W A + W B ) 2 W W R = = = Giorgio Bonaga

64 La risoluzione dipende da 3 fattori: 1. fattore di efficienza (N): minimo allargamento della banda (H e, H d, H m e H s ) espresso dall’equazione di van Deemter (N e HETP); 2. fattore di selettività (  ): cambiamento dei tempi di ritenzione dei soluti con miglioramento della loro separazione (composizione fase mobile, composizione fase stazionaria, temperatura); 3. fattore di capacità (k’): variazione delle caratteristiche della fase mobile per determinare una variazione dei fattori di capacità k’ dei soluti. La espressione completa della RISOLUZIONE è: fattore di efficienza fattore di selettività R = 1 N.  -1. k’ B 4  k’ B + 1 fattore di capacità Giorgio Bonaga

65 t 0 = 1’ (t R ) B = 7’ (t R ) A = 6’ W B = 1’ ESEMPIO Dal cromatogramma in cui compaiono i picchi A e B, possiamo calcolare N,  e k’ B: N = 16. ( 7/1) 2 = 784  = 7 - 1/6 - 1 = 1,2 k’ (B) = 7 - 1/1 = 6,0 e da questi tre fattori calcolare la risoluzione R: AB Giorgio Bonaga , , , ,2 7 R =.. =.. = 7,0. 0,17. 0, 86 = 1,02

66 RISOLUZIONE E PERCENTUALE DI OVERLAPPING DI DUE PICCHI DI AREA 1:1 R = 0,4 100% R = 0,5 92% R = 0,6 88% R = 0,7 84% R = 0,8 60% R = 1,0 20% R = 1,25 5% R = 1,5 0%.. Giorgio Bonaga

67 ESEMPIO Con una colonna di 10 cm è stato ottenuto il seguente cromatogramma, nel quale è visibile la sovrapposizione dei picchi A e B. Dal cromatogramma si possono facilmente calcolare i valori di N, HETP,  e k’ B e da questi il valore della risoluzione, che risulta essere R  1,0. Ammettendo che per separare al 100% i due picchi occorra una R = 1,5 che colonna bisogna utilizzare ? t 0 = 1’ t R B = 5’ t R A= 4’ W B = 1’ N = 400 [16. ( 5/1) 2 ] HETP = 0,25 mm [100mm/400]  = 1,33 [(5-1)/(4-1)] k’ B = 4 [5-1] Giorgio Bonaga AB

68 Preliminarmente si può verificare che: R = 1 N.  - 1. k’ B  1,0 4  k’ B + 1 ma dall’espressione della R si può isolare il termine N: N = 4 R. . k’ B + 1  - 1 k’ B N = 16 R 2.  2. k’ B + 1    - 1 k’ B scegliendo una R = 1,5 per una separazione dei picchi = 100%, si ottiene: N = 16. 1,5 2. 1,33/0, /4    dalla relazione: HETP = L/N si ottiene: L = N. HETP da cui: L = ,25 mm = 225 mm = 22,5 cm Giorgio Bonaga

69 OTTIMIZZAZIONE DELLA RISOLUZIONE Come modificare i valori di N,  e k’, in modo da ottenere il fattore di risoluzione idoneo alla separazione della miscela analizzata ? Per semplicità consideriamo una miscela di due soli componenti A e B i cui picchi cromatografici appaiono sovrapposti (è mostrata l’area di sovrapposizione). AB tRAtRA tRBtRB Giorgio Bonaga

70 A) VARIAZIONE DEL FATTORE DI EFFICIENZA N Se si aumenta N si ottiene un restringimento dei picchi (lasciando però inalterato il valore di t R A e t R B) con un miglioramento della risoluzione. L’aumento di N si ottiene: diminuendo le costanti A ( e d p della diffusione eddy) e C (  e d p del trasferimento di massa in fase mobile; Q del trasferimento di massa in fase stazionaria) dell’equazione di Van Deemter. La diminuzione delle costanti A e C si ottiene utilizzando delle particelle di fase stazionaria di piccolo diametro o particelle porose solo in superficie, e con un impaccamento uniforme della colonna (diminuisce l’altezza dell’HETP); utilizzare una colonna più lunga (aumentando N aumenta il numero di piatti teorici); diminuendo v in modo da ridurre l’altezza dell’HETP e, a parità di lunghezza della colonna, aumentare il numero di piatti teorici. Giorgio Bonaga

71 EFFETTO DELLE DIMENSIONI E DELLA FORMA DELLE PARTICELLE DI FASE STAZIONARIA SULL’ALLARGAMENTO DEI PICCHI particelle grandi di forma sferica particelle grandi di forma irregolare particelle piccole di forma irregolare picco simmetrico alto e stretto picco simmetrico basso e largo picco simmetrico medio-alto e medio-stretto Giorgio Bonaga

72 DIMENSIONI E POROSITA’ DELLA PARTICELLA DI FASE STAZIONARIA 20  m Ø particella Ø poro = 500:1 100 Å = 0,01  m5  m Ø particella Ø poro = 500:1 400 Å = 0,04  m A parità di rapporto tra diametro della particella e diametro del poro, la particelle di dimensione più ridotta (specialmente se di forma irregolare) riducono i fenomeni di trasferimento di massa in fase mobile e in fase mobile stagnante (  e d p ) e in fase stazionaria (Q) Giorgio Bonaga

73 PICCHI ASIMMETRICI Finora, al di là della loro forma e dell’altezza, sono stati considerati soltanto picchi simmetrici (gaussiani). Non di rado, però, il cromatogramma mostra picchi asimmetrici dovuti alla criticità della quantità di soluto rispetto la quantità di fase stazionaria (ovvero al sovraccarico della fase stazionaria), rapporto generico noto come carico di campione. La saturazione di tutti i siti attivi della fase stazionaria produce due conseguenze possibili: buona parte del soluto si lega più stabilmente alla fase stazionaria, producendo una eluizione “ritardata” di soluto sulla coda del picco (“ tailing ”); la maggior parte del soluto, per effetto cooperativo, si lega e si slega più rapidamente alla fase stazionaria, producendo una euizione “anticipata” di soluto sul fronte del picco (“ fronting ”). Il tailing è comune, il fronting molto meno. Per evitare l’asimmetria dei picchi, che peggiora ovviamente la risoluzione di una colonna, si può operare in due modi: 1) ridurre la quantità di campione introdotta (piccoli volumi di soluzioni dilute); 2) aumentare la superficie di siti attivi della fase stazionaria (riduzione della sua granulometria). Giorgio Bonaga

74 symmetricfrontingtailing DISTRIBUZIONE DEI SOLUTI RISPETTO LA VELOCITA’ MEDIA

75 L’asimmetria (A s ) dei picchi è dovuta alla deviazione della costante termodinamica di ripartizione K d (= C S /C m ) dei soluti e può essere cosi rappresentata: symmetric A s = 1,0  fronting A s < 1,0 tailing A s > 1,0 A s =     < > 1 h 10% h Giorgio Bonaga

76 B) VARIAZIONE DEL FATTORE DI SELETTIVITA’  Se si aumenta  si aumenta la differenza tra il t R B e il t R A, ovvero si modifica la ripartizione dei soluti tra la fase stazionaria e la fase mobile. L’aumento di  si ottiene: 1. modificando la fase mobile; 2. modificando il pH della fase mobile; 3. modificando la fase stazionaria; 4. modificando la temperatura; 5. facendo ricorso ad interazioni chimiche caratteristiche di un solo soluto. 1. MODIFICAZIONE DELLA FASE MOBILE È la modificazione selettiva del t R di un soluto che produce un aumento del fattore . ESEMPIO I Le LC a fase diretta (silice non funzionalizzata) di una miscela di acetonaftalene e dinitronaftalene effettuate con le due miscele eluenti riportate in tabella, mostrano valori di k’ e  tali che soltanto con pentano/piridina (95/5) si separano i picchi, per effetto della diminuzione della k’ dell’acetonaftalene (probabilmente per l’interazione tra l’N della piridina e il =CO dell’acetonaftalene) che determina un aumento di . Giorgio Bonaga

77 MISCELA ELUENTE C 5 H 12 /CH 2 Cl 2 77/23 C 5 H 12 /piridina 95/5 C O M P O S T O k’   1 acetonaftalene5,5 1,05 2,3 2,04 2 dinitronaftalene5,85, Giorgio Bonaga

78 ESEMPIO II Le LC a fase inversa (silice C:18) di una miscela di cinque composti benzenici, effettuata con tre diverse miscele eluenti, mostrano valori di k’ e  tali che soltanto con H 2 O/THF (63/37) si separano i picchi delle coppie critiche anilina/fenolo e anisolo/benzene. MISCELA ELUENTE H 2 O/CH 3 OH 50/50 H 2 O/AcCN 60/40 H 2 O/THF 63/37 C O M P O S T O k’   K’  1 anilina1,3 1,23 1,5 1,07 1,7 1,35 2 fenolo1,61,42,3 3 anisolo4,5 1,04 4,3 1,09 3,9 1,20 4 benzene4,7 5 clorobenzene9,27,76,5 Giorgio Bonaga

79 NH 2 Cl OCH 3 OH

80 2. MODIFICAZIONE DEL pH DELLA FASE MOBILE I t R di soluti contenenti gruppi acidi o basici dissociabili sono influenzati dal pH della fase mobile; pertanto modificando il pH si può aumentare il fattore . ESEMPIO I seguenti nucleotidi: contengono dei gruppi acidi la cui dissociazione dipende dal pH del mezzo e pertanto i loro t R dipendono dal pH della miscela eluente. adenina monofosfato (A) guanina monofosfato (G) citidina monofosfato (C) uracile monofosfato (U) Giorgio Bonaga

81 pH A G C U tRtR A + U G C pH = 3,5 pH = 3,0 La cromatografia di scambio anionico (IEC) condotta con fase mobile tamponata a pH 3,0 anziché a pH 3,5 consente la separazione della coppia critica A/U. Giorgio Bonaga C U A G

82 3. MODIFICAZIONE DELLA FASE STAZIONARIA Il fattore  può essere innalzato scegliendo una fase stazionaria che produca interazioni selettive soltanto con uno dei soluti della coppia critica. ESEMPIO La separazione per LC a fase diretta della coppia acido benzoico/benzoato di metile, con fase stazionaria non polare risulta critica. Se, tenendo costante la miscela eluente, si utilizza una colonna con fase stazionaria polare si ottiene la separazione della coppia critica, per effetto dell’interazione tra i siti polari della fase stazionaria e il gruppo carbossilico dell’acido benzoico C OOH C OOCH 3 Giorgio Bonaga

83 4. MODIFICAZIONE DELLA TEMPERATURA Non è molto influente nella LC, ma rilevantissima nella GC. In generale un aumento di temperatura produce un incremento della forza eluente della fase mobile, quindi una diminuzione dei fattori di capacita k’ di tutti i soluti e in ultima analisi un aumento del fattore . ESEMPIO Molti composti acidi hanno il valore della costante di dissociazione acida K a dipendente dalla temperatura; pertanto la variazione di temperatura produce un effetto selettivo. Nella cromatografia a coppie ioniche (fase stazionaria: silice porosa, fase mobile: acqua/metanolo + perclorato di triottilammonio) di una miscela di sei sostanze il cromatogramma a 25°C mostra soltanto 4 picchi, mentre quello a 43°C mostra sei picchi debitamente separati OH CH 3 H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 SO 3 HOH CH 3 OH SO 3 H SO 3 HHO 3 S OH COOH OH Giorgio Bonaga

84 °C 43°C 1 = acido salicilico 2 = acido 2-naftol-3,6-disolfonico 3 = acido 1-naftol-5-solfonico 4 = 4.metilfenolo 5 = acido 2,3,4-trimetil-benzensolfonico 6 = 2,5-dimetil-fenolo Giorgio Bonaga

85 5. EFFETTI CHIMICI SPECIFICI DI UN DETERMINATO SOLUTO Si sfruttano le interazioni chimiche di un solo soluto per modificarne il t R e di conseguenza aumentare il fattore  ESEMPIO La LC a fase inversa (silice C18) che utilizza una fase mobile arricchita di Ag + consente la separazione della vitamina D 2 dalla D 3 (in seguito alla complessazione  ) e rivela anche la presenza di un’impurezza, mentre nella cromatografia senza Ag + è visibile un solo picco cromatografico irrisolto D2D2 + D 3 D2D2 D3D3 D 2 (ergocalciferolo) D 3 (colecalciferolo) Ag + impurezza HOHO Giorgio Bonaga

86 C. VARIAZIONE DEL FATTORE DI CAPACITA’ k’ Nella LC il valore del fattore k’ è funzione della composizione della fase mobile. La fase stazionaria interagisce con il soluto e la migrazione del soluto - cioè la sua ripartizione tra le due fasi - si realizza impiegando una fase mobile tale che il soluto mostri proprietà chimiche e fisiche intermedie tra quelle della fase mobile e quelle della fase stazionaria (competitività tra le fasi). Se ci riferiamo alla polarità delle molecole di soluto, ci sono due possibilità: FASE STAZIONARIA:polare (allumina o silice attiva) FASE MOBILE:apolare (esano, tetracloruro di carbonio) FASE STAZIONARIA:apolare (polistirene, silice C18) FASE MOBILE:polare (acqua, metanolo, tetraidrofurano e loro miscele) Se facciamo riferimento al secondo caso (RPC), per migliorare la separazione il parametro che incide sulla risoluzione è la composizione della fase mobile. È evidente che minore è la polarità del soluto maggiore è il suo t R, ovvero se il t R del soluto è troppo elevato lo si può diminuire riducendo la polarità della fase mobile. Il fattore di capacità k’, che si ottiene dal valore del t R, è correlato alla risoluzione mediante il rapporto k’/k’+1. Giorgio Bonaga

87 Analizziamo la curva che correla i valori di k’ con i valori del rapporto k’/k’ ,5 1,0 si osserva che il rapporto aumenta rapidamente per poi tendere ad un asintoto = 1. I valori di k’ ottimali sono compresi tra 3 e 4 (a cui corrispondono dei valori k’/k’+1 di 0,75 e 0,80) perché per valori superiori corrispondono incrementi poco significativi del rapporto. Se il valore del t R del soluto è molto basso l’incremento di k’ ha un senso, altrimenti conviene agire sugli altri fattori della risoluzione (N o  ). k ’ k ’+1 Giorgio Bonaga

88 variazione di N variazione di  variazione di k’ cromatogramma iniziale A A A A B B B B Giorgio Bonaga soluti con gli stessi t R minore allargamento dei picchi varia il t R di un soluto stesso allargamento dei picchi variano i t R dei due soluti maggior allargamento dei picchi

89 ACRONIMI DELLA CROMATOGRAFIA a) TECNICHE CROMATOGRAFICHE AF= Affinity Chromatography BPC= Bonded Phase Chromatography CC= Column Chromatography CGC= Chiral Gas Chromatography CLC= Chiral Liquid Chromatography 2DGC= Two Dimensional Gas Chromatography FGC= Fast Gas Chromatography GC= Gas Chromatography (= Gas Liquid Chromatography) GFC= Gel Filtration Chromatography GPC= Gel Permeation Liquid Chromatography GSC= Gas Solid Chromatography HPCE= High Performance Capillary Electrophoresis HPLC= High Performance Liquid Chromatography HPTLC= High Performance Thin Layer Chromatography HRGC= High Resolution Gas Chromatography IEC= Ion Exchange Chromatography IPC= Ion Pair Chromatography LC= Liquid Chromatography LEC= Ligand Exchange Chromatography LLC= Liquid Liquid Chromatography LSC= Liquid Solid Chromatography Giorgio Bonaga

90 MGC= Multidimentional Gas Chromatography (Comprehensive GC) NPC= Normal Phase Chromatography PC= Paper Chromatography PLOT= Porous Layer Open Tubular RPC= Reverse Phase Chromatography SCOT= Support Coated Open Tubular SEC= Size Exclusion Chromatography SIC= Suppressed Ion Chromatography SFC= Supercritical Fluid Chromatography TLC= Thin Layer Chromatography UFGC= Ultra Fast Gas Chromatography UPLC= Ultra Performance Liquid Chromatography WCOT= Wall Coated Open Tubular Giorgio Bonaga B) RIVELATORI PER CROMATOGRAFIA DAD= Diode Array Detector (LC) ECD= Electron Capture Detector (GC) ED= Electrochemical Detector (GC) FD= Fluorescence Detector (LC) FID= Flame Ionization Detector (GC e LC) MS= Mass Spectrometry Detector (GC e LC) NPD = Nitrogen Phosphorus Detector (GC) RID= Refractive Index Detector (LC) TCD= Thermo Conductivity Detector (GC) UV-VIS= UltraViolet-Visible Detector (LC)


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