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Clostridi. Bacilli Gram-positivi Bacilli Gram-positivi Sporigeni Sporigeni Le spore sopravvivono nell’ambiente per molto tempo Le spore sopravvivono nell’ambiente.

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Presentazione sul tema: "Clostridi. Bacilli Gram-positivi Bacilli Gram-positivi Sporigeni Sporigeni Le spore sopravvivono nell’ambiente per molto tempo Le spore sopravvivono nell’ambiente."— Transcript della presentazione:

1 Clostridi

2 Bacilli Gram-positivi Bacilli Gram-positivi Sporigeni Sporigeni Le spore sopravvivono nell’ambiente per molto tempo Le spore sopravvivono nell’ambiente per molto tempo Metabolismo strettamente fermentativo Metabolismo strettamente fermentativo Anaerobi obbligati Anaerobi obbligati

3 Clostridi Abili fermentatori produttori di acidi butirrico, acido acetico, butanolo e acetone Abili fermentatori produttori di acidi butirrico, acido acetico, butanolo e acetone Produzione di enzimi extracellulari: Produzione di enzimi extracellulari: ruolo ambientale nel ciclo del carbonio ruolo ambientale nel ciclo del carbonio ruolo nell’invasione e nella patologie ruolo nell’invasione e nella patologie

4 Clostridi La maggior parte sono saprofiti. La maggior parte sono saprofiti. Quelli patogeni per l’uomo, innanzitutto saprofiti in natura e in un certo senso possono essere considerati patogeni opportunisti. Quelli patogeni per l’uomo, innanzitutto saprofiti in natura e in un certo senso possono essere considerati patogeni opportunisti. C. perfrigens, C. difficile, Clostridium tetani, C. botulinum, C. perfrigens, C. difficile, Clostridium tetani, C. botulinum,

5 Clostridium perfrigens

6 Produce una grande quantità di esotossine ed invasine responsabili infezioni chirurgiche. Produce una grande quantità di esotossine ed invasine responsabili infezioni chirurgiche. Agente eziologico della gangrena gassosa e di gravi infezioni uterine. Agente eziologico della gangrena gassosa e di gravi infezioni uterine. Emolisine e enzimi extracellulari ( proteasi, lipasi collagenasi e ialuronidasi contribuiscono al processo invasivo del microrganismo Emolisine e enzimi extracellulari ( proteasi, lipasi collagenasi e ialuronidasi contribuiscono al processo invasivo del microrganismo Produzione di un enterotossina responsabile di intossicazione alimentare (cibo in scatola sterilizzato in maniera impropria) Produzione di un enterotossina responsabile di intossicazione alimentare (cibo in scatola sterilizzato in maniera impropria)

7 C. perfringens: enterite necrotizzante  Ingestione di alimenti contaminati da ceppi di tipo C tossina beta necrosi emorragica della mucosa intestinale.  E’ frequente in individui con un basso livello di enzimi proteolitici intestinali (inattivazione della tossina) Sintomatologia: dolori addominali, diarrea profusa e presenza di sangue nelle feci. Periodo di incubazione: 5-6 ore dall’ingestione di alimenti contaminati Tasso di mortalità: dei casi non trattati.

8 C. perfringens: Diagnosi  Forme colturali Campione clinico: ferita, sangue, feci o alimenti contaminati AGAR SANGUE a 45°C in anaerobiosi, colonie con emolisi Clostridium perfringens su agar sangue dopo 48 h di incubazione in anaerobiosi a 45°C Clostridium perfringens su SFP dopo 48 h di incubazione in anaerobiosi a 37°C Evidenza di doppio alone di emolisi dovuto a: Tossina alfa : grande alone emolisi incompleto Tossina teta : alone interno di emolisi completa  Ricerca dell’enterotossina -Tests immunoenzimatici -Tecniche molecolari: evidenza del gene codificante la tossina

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10 Clostridium difficile Patogeno che causa AAD (diarrea associata ad antibiotici) e patologie intestinali più serie come colite e colite pseudomembranosa. Patogeno che causa AAD (diarrea associata ad antibiotici) e patologie intestinali più serie come colite e colite pseudomembranosa. Le patologie in questione, di solito, non interessano soggetti sani. Le patologie in questione, di solito, non interessano soggetti sani. Fattori predisponenti: prolungato uso di antibiotici, età, interventi chirurgigi gastro- intestinali, immuno-compromessi. Fattori predisponenti: prolungato uso di antibiotici, età, interventi chirurgigi gastro- intestinali, immuno-compromessi.

11 Clostridium difficile Due fattori di virulenza: Tossina A e B Due fattori di virulenza: Tossina A e B Tossina A è un enterotossina che causa accumulo di fluidi nell’intestino. Tossina A è un enterotossina che causa accumulo di fluidi nell’intestino. Tossina B ha un’ azione citopatica con effetto estremamente letale. Tossina B ha un’ azione citopatica con effetto estremamente letale. Le tossine sono molto instabili, degradano a temperatura ambiente dopo due ore. Le tossine sono molto instabili, degradano a temperatura ambiente dopo due ore. Problemi diagnostici se si ricercano nelle feci dopo tale tempo. Problemi diagnostici se si ricercano nelle feci dopo tale tempo.

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13 C. difficile: diagnosi  Campione clinico: feci Terreno selettivo contenente cicloserina, cefoxitina e fruttosio anaerobiosi per 48h. Ricerca delle tossine in campioni di feci  Colture cellulari (HeLA, VERO, Hep-2) inoculate con filtrati fecali Effetto citopatico  Tests immunoenzimatici C. difficile colonies on blood agar

14 Clostridium tetani

15 Agente eziologico del tetano. Agente eziologico del tetano. Il microrganismo vive nel suolo concimato e nel tratto intestinale e nelle feci di vari animali. Il microrganismo vive nel suolo concimato e nel tratto intestinale e nelle feci di vari animali. Portatori sani nell’uomo (0-25%) probabile transiente della flora intestinale dopo ingestione. Portatori sani nell’uomo (0-25%) probabile transiente della flora intestinale dopo ingestione. Produce spore nella parte terminale della cellula Produce spore nella parte terminale della cellula Tipica cellula gram positiva anche se la colorazione da risultati contrastanti specialmente nei riguardi di cellule vecchie. Tipica cellula gram positiva anche se la colorazione da risultati contrastanti specialmente nei riguardi di cellule vecchie.

16 Tetano Malattia con alta mortalità (40-78%). Malattia con alta mortalità (40-78%). Responsabile della patologia una potente neurotossina (Tossina tetanica o tetanospasmina) prodotta dopo germinazione sporale in seguito ad accesso delle spore in una ferita. Responsabile della patologia una potente neurotossina (Tossina tetanica o tetanospasmina) prodotta dopo germinazione sporale in seguito ad accesso delle spore in una ferita. Moltiplicazione batterica locale con effetti tossici lontano dal sito di infezione Moltiplicazione batterica locale con effetti tossici lontano dal sito di infezione

17 Tetano Meno di 150 casi/anno negli U.S. grazie all’ immunizzazione di numerosi tossoidi. Meno di 150 casi/anno negli U.S. grazie all’ immunizzazione di numerosi tossoidi. Molti di questi casi riguardano persone sopra i 60 anni. Molti di questi casi riguardano persone sopra i 60 anni. Più di casi/anno a livello mondiale Più di casi/anno a livello mondiale

18 Tetano patogenesi Piccole punture o ferite lacero contuse vengono contaminate dalle spore di C. tetani, che germinano e producono la tossina. Piccole punture o ferite lacero contuse vengono contaminate dalle spore di C. tetani, che germinano e producono la tossina. Infezione localizzata spesso con minimo danno infiammatorio. Infezione localizzata spesso con minimo danno infiammatorio. La tossina prodotta risale i nervi periferici e agisce a livello del sistema nervoso centrale. La tossina prodotta risale i nervi periferici e agisce a livello del sistema nervoso centrale. Sintomi clinici: forti dolorosi spasmi e rigidità dei muscoli volontari. Sintomi clinici: forti dolorosi spasmi e rigidità dei muscoli volontari. Lockjaw, rigidità e spasmi muscolari del tronco e degli arti. Lockjaw, rigidità e spasmi muscolari del tronco e degli arti.

19 Tetano patogenesi Spasmi dei muscoli della faringe causano difficoltà nell’inghiottire. Spasmi dei muscoli della faringe causano difficoltà nell’inghiottire. La morte avviene,quasi sempre, per problemi che interferiscono con i meccanismi della respirazione La morte avviene,quasi sempre, per problemi che interferiscono con i meccanismi della respirazione

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21 Tossina tetanica 11 ceppi di C. tetani differenti sulla base di antigeni flagellari distinguibili per diversa abilita’ nel produrre la tossina. 11 ceppi di C. tetani differenti sulla base di antigeni flagellari distinguibili per diversa abilita’ nel produrre la tossina. Tutti, però, producono una tossina identica dal punto di vista antigenico e farmacologico Tutti, però, producono una tossina identica dal punto di vista antigenico e farmacologico La tossina (Tetanospasmina) e codificata da un plasmide. La tossina (Tetanospasmina) e codificata da un plasmide.

22 Tossina tetanica Una delle tre sostanze più tossiche in natura (difterica e botulinica). Una delle tre sostanze più tossiche in natura (difterica e botulinica). Prodotta durante lisi cellulare. Prodotta durante lisi cellulare. Dopo inoculazione di spore nelle ferite, e richiesta una piccola quantità germinazione sporale e replicazione cellulare per la produzione della tossina. Dopo inoculazione di spore nelle ferite, e richiesta una piccola quantità germinazione sporale e replicazione cellulare per la produzione della tossina.

23 Tossina tetanica La tossina è sintetizzata come singolo polipeptide di 150kDa La tossina è sintetizzata come singolo polipeptide di 150kDa Attivata da una proteasi batterica in due frammenti B ( heavy chain 100kDa), A ( light chain 50kDa) uniti da un ponte disulfito. Attivata da una proteasi batterica in due frammenti B ( heavy chain 100kDa), A ( light chain 50kDa) uniti da un ponte disulfito. Anomalia della natura? (nessun vantaggio per il microrganismo nella patogenesi) Anomalia della natura? (nessun vantaggio per il microrganismo nella patogenesi)

24 Azione tossina tetanica Tetanospasmina lega i nervi periferici. Tetanospasmina lega i nervi periferici. Trasportata all’interno degli assoni e attraverso le giunzioni sinaptiche al SNC. Trasportata all’interno degli assoni e attraverso le giunzioni sinaptiche al SNC. Si fissa ai recettori gangliosidici delle terminazioni nervose e, una volta fissata, la sua azione, consiste nel blocco dei mediatori chimici dell'inibizione muscolare (glicina, acido amino-butirrico). Si fissa ai recettori gangliosidici delle terminazioni nervose e, una volta fissata, la sua azione, consiste nel blocco dei mediatori chimici dell'inibizione muscolare (glicina, acido amino-butirrico). L’impulso nervoso non e’ più sotto il controllo del meccanismo inibitorio. L’impulso nervoso non e’ più sotto il controllo del meccanismo inibitorio. Produzione di spasmi muscolari generalizzati. Produzione di spasmi muscolari generalizzati.

25 Azione tossina tetanica La tetanospasmina taglia in maniera specifica un componente proteico delle vescicole sinaptiche la sinaptobrevina II interferendo con lo stimolo dei neuroni inibitori e di fatto prevenendo il rilascio dei neurotrasmettitori dalla cellula. La tetanospasmina taglia in maniera specifica un componente proteico delle vescicole sinaptiche la sinaptobrevina II interferendo con lo stimolo dei neuroni inibitori e di fatto prevenendo il rilascio dei neurotrasmettitori dalla cellula.

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27  Si effettua su base clinica  Esame microscopico (materiale da ferite)  Esame colturale: 37°C; anaerobiosi Agar sangue: colonie beta-emolitiche con alone di sciamaggio  Ricerca della tetanospasmina: test di neutralizzazione con antisieri specifici (topo). C. tetani: diagnosi

28 Individui non vaccinati Individui in cui è stata somministrata una dose di richiamo del vaccino da più di 10 aa C. tetani: terapia e profilassi UI Immunoglobuline umane antitossina.  neutralizzare la tossina non legata alle cellule nervose  Vaccino antitetanico  Benzodiazepine per ridurre o prevenire gli spasmi muscolari. PROFILASSI Vaccino: tossina tetanica purificata e trattata con formolo a 37°C. In Italia si somministra prima di 7 aa e a distanza di 4-5 anni dal primo ciclo di vaccinazione. Ogni 10 anni si somministra una dose di richiamo.

29 Clostridium botulinum

30 Grande bacillo anaerobio sporigeno. Grande bacillo anaerobio sporigeno. Ampiamente presente nell’ambiente Ampiamente presente nell’ambiente Occasionalmente flora transiente del tratto intestinale di uccelli, mammiferi e pesci. Occasionalmente flora transiente del tratto intestinale di uccelli, mammiferi e pesci. Esistono 7 tipi tossigenici ognuno produttore di una immunologica diversa forma di tossina botulinica (A, B, C1, D, E, F e G). Esistono 7 tipi tossigenici ognuno produttore di una immunologica diversa forma di tossina botulinica (A, B, C1, D, E, F e G). C e D, conversione lisogena. G, plasmide. C e D, conversione lisogena. G, plasmide. Negli U.S. il tipo A e’ responsabile del 62% dei casi Negli U.S. il tipo A e’ responsabile del 62% dei casi

31 Clostridium botulinum Agente eziologico del botulismo, una intossicazione alimentare determinata dalla tossina botulinica che assorbita dal duodeno e digiuno arriva attraverso il torrente circolatorio alle sinapsi neuromuscolari periferiche. Agente eziologico del botulismo, una intossicazione alimentare determinata dalla tossina botulinica che assorbita dal duodeno e digiuno arriva attraverso il torrente circolatorio alle sinapsi neuromuscolari periferiche. Intossicazione non infezione. (S. enterotossico) Intossicazione non infezione. (S. enterotossico)

32 Clostridium botulinum Cibi a rischio: carne cruda contaminata dalla tossina resistente al calore, soprattutto in scatola per l’ambiente anaerobico prodotto dalla tecnica dell’inscatolamento e eventuale impropria sterilizzazione. Cibi a rischio: carne cruda contaminata dalla tossina resistente al calore, soprattutto in scatola per l’ambiente anaerobico prodotto dalla tecnica dell’inscatolamento e eventuale impropria sterilizzazione.

33 C. botulinum: patogenesi Fattori di virulenza: neurotossina Manifestazioni cliniche: Botulismo alimentare: neurotossina ingerita con l’alimento contaminato da sporegerminazione replicazione delle cellule vegetativa con produzione della tossina. Tossina è inattivata a 100°C per 10 minuti bollitura dei cibi contaminati ne determina l’inattivazione. Tossina non è inattivata dal pH acido e dagli enzimi proteolitici dello stomaco.

34 Botulino I sintomi clinici iniziano ore dall’ingestione della tossina (debolezza, vertigini, secchezza delle fauci) I sintomi clinici iniziano ore dall’ingestione della tossina (debolezza, vertigini, secchezza delle fauci) Segni neurologici appaiono molto presto (visioni offuscate, difficoltà ad inghiottire, a parlare, crescente debolezza dei muscoli scheletrici, paralisi respiratoria. Segni neurologici appaiono molto presto (visioni offuscate, difficoltà ad inghiottire, a parlare, crescente debolezza dei muscoli scheletrici, paralisi respiratoria. La tossina botulinica può raggiungere attraverso le fibre nervose il SNC anche se il SNC raramente risulta coinvolto. La tossina botulinica può raggiungere attraverso le fibre nervose il SNC anche se il SNC raramente risulta coinvolto.

35 C. botulinum: patogenesi  Botulismo da ferita: spore penetrano attraverso le lesioni cutanee germinazione crescita e produzione della tossina nella ferita diffusione della tossina a livello sistemico stessa sintomatologia del botulismo alimentare.  Botulismo da inalazione: neurotossina come arma batteriologica.  Botulismo infantile o neonatale: ingestione di spore germinazione, moltiplicazione batterica e produzione di tossina nell’intestino del neonato paralisi. Tossinfezione dovuta alla flora microbica intestinale del neonato non ancora ben sviluppata incapace di competere con C. botulinum.  Botulismo senil-infantile: si manifesta in individui adulti sottoposti a prolungata terapia antibiotica o con alterata anatomia gastrointestinale.

36 C. botulinum: epidemiologia  Botulismo alimentare: ingestione di alimenti preparati in casa o artigianali (verdura in scatola, conserve di pesce) e di carne conservata. Italia: casi/anno Epidemia: 1996 (mascarpone) Est-Europa: elevata incidenza in Armenia, Azerbaijan e Georgia a causa del consumo elevato di verdure inscatolate e conservate in casa.  Botulismo infantile: rari casi in Italia mentre negli Stati Uniti vengono stimati in media 110 casi/anno (attribuita a consumo di miele contaminato da spore di C. botulinum).

37 Tossine botulinica Le tossine botuliniche sono simili per struttura e funzione alla tossina tetanica. Le tossine botuliniche sono simili per struttura e funzione alla tossina tetanica. Differiscono dalla tetanica per l’effetto clinico dovuto al targhet su cellule diverse del sistema nervoso. Differiscono dalla tetanica per l’effetto clinico dovuto al targhet su cellule diverse del sistema nervoso. L’azione tossica riguarda il sistema nervoso periferico riflettendo l’azione della tossina nei confronti dei neuroni eccitatori a livello delle giunzioni neuromuscolari. L’azione tossica riguarda il sistema nervoso periferico riflettendo l’azione della tossina nei confronti dei neuroni eccitatori a livello delle giunzioni neuromuscolari. Paralisi flaccida Paralisi flaccida

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39 Azione della tossina botulinica Specifica per le terminazioni nervose periferiche nel punto dove il neurone stimola il muscolo. Specifica per le terminazioni nervose periferiche nel punto dove il neurone stimola il muscolo. Legame della tossina con il neurone e blocco del rilascio di acetilcolina attraverso le vescicole sinaptiche. Legame della tossina con il neurone e blocco del rilascio di acetilcolina attraverso le vescicole sinaptiche. Differenti tossine sembrano utilizzare recettori diversi. Differenti tossine sembrano utilizzare recettori diversi.

40 Azione della tossina botulinica La regione di legame del frammento B e localizzata vicino la parte carbossi-terminale. La regione di legame del frammento B e localizzata vicino la parte carbossi-terminale. La tossina entra nella cellula mediante endocitosi mediata dal recettore. La tossina entra nella cellula mediante endocitosi mediata dal recettore. All’interno della cellula i diversi tipi di tossina differiscono nei meccanismi per i quali inibiscono il rilascio di acetilcolina anche se e’ stato riportato anche un meccanismo simile alla tetanospasmina. All’interno della cellula i diversi tipi di tossina differiscono nei meccanismi per i quali inibiscono il rilascio di acetilcolina anche se e’ stato riportato anche un meccanismo simile alla tetanospasmina.

41 Azione della tossina botulinica Al momento non e’ del tutto chiaro come la tossina previene il rilascio di acetilcolina. Al momento non e’ del tutto chiaro come la tossina previene il rilascio di acetilcolina. Recenti evidenze suggeriscono che sia la tossina botulinica che la tetanica sono endopeptidasi zinco dipendente che tagliano proteine coinvolte nel rilascio dei neurotrasmettitori (sinaptobrevine, snap 25, sintaxina). Recenti evidenze suggeriscono che sia la tossina botulinica che la tetanica sono endopeptidasi zinco dipendente che tagliano proteine coinvolte nel rilascio dei neurotrasmettitori (sinaptobrevine, snap 25, sintaxina).

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44 C. botulinum: diagnosi  Ricerca della tossina botulinica nel siero, feci, contenuto gastrico. Somministrazione del campione clinico non trattato e trattati al calore nel topo paralisi flaccida.  Esame colturale in anaerobiosi di feci.

45 C. botulinum: terapia  Somministrazione di antisiero trivalente contenente anticorpi verso le tossine A, B ed E.  Vaccinazione con anatossina: non viene praticata.


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