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Le tecniche di coltura in vitro Francesco Sunseri.

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Presentazione sul tema: "Le tecniche di coltura in vitro Francesco Sunseri."— Transcript della presentazione:

1 Le tecniche di coltura in vitro Francesco Sunseri

2 2 La definizione … the aseptic culture of plant protoplasts, cells, tissues or organs under conditions which lead to cell multiplication or regeneration of organs or whole plants … the aseptic culture of plant protoplasts, cells, tissues or organs under conditions which lead to cell multiplication or regeneration of organs or whole plants (Murashige, 1963)

3 3 1.Concetti fondamentali / Storia 2.Tipi di cellule o tessuti 3.Processi di crescita 4.Regolatori di crescita Argomenti da trattare Argomenti da trattare:

4 4 La coltura di cellule e tessuti di piante trova il suo fondamento nella totipotenza cellulare La coltura di cellule e tessuti di piante trova il suo fondamento nella totipotenza cellulare In tutte le piante vascolari lembrione si evolve in una struttura bipolare per la presenza di due meristemi apicali In tutte le piante vascolari lembrione si evolve in una struttura bipolare per la presenza di due meristemi apicali Durante il ciclo della pianta tali meristemi producono continuamente nuovi organi che si aggiungono a quelli prodotti durante lembriogenesi Durante il ciclo della pianta tali meristemi producono continuamente nuovi organi che si aggiungono a quelli prodotti durante lembriogenesi Che cosa sono

5 5 Le piante vascolari sono state pertanto definite organismi a ontogenesi ricorrente, a causa di tale fenomeno nelle piante non si assiste alla separazione tra linea somatica e linea germinale Le piante vascolari sono state pertanto definite organismi a ontogenesi ricorrente, a causa di tale fenomeno nelle piante non si assiste alla separazione tra linea somatica e linea germinale Durante lo sviluppo gli apici vegetativi possono modificarsi in apici riproduttivi, sviluppando le strutture tipiche della riproduzione Durante lo sviluppo gli apici vegetativi possono modificarsi in apici riproduttivi, sviluppando le strutture tipiche della riproduzione Per entrambe queste ragioni nelle piante vascolari qualsiasi cellula somatica può considerarsi un progenitore potenziale di un nuovo individuo … Per entrambe queste ragioni nelle piante vascolari qualsiasi cellula somatica può considerarsi un progenitore potenziale di un nuovo individuo … Che cosa sono

6 6 Il termine sottende a differenti metodologie che consentono la crescita e lo sviluppo di cellule, tessuti ed organi vegetali su terreni sintetici Il termine sottende a differenti metodologie che consentono la crescita e lo sviluppo di cellule, tessuti ed organi vegetali su terreni sintetici La crescita e la moltiplicazione di nuove cellule si può indurre anche da tessuti già differenziati che subiscono un processo di sdifferenziamento La crescita e la moltiplicazione di nuove cellule si può indurre anche da tessuti già differenziati che subiscono un processo di sdifferenziamento Si formano quindi ammassi amorfi, definiti calli, che possono essere mantenuti indefinitamente in vitro o possono essere indotti a rigenerare organi o piante intere Si formano quindi ammassi amorfi, definiti calli, che possono essere mantenuti indefinitamente in vitro o possono essere indotti a rigenerare organi o piante intere Coltura in vitro

7 7 Callo Rappresenta la naturale risposta della pianta ad una ferita Rappresenta la naturale risposta della pianta ad una ferita E una massa di cellule in attiva divisione per la produzione di cellule indifferenziate prodotte da espianti di tessuto vegetale E una massa di cellule in attiva divisione per la produzione di cellule indifferenziate prodotte da espianti di tessuto vegetale E formato da cellule totipotenti E formato da cellule totipotenti

8 8 Tutti i vegetali possono essere considerati sorgenti potenziali di cellule per coltura in vitro Tutti i vegetali possono essere considerati sorgenti potenziali di cellule per coltura in vitro Alcune specie sembrano fare eccezione a tale regola, ma è probabile una erronea scelta delle condizioni colturali Alcune specie sembrano fare eccezione a tale regola, ma è probabile una erronea scelta delle condizioni colturali Infatti le condizioni colturali possono mostrare differenze significative in relazione a sostanze specifiche e condizioni microambientali utilizzati Infatti le condizioni colturali possono mostrare differenze significative in relazione a sostanze specifiche e condizioni microambientali utilizzati Coltura in vitro

9 9 Principali caratteristiche Si effettuano: Si effettuano: su micro scala su micro scala in condizioni ambientali ottimizzate (nutrienti, luce, temperatura) in condizioni ambientali ottimizzate (nutrienti, luce, temperatura) in assenza di microrganismi (funghi, batteri, virus). in assenza di microrganismi (funghi, batteri, virus).

10 10 ] Teoria cellulare e totipotenza ] Formazione del callo e sostanze di crescita ] Prime colture cellulari ] Prime colture di tessuti vegetali ] Colture di organi vegetali 1. Storia

11 11 Cork tissue as observed by Robert Hooke in 1664 Teoria cellulare …. Le cellule furono osservate per la prima volta nel 1664 da Robert Hooke, che studiò con un microscopio rudimentale sottili fettine di sughero e vide che esse erano formate da elementi di forma regolare. Egli chiamò cellule questi elementi (dal latino cellula, "piccola stanza"), perché esse avevano l'aspetto di piccole scatole.

12 12 …Haberlandt.. agli inizi del 1900 … propose il concetto di totipotenza … cellule allevate in adatte conditizioni Callo coltivato a partire dal cambio (Gautheret, Nobecourt, Whire nel 1930) … le cellule restavano vive ma non si moltiplicavano Le prime colture cellulari ….

13 13 Distensione cellulare … ruolo delle auxine Distensione cellulare … ruolo delle auxine Divisione cellulare... ruolo delle citochinine Divisione cellulare... ruolo delle citochinine - in funzione della scoperta dei Regolatori di crescita - in funzione della scoperta dei Regolatori di crescita Le prime colture di tessuti …. Rigenerazione di tabacco.... (Skoog and Miller) …. interazione tra auxine e citochinine dava differenziazione. Rigenerazione di tabacco.... (Skoog and Miller) …. interazione tra auxine e citochinine dava differenziazione.

14 14 GA per la crescita dei germogli GA per la crescita dei germogli Aux + Cyt + zucchero > sviluppo vascolare Aux + Cyt + zucchero > sviluppo vascolare Colture di strati sottili … interazione con altri fattori es. pH Colture di strati sottili … interazione con altri fattori es. pH Successivi sviluppi …

15 15 Il primo uso commerciale di piante propagate su mezzo artificiale è stato fatto per la germinazione e lo sviluppo di orchidee nel 1920 Il primo uso commerciale di piante propagate su mezzo artificiale è stato fatto per la germinazione e lo sviluppo di orchidee nel 1920

16 16 Pianta di carota da cellule radicali – Stewart in 1964

17 17 Pianta di tabacco da singola cellula – Vasil & Hilderbrandt 1965

18 18 la coltura delle piante in vitro ha visto il suo pieno sviluppo grazie alla messa a punto di un mezzo di coltura artificiale da parte di Murashige & Skoog nel 1962 Coltura di organi vegetali …. … ma la coltura delle piante in vitro ha visto il suo pieno sviluppo grazie alla messa a punto di un mezzo di coltura artificiale da parte di Murashige & Skoog nel 1962 micropropagazione

19 19 ]Molti tipi di cellule ]Grado di specializzazione diversificato - Meristematico - Embrionale - Riproduttivo 2. Tipi di cellule e tessuti

20 20 ]Germoglio... apicale, … ascellare Tessuti meristematici...

21 21 leaf trace procambium tunica new leaf corpus pith cortex apical meristem axillary meristem

22 22 ]Germogli... apicali, … ascellari ]Foglie ]Radici Tessuti meristematici...

23 23 Tessuti embrionali... ] Piante pre-formate ] Germinali / somatici ] Giovanile

24 24 Tessuti riproduttivi... ] Diploide / Aploide ] Femminile / Maschile

25 25 Moltiplicazione \ Moltiplicazione l Dominanza apicale l Differenziazione Crescita \ Crescita l Divisione cellulare l Distensione cellulare Fasi di sviluppo \ Fasi di sviluppo l Giovanilità l Dormienza 3. Processi di crescita

26 26 \ Fotosintesi \ Traspirazione e assorbimento dellacqua \ Instabilità citologica \ Meccanismi fisiologici \ Manipolazioni fisiche \ Ambiente \ Genotipo 3. Altri processi

27 27 ] Le auxine ] Le citochinine ] Le gibberelline (GA) ] Lacido abscissico (ABA) ] Letilene 4. Regolatori di crescita

28 28 Regolatori di crescita Auxine Essenziali (non sono noti effetti mutageni) Essenziali (non sono noti effetti mutageni) Il solo composto naturale è lo IAA (Indole-3- Acetic Acid). Altri prodotti sintetici sono NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloram) – meno costosi e più stabili Il solo composto naturale è lo IAA (Indole-3- Acetic Acid). Altri prodotti sintetici sono NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloram) – meno costosi e più stabili Stimolazione della distensione cellulare in fusti e coleoptili Stimolazione della distensione cellulare in fusti e coleoptili Promuovono la radicazione Promuovono la radicazione Sono sintetizzate nei meristemi, specialmente in quelli apicali (inibizione della crescita delle gemme laterali) Sono sintetizzate nei meristemi, specialmente in quelli apicali (inibizione della crescita delle gemme laterali)

29 29 Essenziali (non sono noti effetti mutageni) Essenziali (non sono noti effetti mutageni) Un solo composto naturale la Zeatina; analoghi sintetici sono: Benzyladenine (BA) e Kinetin Un solo composto naturale la Zeatina; analoghi sintetici sono: Benzyladenine (BA) e Kinetin Stimola la divisione cellulare Stimola la divisione cellulare Promuove la formazione di gemme avventizie Promuove la formazione di gemme avventizie Sono sintetizzate nel meristema radicale e trasportate nel floema sotto forma di Zeatin- riboside Sono sintetizzate nel meristema radicale e trasportate nel floema sotto forma di Zeatin- riboside Citochinine Regolatori di crescita

30 30 Questa classe comprende più di 70 composti, varie forme dell acido gibberellico Questa classe comprende più di 70 composti, varie forme dell acido gibberellico In commercio sono disponibili diversi formulati (GA 3, GA 4, GA 9 ) In commercio sono disponibili diversi formulati (GA 3, GA 4, GA 9 ) Stimola leziolatura dello stelo Stimola leziolatura dello stelo Sintetizzate nelle giovani foglie Sintetizzate nelle giovani foglie Gibberelline Regolatori di crescita

31 31 Esiste solo un componente naturale Esiste solo un componente naturale Promuove labscissione delle foglie e la dormienza dei semi Promuove labscissione delle foglie e la dormienza dei semi Gioca un ruolo dominante nella chiusura degli stomi in condizioni di stress idrico Gioca un ruolo dominante nella chiusura degli stomi in condizioni di stress idrico Ha un ruolo importante nellembriogenesi (aiuta la formazione di embrioni normali) Ha un ruolo importante nellembriogenesi (aiuta la formazione di embrioni normali) Acido abscissico (ABA) Regolatori di crescita

32 32 Bilancio ormonale Auxine Citochinine Alte Basse Basse Alte Formazione di radici dopo il taglio Formazione di radici dopo il taglio Embriogenesi Embriogenesi Formazione di radici avventizie Formazione di radici avventizie Induzione a callo Induzione a callo Formazione di germogli avventizi Formazione di germogli avventizi Crescita di germogli ascellari Crescita di germogli ascellari

33 33 Rapporto auxine : citochinine

34 34 Azione dellormone per ….. ] Applicazione + assorbimento ] Endogeno + applicato ] Accumulazione e assuefazione ] Interazione / Sequenza di applicazione ] Impulso o esposizione prolungata

35 35 Elementi minerali (17 elementi essenziali) Elementi minerali (17 elementi essenziali) Fonte denergia e di carbonio (saccarosio) Fonte denergia e di carbonio (saccarosio) Regolatori di crescita (fitormoni) Regolatori di crescita (fitormoni) Vitamine Vitamine Composti organici Composti organici Acqua Acqua pH ( ) pH ( ) Gelling agents: Agar, agarose, gellan gum Gelling agents: Agar, agarose, gellan gum Mezzo di coltura in vitro

36 36 Composti inorganici Macroelementi (>mg/l di N, P, K, Ca, Mg e S) e microelementi ( mg/l di N, P, K, Ca, Mg e S) e microelementi (

37 37 Un ampio range di vitamine sono disponibili e possono essere usate Un ampio range di vitamine sono disponibili e possono essere usate Generalmente, più è piccolo lespianto, più appropriata deve essere la scelta della/e vitamine Generalmente, più è piccolo lespianto, più appropriata deve essere la scelta della/e vitamine Un cocktail di vitamine è spesso usato Un cocktail di vitamine è spesso usato Linositolo di solito deve essere aggiunto a maggiori concentrazioni (100mg/l) Linositolo di solito deve essere aggiunto a maggiori concentrazioni (100mg/l) Vitamine

38 38 Vitamine Tiamina Tiamina Piridossina Piridossina Acido nicotinico Acido nicotinico Biotina Biotina Acido Citrico Acido Citrico Acido Ascorbico Acido Ascorbico Myo-inositolo Myo-inositolo

39 39 La rigenerazione può avvenire via organogenesi via organogenesi via embriogenesi somatica via embriogenesi somatica

40 40 Organogenesi Lorganogenesi prevede la formazione di germogli, foglie e radici e si verifica quando si differenziano in vitro centri meristematici unipolari quali le gemme avventizie Lorganogenesi prevede la formazione di germogli, foglie e radici e si verifica quando si differenziano in vitro centri meristematici unipolari quali le gemme avventizie Questi organi possono derivare da meristemi preesistenti o da cellule indifferenziate Questi organi possono derivare da meristemi preesistenti o da cellule indifferenziate Come per lembriogenesi può aversi una fase intermedia di callo, ma spesso si osserva senza il passaggio da questo stadio Come per lembriogenesi può aversi una fase intermedia di callo, ma spesso si osserva senza il passaggio da questo stadio

41 41 La differenziazione di radici e germogli in colture di tessuto di tabacco era funzione del rapporto auxine- citochinine, e la differenziazione dellorgano potrebbe essere regolato dal cambiamento delle concentrazioni relative delle due sostanze nel mezzo di coltura 1957 Skoog and Miller Organogenesi

42 42 Embriogenesi Somatica Lembriogenesi somatica consiste nella produzione di embrioni da cellule somatiche o non germinanti, la rigenerazione comporta la successione delle fondamentali fasi di sviluppo che caratterizzano la differenziazione dellembrione zigotico Lembriogenesi somatica consiste nella produzione di embrioni da cellule somatiche o non germinanti, la rigenerazione comporta la successione delle fondamentali fasi di sviluppo che caratterizzano la differenziazione dellembrione zigotico Si assiste quindi alla comparsa di una struttura bipolare, priva di connessioni vascolari con il tessuto originario, che evolve in un embrione cotiledonare Si assiste quindi alla comparsa di una struttura bipolare, priva di connessioni vascolari con il tessuto originario, che evolve in un embrione cotiledonare

43 43 Acclimatamento Le piante ottenute in vitro devono essere preparate alla sopravvivenza in vivo Le piante ottenute in vitro devono essere preparate alla sopravvivenza in vivo Alta umidità Alta umidità Luce Luce Temperature tra 20-25°C Temperature tra 20-25°C Elementi nutritivi Elementi nutritivi Terreno adatto Terreno adatto

44 44

45 45 micropropagazione e rapida moltiplicazione di cloni micropropagazione e rapida moltiplicazione di cloni rigenerazione e trasformazione genetica rigenerazione e trasformazione genetica induzione di variazione somaclonale induzione di variazione somaclonale ottenimento di aploidi da micro e macrospore ottenimento di aploidi da micro e macrospore allevamento e mantenimento di piante virus esenti allevamento e mantenimento di piante virus esenti manipolazione di protoplasti ed ibridazione somatica manipolazione di protoplasti ed ibridazione somatica conservazione del germoplasma conservazione del germoplasma produzione di metaboliti di interesse industriale produzione di metaboliti di interesse industriale Applicazioni delle colture in vitro

46 Plant Genetic Transformation

47 47 Overview Introduzione Introduzione Plant genetic transformation Plant genetic transformation Stato attuale delle PGM Stato attuale delle PGM Trends futuri e problemi Trends futuri e problemi

48 48 Introduzione Potenzialità delle biotecnologie vegetali Potenzialità delle biotecnologie vegetali Uso di nuovi geni introdotti Uso di nuovi geni introdotti Tratti che i plant breeders vorrebbero trasferire Tratti che i plant breeders vorrebbero trasferire

49 49 Tratti genetici di interesse per i plant breeders Alta produttività Alta produttività Alta qualità nutrizionale Alta qualità nutrizionale Adattabilità allinter- cropping Adattabilità allinter- cropping Fissazione dellazoto Fissazione dellazoto Resistenza a stress idrico Resistenza a stress idrico Resistenza a stress biotici Resistenza a stress biotici Adattabilità alla meccanizzazione Adattabilità alla meccanizzazione Insensibilità al fotoperiodo Insensibilità al fotoperiodo Eliminazione di composti tossici Eliminazione di composti tossici

50 50 Sviluppo dei cibi GM Pomodoro Flavr-Savr – 1^ FDA approvazione per un cibo 1995 Soia Roundup della Monsanto approvata per il commercio negli Stati Uniti 1994 Primo campo di cotone GM condotto con successo 1990 PGM resistenti a insetti, virus e batteri sono saggiate in campo per la prima volta – TRATTI UTILI ^ pianta transgenica : tabacco resistente ad antibiotico 1983 La ricerca sviluppa capacità ad isolare geni 1973 Prima rigenerazione di piante intere da in vitro culture 1950

51 51 Metodi di trasformazione genetica Trasformazione biologica Trasformazione biologica Biolistico - gene gun o particle gun Biolistico - gene gun o particle gun Elettroporazione Elettroporazione Microiniezione Microiniezione

52 52 Trasformazione biologica Agrobacterium tumefaciens & A. rhizogenes Agrobacterium tumefaciens & A. rhizogenes causano infezione nelle piante causano infezione nelle piante le formazioni tumorali sono la conseguenza del trasferimento, da parte del batterio, di un segmento di DNA, chiamato T-DNA le formazioni tumorali sono la conseguenza del trasferimento, da parte del batterio, di un segmento di DNA, chiamato T-DNA

53 53 Agrobacterium gene transfer

54 54 Esempio di protocollo per la trasformazione con Agrobacterium Sterilizzare Trasferire su mezzo di induzione del germoglio + carbenicillina; in coltura ~ 2 giorni Leaf disk Blot disk dry Transferire su mezzo per indurre germoglio + carbenicillina + selettivo per il transgene (es. kanamicina), coltivare/subcoltivare fino a che si formano i germogli Excidere i germogli dal callo, trasferire su mezzo di radicazione Trasferire le plantule nel terreno appena si formano le radici Espianto fogliare Incubare con Agrobacterium

55 55 Tratti transgenici inseriti 19% resistenza ad insetti (mais, cotone)19% resistenza ad insetti (mais, cotone) 7% altri caratteri7% altri caratteri 74% resistenza ad erbicidi (soia, canola)74% resistenza ad erbicidi (soia, canola)

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