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Perché conoscere i metodi strutturali?. ....acccaa gaagtcagaa tcctcgaagc tgaagcctga ctgtaagctc tgcctcctac aactagacaa gtcacaatgc aacccctttg ctccagagga.

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Presentazione sul tema: "Perché conoscere i metodi strutturali?. ....acccaa gaagtcagaa tcctcgaagc tgaagcctga ctgtaagctc tgcctcctac aactagacaa gtcacaatgc aacccctttg ctccagagga."— Transcript della presentazione:

1 Perché conoscere i metodi strutturali?

2 ....acccaa gaagtcagaa tcctcgaagc tgaagcctga ctgtaagctc tgcctcctac aactagacaa gtcacaatgc aacccctttg ctccagagga aaaggagtaa gcacagaggg cttctgagtc cggcaatgct ccatttcctg acaggagcat tttacagact tgcgtctgcc cctctgaggg... From: Prof. Anna Tramontano From genome to structure. From structure to function

3 Biomolecular Structures

4 New folds per year

5 NMR vs XRay

6 Molecule type Protein Protein-DNA complexes DNA RNA

7 Structural Tools Strumenti per la Biologia strutturale

8 The Nobel Prize in Physics 1952 "for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith Felix Bloch Edward Mills Purcell The Nobel Prize in Physics 1944 "for his resonance method for recording the magnetic properties of atomic nuclei" Isidor Isaac Rabi The Nobel Prize in Physics 1943 "for his contribution to the development of the molecular ray method and his discovery of the magnetic moment of the proton" Otto Stern

9 The Nobel Prize in Chemistry 1991 "for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy" Richard R. Ernst The Nobel Prize in Chemistry 2002 "for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution Kurt Wüthrich 1/2 of the prize

10 The Nobel Prize in Physics 2003 for pioneering contributions to the theory of superconductors Alexei A. AbrikosovVitaly L. Ginzburg 1/3 of the prize 1/3 of the prize The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2003 "for their discoveries concerning magnetic resonance imaging Paul C. Lauterbur Sir Peter Mansfield

11 Che cosa è uno spin

12 Che cosa è un momento angolare Il momento angolare o momento della quantità di moto o impulso angolare di un corpo rotante rispetto al centro attorno al quale gira (detto anche polo) è un'importante grandezza che caratterizza il moto circolare. Fisicamente è Il momento angolare è definito come il prodotto vettoriale tra il vettore posizione (rispetto alla stessa origine) e il vettore quantità di moto:L=r X mv Il modulo di è quindi definito da: L=rmv sin. La direzione di è perpendicolare al piano definito da r e da mv ; il verso è quello di un osservatore che vede ruotare in senso antiorario.

13

14 Che cosa è un momento angolare di spin Lo SPIN è una forma di momento angolare. A differenza del momento angolare classico, esso NON è prodotto dalla rotazione di un oggetto intorno ad un asse ma è una intrinseca proprietà delloggetto studiato. S= [S(S+1)] ½ h/2 Relazione tra spin e momento angolare di spin

15 Spin e momento angolare di spin [S(S+1)] ½ h/2 Ad una particella, dotata di spin S (dove S ha tipicamente valore ½) è associato un momento angolare di spin dato da Dove h/2 è una costante di proporzionalità chiamata costante di Planck h/2 1,054x Js -1 = ħ

16 Che cosa è un momento magnetico Il momento magnetico è un VETTORE che misura la capacità di un oggetto di interagire con i campi magnetici E= - B cos bussola Il Magnetismo si occupa si studiare le proprietà magnetiche delle sostanze, ovvero da che cosa dipende il momento magnetico m di una sostanza Minima energia quando il momento magnetico ed il campo magnetico sono paralleli

17 Che cosa è un momento magnetico di spin Ad ogni momento angolare di spin viene associato un momento magnetico di spin = - S Figure 2.5 Levitt La costante di proporzionalità tra il vettore momento angolare ed il vetore momento magnetico è detta RAPPORTO GIROMAGNETICO Il rapporto giromangetico è una proprietà intrinseca di ogni particella

18 Che cosa è un momento magnetico di spin = - S SPIN S=1/2 Momento angolare di spin Momento magnetico di spin S= [S(S+1)] ½ h/2

19 Che cosa è un momento magnetico di spin Ogni spin quindi si comporta come un piccolo ago di una bussola. Quando viene immerso in un campo magnetico, lui tende ad orientarsi lungo il campo magnetico in modo da assumere il minimo di energia E= - B cos S cos B

20 Quantizzazione Il concetto di spin è associato alla meccanica quantistica, ovvero alla fisica che descrive il comportamento dei sistemi con particelle infinitamente piccole ovvero non trattabili con le regole della fisica classica. In accordo alla meccanica quantistica, lenergia della interazione tra il momento magnetico di spin ed il campo magnetico non puo essere qualsiasi, ma puo assumere solo valori definiti NO

21 Quantizzazione Il concetto di spin è associato alla meccanica quantistica, ovvero alla fisica che descrive il comportamento dei sistemi con particelle infinitamente piccole ovvero non trattabili con le regole della fisica classica. In accordo alla meccanica quantistica, lenergia della interazione tra il momento magnetico di spin ed il campo magnetico non puo essere qualsiasi, ma puo assumere solo valori definiti E= - B cos S(S+1)] 1/2 ħ B cos E= ħ m B m=+1/2, -1/2

22 Quantizzazione Quindi, quando uno particella con uno spin S=1/2 è immersa in un campo magnetico, ci sono solo due valori di Energia possibili (permessi) E= - B cos S(S+1)] 1/2 ħ B cos E= ħ m B m=+1/2, -1/2 E= ħ B

23 Che cosa è una onda

24 Lunghezza donda = tratto corrispondente allintero ciclo di valori Frequenza = numero di volte per secondo in cui il vettore assume lintero ciclo di valori Hz c (m s -1 )/ (m)

25 Diffrazione della luce visibile da parte di un prisma e spettro della luce.

26 Spettro delle radiazioni elettromagnetiche by Andreas Kamlowski

27 Relazione fra energia e frequenza E = h h = costante di Plank 6.62 x J s E

28 Adesso cominciamo

29 Come è fatto un nucleo Isotopi, Isotopomeri Tabella periodica

30 Nota bene Un momento angolare di spin si indica generalmente con la lettera S Molto spesso quando si trattano argomenti di questo tipo, si usano due lettere distinte per distinguere uno momento angolare o un numero quantico di spin elettronico da uno di spin nucleare S I

31 Ripasso.Nuclidi Un nuclide è un atomo caratterizzato dal numero atomico Z (numero di protoni) e dal numero di massa A (numero di neutroni e di protoni). Il nuclide neutro ha un numero di elettroni uguale a quello di protoni. Il numero Z caratterizza la specie atomica. X A Z C 12 6 H 1 1 O 16 8

32 Proprietà magnetiche delle particelle subatomiche Ogni protone ed ogni neutrone possiede un numero quantico di spin I= +-1/2, in analogia alla situazione che voi già conoscete per gli elettroni. Tutti gli isotopi con un numero dispari di PROTONI O DI NEUTRONI nucleoni hanno un numero quantico di spin I0. Ad ogni nucleo sarà associato un numero quantico di spin nucleare che è la somma di tutti i numeri di spin dei nucleoni. Analogamente agli elettroni, i nucleoni tendono ad appaiare lo spin. Per i nucleoni piu pesanti, la regola di massimo appaiamento non è sempre verificata, per cui alcuni isotopi hanno numero quantico di spin >1/2. Alcuni nucleoni con numero di massa pari possiede I=1,2,3.. Mentre alcuni isotopi con numero di nucleoni dispari possiede I=3/2, 5/2, 7/2..

33 Livelli Energetici di spin nucleare p p pn nn I=1 I=0 I=2 I=1 I=0 I=1 I=0

34 Spin nucelare e nuclidi ProtoniNeutroniI paripari0 disparidispari1,2,3 paridispari½,3/2, 5/2, 7/2 disparipari½,3/2, 5/2, 7/2

35 NMR-active nuclei with different spin numbers I=0 I=1/2, 3/2, 5/2 I=1,2,3

36 Nuclei NMR-attivi Tutti i nuclidi con un numero quantico di spin nucleare I diverso da zero sono NMR attivi, Ovvero possono essere studiati via NMR Per i piu comuni studi NMR vengono utilizati solo quei nuclidi con spin nucleare I=1/2

37 NMR-active nuclei with different spin numbers 1 1 H, 2 1 H, 4 2 He, 12 6 C, 13 6 C, 14 7 N, 15 7 N, 16 8 O, 17 8 O, 19 9 F, Na, Al P, Cl, Fe

38 NMR-active nuclei with different spin numbers I=0 I=1/2, 3/2, 5/2 I=1,2,3 4 2 He, 12 6 C, 16 8 O, Fe 1 1 H, 13 6 C, 15 7 N, 17 8 O, 19 9 F, Na, Al P, Cl, 2 1 H, 14 7 N,

39 NMR-active nuclei with different spin numbers I=1/2 1 1 H, 13 6 C, P, 19 9 F, 15 7 N I=3/ Na Cl I=5/ O Al

40 Fine Lezione 1 15/03/2010

41 Isotopi C 12 6 C 14 6 Nuclidi con lo stesso Z ma differente A possono esistere e si chiamano isotopi. Una stessa specie atomica ha, di norma, diversi isotopi: si parla di miscela isotopica naturale. C 13 6

42 NMR e tabella periodica Su questa base, quasi tutti gli elementi avranno almeno 1 isotopo NMR attivo C 12 6 C 14 6 C ,9 %1,11 %tracce

43 Isotopi naturali di alcuni elementi NuclideMassa relativa% di nuclidi 1H1H 1, ,985 2H2H 2, ,015 3 He 3, ~ He 4, ~ Li 6, ,42 7 Li 7, ,58 9 Be 9, ~ Be 10, tracce 10 B 10, ,6 11 B 11, ,4 11 C 11, tracce 12 C 12, 98,89 13 C 13, ,11 14 C 14, tracce

44 Alcuni Isotopi e loro proprietà

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48 Momento Magnetico = I Ad un momento angolare di spin I è sempre associato un momento magnetico di spin Un momento magnetico può essere considerato come una piccola calamita. Come tale, se immersa in un campo magnetico, essa puo orientarsi in modo parallelo o antiparallelo al campo magnetico applicato esterno. B0B0

49 Momento Magnetico = I Ad un momento angolare di spin I è sempre associato un momento magnetico di spin Il rapporto giromagnetico è una costante di proporzionalità tra il numero quantico di spin ed il momento magnetico. In pratica, due nuclidi con stesso valore di I (es: 1 1 H e 13 6 C) hanno un diverso momento magnetico perché ogni nuclide ha un proprio valore di. B0B0

50 Rapporto giromagnetico E= ħ m B E= ħ B La separazione in energia dipende dal valore del rapporto giromagnetico

51 Lenergia della transizione NMR B0B0 E m=+1/2 m=-1/2 I due livelli energetici sono degeneri se B 0 =0 Il campo magnetico B 0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli

52 Lenergia della transizione NMR B0B0 E m=+1/2 m=-1/2 I due livelli energetici sono degeneri se B 0 =0 Il campo magnetico B 0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli

53 Come si distribuiscono gli spin nei vari livelli energetici? B0B0 B0B0 B0B0

54 Statistica di Boltzmann N up N low = e - E/kT N up - N low N up + N low = E/2kT ca La differenza di popolazione tra il livello fondamentale ed il livello eccitato è molto piccola D- Me ne importa qualcosa? R- ECCOME! La differenza di popolazione determina il numero di spin che effettivamente prendono parte alla transizione La differenza di popolazione dipende dalla differenza di energia tra i due livelli

55 Magnetizzazione osservabile B0B0

56 B0B0

57 B0B0

58 Fine lezione 2 marzo

59 Rapporto giromagnetico E= ħ m B E= ħ B La separazione in energia dipende dal valore del rapporto giromagnetico

60 Magnetizzazione osservabile B0B0

61 Momento Magnetico m=+1/2 m=-1/2 E=+1/2ħ B E=-1/2ħ B

62 Momento Magnetico Il momento magnetico non è un oggetto statico, ma puo essere descritto come una trottola, che possiede una certa velocità angolare, tipica di ogni spin

63 Momento Magnetico Lenergia di ogni spin è data, in termini fisici, dal prodotto scalare tra il campo magnetico applicato B 0 ed il momento magnetico della particella E=- B 0

64 Momento Magnetico Questo prodotto scalare dipende dallorientazione del momento magnetico rispetto a B0. Per effetto delle regole di quantizzazione dellenergia, esso dipende dal numero quantico di spin nucleare m, che puo essere +1/2 oppure -1/2 E=-mħ B

65 Momento Magnetico Questo prodotto scalare dipende dallorientazione del momento magnetico rispetto a B0. Per effetto delle regole di quantizzazione dellenergia, esso dipende dal numero quantico di spin nucleare m, che puo essere +1/2 oppure -1/2 E=-mħ B

66 Momento Magnetico m=+1/2 m=-1/2 E=+1/2ħ B E=-1/2ħ B

67 Momento Magnetico m=+1/2 m=-1/2 E=+1/2ħ B E=-1/2ħ B Stato fondamentale Più popolato Stato eccitato Meno popolato

68 B0B0 E = B 0 E = mB 0 :m = +½ +½ E ½ B 0 :m = ½ ½ E ½ B 0 Ogni momento magnetico precede intorno al campo magnetico statico B 0 Spin equivalenti precedono tutti con la stessa velocità 0 anche se ciascuno con una fase diversa equivalenti significa nuclidi di atomi identici CH3CH2OHCH3CH2OH La frequenza di precessione di Larmor

69 B0B0 M0M0 E = B 0 E = mB 0 :m = +½ +½ E ½ B 0 :m = ½ ½ E ½ B 0 M 0 = = M z M x = M y = 0 La frequenza di precessione di Larmor Poiche il numero dei momenti magnetici allineati con il campo magnetico é leggermente maggiore di quelli anti allineati la risultante é un vettore magnetizzazione M allineato lungo lasse z La differenza tra le due popolazioni é tanto maggiore quanto piu elevata e la differenza di energia tra i due livelli

70 B0B0 E = B 0 E = mB 0 :m = +½ +½ E ½ B 0 :m = ½ ½ E ½ B 0 E = B 0 = h La differenza di energia,(E -E ), dipende dal tipo di nucleo (ogni nuclide a un diverso valore di g) e dal campo magnetico applicato La differenza di energia é anche legata alla frequenza di precessione, ovvero alla velocità angolare con cui tutti I nuclidi equivalenti ruotano intorno a B0 La frequenza di precessione di Larmor

71 Il rapporto giromagnetico E= (h/2 )B 0 z = I z = (h/2 )m z Non tutti gli isotopi con I=1/2 hanno le stesse proprietà magnetiche Il momento magnetico è diverso per ogni isotopo e dipende dalla costante Tanto maggiore è, tanto piu alta sarà la differenza di energia tra i 2 livelli della transizione NMR. Ovvero tanto maggiore sarà la sensibilità dellesperimento

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73 Effetto di un campo magnetico su uno spin nucleare Mo

74 Effetto di un campo magnetico su uno spin nucleare E= -B bussola E= - mħ B quantizzazione E 2 - E 1 = E= - ħ B= h = B/2 Frequenza di risonanza di uno spin nucleare

75 Effetto di un campo magnetico su uno spin nucleare Se non applico un campo magnetico esterno non succede nulla Quando gli spin nucleare sono immersi in un cmpo magnetico, Ciascun spin assume una propria frequenza di risonanza che è tanto piu alta quanto maggiore è il campo magnetico applicato

76 Frequenze di risonanza

77 LEZIONE 2

78 Different Isotopes Absorb at Different Frequencies low frequencyhigh frequency 15 N 2H2H 13 C 19 F 1H1H 50 MHz 77 MHz 125 MHz 200 MHz 470 MHz 500 MHz 31 P

79 Rapporto giromagnetico E= ħ m B E= ħ B La separazione in energia dipende dal valore del rapporto giromagnetico

80 I parametri NMR Il chemical shift Le costanti di accoppiamento La intensità dei segnali

81 La frequenza di precessione di un determinato nucleo ad un determinato campo magnetico è detta FREQUENZA DI PRECESSIONE DI LARMOR Frequenza di precessione 0 = - B 0 /2π Se cosi fosse, ogni nucleo attivo entrerebbe in risonanza con il campo esterno alla sua frequenza e tutti gli isotopi uguali si comporterebbero allo stesso modo (un unico segnale). Es: al campo magnetico di 11.7 T, La FREQUENZA DI PRECESSIONE DI LARMOR del nuclide 1 H è 500 MHz.

82 La costante di schermo

83 Costante di schermo = Costante di schermo Dipende dallintorno elettronico

84 Chemical shift ref ref ppm Es: 1 = MHz 0 = MHz =1000 Hz = 1000/500.13x10 6 (ppm)= 2.0

85 Campi magnetici elevati determinano un aumento della risoluzione e della sensibilità

86 Chemical shift

87 Spettro 1 H NMR di Vanillina

88 750 MHz 1 H NMR Spettro di Tyrosine Kinase

89 1 H NMR Spettro di vari solventi

90 13 C NMR del Fullerene (C 60 )

91 Typical 1 H NMR Spectrum Absorbance

92 Spettro 1 H NMR di Citocromo c

93 TMS (Tetramethylsilane) chemical shift

94 Fattori che influenzano il chemical shift Caratteristiche funzionali Effetti attraverso lo spazio Effetti paramagnetici

95 Perché ogni spin 1 H ha una frequenza diversa? eff = (1- )B 0 CH3Cl CH3Br

96 Effetti induttivi

97 Effetto della Sostituzione sul Chemical Shift CHCl 3 CH 2 Cl 2 CH 3 Cl ppm -CH 2 -Br -CH 2 -CH 2 Br -CH 2 -CH 2 CH 2 Br ppm

98 Effetti Mesomeri

99 Competizione tra effetto mesomero ed effetto induttivo

100 Fattori che influenzano il chemical shift Caratteristiche funzionali Effetti attraverso lo spazio Effetti paramagnetici

101 Anisotropia di schermo indotta dai legami chimici

102 Correnti danello

103 0.42

104 Some paradigmatic examples

105 NMR in macromolecole biologiche

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111 The amount of shielding the nucleus experiences will vary with the density of the surrounding electron cloud If a 1 H nucleus is bound to a more electronegative atom e.g. N or O as opposed to C, the density of the electron cloud will be lower and it will be less shielded or deshielded. These considerations extend beyond what is directly bonded to the H atom as well. Simple shielding effects--electronegativity N H C H more electron withdrawing-- less shielded less electron withdrawing-- more shielded

112 less shielded higher resonance frequency more shielded lower resonance frequency amides (HN) aliphatic/alpha/beta etc.(HC) most HN nuclei come between 6-11 ppm while most HC nuclei come between -1 and 6 ppm. Simple shielding effects--electronegativity

113 One consequence of these effects is that aromatic protons, which are attached to aromatic rings, are deshielded relative to other HC protons. In fact, aromatic ring protons overlap with the amide (HN) region. aromatic region (6-8 ppm) amide region (7-10 ppm) More complex shielding effects: Aromatic protons

114 It should now be apparent to you that different types of proton in a protein will resonate at different frequencies based on simple chemical considerations. For instance, H protons will resonate in a region centered around the relatively high shift of 4.4 ppm, based on the fact that they are adjacent to a carbonyl and an amine group, both of which withdraw electron density. But not all H protons resonate at 4.4 ppm: They are dispersed as low as ~3 and as high as ~5.5. Why? H region

115 Average or random coil chemical shifts in proteins One reason for this dispersion is that the side chains of the 20 amino acids are different, and these differences will have some effect on the H shift. The table at right shows typical values observed for different protons in the 20 amino acids. These were measured in unstructured peptides to mimic the environment experienced by the proton averaged over essentially all possible conformations. These are sometimes called random coil shift values. Note that the H shifts range from ~4-4.8, but H shifts in proteins range from ~3 to 5.5. So this cannot entirely explain the observed dispersion.

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117 Amino acid structures and chemical shifts note: the shifts are somewhat different from the previous page because they are measured on the free amino acids, not on amino acids within peptides

118 Tabella 1 H chemical shift in peptidi e proteine

119 chemical shifts in proteins. Secondary structure Note that the H a shifts range from ~4-4.8, but H a shifts in proteins range from ~3 to 5.5. So this cannot entirely explain the observed dispersion.

120 A simple reason for the increased shift dispersion is that the environment experienced by 1 H nuclei in a folded protein (B) is not the same as in a unfolded, extended protein or random coil (A). shift of particular proton in folded protein influenced by groups nearby in space, conformation of the backbone, etc. Not averaged among many structures because there is only one folded structure. So, some protons in folded proteins will experience very particular environments and will stray far from the average. shift of particular proton in unfolded protein is averaged over many fluctuating structures will be near random coil value

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122 Example: shielding by aromatic side chains in folded proteins Picture shows the side chain packing in the hydrophobic core of a protein--the side chains are packed in a very specific manner, somewhat like a jigsaw puzzle a consequence of this packing is that some protons may be positioned within the shielding cone of an aromatic ring such as Phe 51. Such protons will exhibit unusually low resonance frequencies (see picture at left). Note that such effects depend upon precise positioning of side chains within folded proteins + + shielded methyl group methyl region of protein spectrum

123 poorly dispersed amides poorly dispersed aromatics poorly dispersed alphas poorly dispersed methyls very shielded methyl unfolded ubiquitin folded ubiquitin so you can tell if your protein is folded or not by looking at the 1D spectrum...

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126 What specifically to look for in a nicely folded protein notice aromatic/amide protons with shifts above 9 and below 7 notice alpha protons with shifts above 5 notice all these methyl peaks with chemical shifts around zero or even negative

127 Linewidths in 1D spectra: aggregation and conformational flexibility Linewidths get broader with larger particle size, due to faster transverse relaxation rates. Well learn the physical basis for the faster relaxation later. Broader than expected linewidths can indicate that the protein is aggregated. It can also indicate that the protein has conformational flexibility, i.e. that its structure is fluctuating between several slightly different forms. Well learn why this is when we cover the effect of protein dynamics on NMR spectra. Conformational flexibility also tends to reduce dispersion by averaging the environment experienced by a nucleus.

128 An example of analyzing linewidths and dispersion: Hill & DeGrado used measurements of chemical shift dispersion and line broadening in the methyl region of 1D spectra to gauge the effect of mutations at position 7 on the conformational flexibility of 2D protein leucine and valine mutants have poor dispersion and broad lines, despite being very stably folded and not aggregated (circular dichroism and analytical ultra- centrifugation measurements). These mutants are folded but flexible. Hill & DeGrado (2000) Structure 8:

129 Heteronuclei

130 13 C NMR The rules discussed for 1 H spins, (shielding and deshielding effects) hold also for 13 C spins. Some general features of 13 C should be pointed out: Unlike 1 H atoms, 13 C atoms may form a different number and type of chemical bonds. Therefore, the shielding/deshielding effects are much more effective. The chemical shift range of 13 C spins spans more than 200 ppm

131 Range of observed shifts for 13 C

132 A protein 13 C NMR spectrum (low resolution) Backbone CO and side chain COO- signals Aromatic signals Aliphatic

133 13 C NMR The rules discussed for 1 H spins, (shielding and deshielding effects) hold also for 13 C spins. Some general features of 13 C should be pointed out: The amino acid dependence of chemical shift values is stronger for 13 C atoms than in 1 H atoms. Therefore, each amino acid has an almost unique pattern of 13 C chemical shifts

134 13 C chemical shifts are residue- specific

135

136 13 C NMR The rules discussed for 1 H spins, (shielding and deshielding effects) hold also for 13 C spins. Some general features of 13 C should be pointed out: The chemical shift from secondary structure can be used to get the secondary structure arrangement directly from 13 C shifts of C, C and C spins

137 Fig. 1. Simulated 13 C chemical-shift distribution of ( a) Ala and (b) Met. () Strand; ( ) coil; ( ) helix.

138 13 C

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140 15 N: backbone and side chains

141

142 H2CH2C HS S CH 3 CysMet NHN His O OH O AspGlu HO Tyr CH 3 HO SerThr O NH 2 O AsnGln CH 2 H2CH2C HC CH 2 H2CH2C

143 Arg and Lys 15 N side chain resonances are difficult to be detected (around 60 and 30 ppm) Trp N at about 12 ppm in proton and 135 in 15 N

144 Arg side chain protonated (chloride salt)deprotonated water a DMSO b chloroform b water a DMSO b chloroform b terminal -NH 2 (av value) c internal -NH

145 His side chains NHN CH 2 N HN CH Tautomeric equilibrium

146 170 and 260 ppm arise from the protonated and nonprotonated nitrogens, respectively


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