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LA SIFILIDE He who knows syphilis knows medicine He who knows syphilis knows medicine Sir William Osler (1849-1919)

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1 LA SIFILIDE He who knows syphilis knows medicine He who knows syphilis knows medicine Sir William Osler ( )

2 La sifilide è una malattia infettiva trasmessa principalmente per via sessuale, causata dal Treponema pallidum subsp.pallidum, batterio mobile spiraliforme appartenente allOrdine Spirochetales, Famiglia Treponematacee. Il batterio filiforme, appare filamentoso ed avvolto a spirale e le sue Dimensioni in lunghezza sono nellordine di 5 mi- cron – 15 micron con un diametro trasverso tra 0,1 micron e 0,2 micron.

3 Si moltiplica per scissione semplice con divisione trasversale ed al contrario di molti consimili della sua famiglia, per le sue particolari esigenze nutritive e metaboliche, non può essere coltivato in vitro o meglio può esserlo solo per breve tempo con un massimo sopravvivenza di 7 giorni a 35°, in terreno particolarmente arricchito ed in presenza di CO2. Non sopravvivono più di 48 ore nel sangue da trasfondere conservato nelle emoteche. In azoto liquido mantengono la loro vitalità, mentre proliferano in maniera eccellente nei testicoli di coniglio.

4 Rothschild B.M. Existence of syphilis in a Pleistocene bear Nature. 335 (6191):595, 1988 Oct 13 Wright D.J. Syphilis and Neanderthal man Nature. 229 (5284):409, 1971 Feb 5 Una patologia che viene da lontano….. nel tempo?

5 …o nello spazio?

6 LA CLINICA

7 EVOLUZIONE NATURALE DELLA SIFILIDE Studio di Oslo 1404 pazienti non trattati seguiti dal 1890 al 1941 sifilide I ---> sifilide II | latenza ---> 25% recidive | < 2 anni | sifilide latente tardiva (sifilide III)

8 DEFINIZIONI Per uniformare la notificazione dei casi di sifilide lOMS già nel 1982 ha raccomandato di attenersi alla seguente classificazione: Per uniformare la notificazione dei casi di sifilide lOMS già nel 1982 ha raccomandato di attenersi alla seguente classificazione: a) infezioni primarie e secondarie b) infezioni latenti recenti ( <2 anni) c) infezioni latenti tardive (>2 anni) d) infezioni tardive sintomatiche e) infezioni connatali in soggetti con meno di due anni f) infezioni connatali in soggetti con due anni o più Si definisce sifilide latente recente uninfezione diagnosticata sierologicamente, la cui durata non oltrepassi i due anni; dopo due anni si definisce sifilide latente tardiva.

9 LATENZA Periodo di silenzio clinico caratterizzato dallassenza di lesioni e/o sintomi compreso tra: contagio e comparsa del sifiloma (1° latenza o incubazione) regressione delle lesioni primarie e comparsa delle eruzioni cutanee secondarie (2° latenza o recente) regressione delle eruzioni cutanee secondarie e comparsa delle manifestazioni terziarie cutanee e/o sistemiche (3° latenza o tardiva)

10 DIAGNOSI La diagnosi di sifilide si basa su: clinica - clinica anamnesi - anamnesi laboratorio - laboratorio Sarebbe un grave errore trascurare anche uno solo dei tre elementi

11 IL LABORATORIO NELLA SIFILIDE LOSSERVAZIONE DI UN ESSERE VIVENTE PUO AVVENIRE PER RICONOSCIMENTO DIRETTO…. O INDIRETTO….

12 IL LABORATORIO NELLA SIFILIDE DIAGNOSI DIRETTA Dimostrazione in sede di lesione della presenza del Treponema pallidum, indice certo di malattia DIAGNOSI INDIRETTA o SIEROLOGICA Dimostrazione degli anticorpi anti Treponema pallidum, indice di infezione

13 DIAGNOSI DIRETTA dimostrazione del Treponema pallidum 1905: Identificazione del Tp al microscopio ottico (Schaudinn F & Hoffmann E) 1907: Trasmissione del Tp dalluomo al testicolo di coniglio (Parodi U Giornale dellAccademia Medica di Torino 13:288;1907 ) 1909: Microscopia in campo oscuro (Coles) 1948: Rabbit Infectivity Test (Magnuson) 1964: Immunofluorescenza diretta (Yobs AR) 1990: PCR (Hay)

14 Diagnosi diretta del treponema Cross section of a spirochete PF=periplasmic flagell OS=outer sheath Treponema pallidum, IL Treponema pallidum, appartiene alla famiglia delle Treponematacee, batteri di forma elicoidale, mobili, a divisione trasversale. lunghezza variabile da 8 a 14 micron larghezza variabile da 0.15 a 0.20 micron. TEM x60.000

15 Treponema pallidum Microscopia elettronica al Scansione (SEM) Microscopia elettronica a scansione (SEM) Microscopia elettronica a trasmissione (TEM): spirocheta infiltrata nei tessuti

16 Struttura antigenica Un antigene polisaccaridico Un antigene lipidico Un antigene proteico Antigeni del corpo del treponema La conoscenza antigenica del treponema pallido ha consentito luso di metodi diagnostici diretti specie specifici (DFA-TP)

17 Trasmissione del Tp dalluomo al testicolo di coniglio Istopatologia: Treponema pallidum coltivato su testicolo di conoglio (whartin-Starry silver stain) Il treponema pallido non cresce in vitro ma può essere coltivato nel testicolo di coniglio e identificato su preparato istopatologico colorato con sali di argento

18 1909: Microscopia in campo oscuro Contrasto di fase: Questa tecnica si usa per evidenziare preparati trasparenti che non possono assorbire luce. Il preparato è reso visibile perchè viene contrastato con un'altra angolazione di luce e quindi canbiandogli il proprio indice di rifrazione. Campo oscuro: Viene inserito un disco opaco (chiamato stop) sul percorso della luce, cosicchè solo un cono vuoto di luce illumina il soggetto e permette la risoluzione di dettagli fini. Lilluminazione è obliqua e entra nellobiettivo solo se rifratta dalloggetto osservato, il fondo rimane scuro.

19 1909: Microscopia in campo oscuro (PARABOLOIDE) La microscopia in campo oscuro è il metodo più veloce e diretto per diagnosticare la sifilide primaria e secondaria. I campioni devono essere esaminati immediatamente dopo il prelievo da parte di personale addestrato al riconoscimento del Treponema pallidum.

20 1964: Immunofluorescenza diretta (DFA-TP) Limmunofluorescenza diretta mediante ab specifici (DFA-TP) può essere utilizzata per identipicare il T. pallidum. I vantaggi di questa tecnica rispetto alla microscopia in campo oscuro è che lo striscio non deve essere esaminato subito ed è specie specifico. Richiede tuttavia attezzature specifiche e personale con esperienza. anticorpo monoclonale fluorescente diretto verso lantigene lipoproteico di 47 kd. Courtesy of Sheila Lukehart

21 Il genoma del Treponema p. è stato completamente sequenziato Fraser CM, Norris SJ, et al: Science 1998 Jul 17;281(5375): Science 1998 Jul 17;281(5375): Il genoma di T. pallidum consiste di paia di basi e contiene 1041 predicted open reading frames (ORF)

22 BIOLOGIA MOLECOLARE La conoscenza della sequenza genomica e di alcune proteine specifiche da esso codificate ha consentito luso di indagini biomolecolari : PCR x gene codificante proteina 47Kd sensibilità spirochete PCR x DNApolimerasi I sensibilità spirochete RT-PCR sensibilità 1 spirocheta

23 Attendibilità diagnostica SENSIBILITÀ: amnios (100%), lesione mucose o cutanee esulcerate (96%), sangue (67%) liquor (60%) SPECIFICITÀ: lesione cutanea (96%), amnios e sangue(100%) LIMITI: Costi Incapacità distinguere TP vitali e tracce di TP morti Non indicato su liquor Tempi di esecuzione

24 PCR x gene codificante proteina immunogena di membrana 47Kd Zoechling N. et al 1997: PCR nested per il gene di una proteina di membrana immunogenica di 47 Kd----- banda 196 pb H S Jethwa et al. J Clin Microbiol January; 33(1): 180– banda 658pb Karina A. Orle Et al Multiplex PCR Haemophilus, Treponema (47KdProt.), Herpes. AMPLICOT Kit format (Roche Molecular system) colorimetric detection sistem

25 PCR x gene codificante DNA polymerase I. Liu HLiu H, Rodes B, Chen CY, Steiner B. New tests for syphilis: rational design of a PCR method for detection of Treponema pallidum in clinical specimens using unique regions of the DNA polymerase I gene. J Clin Microbiol May;39(5): Rodes BChen CYSteiner B agarose gel electrophoresis of polA PCR from serial dilutions of known concentrations of T. pallidum DNA extract. (A) Primer set I. The arrow indicates a 377- bp product. (B) Primer set II. The arrow indicates a 395-bp product. Lanes 1, 2 Sensibilità 95,8%; specificità 95.7%

26 N.L. Treponema pallidum Kit Estrazione mediante gel di silice Banda specifica per Treponema p. 273 pb Controllo interno 668pb Tempo di esecuzione: in giornata

27 N. L. Treponema pallidum Kit Estrazione mediante gel di silice amplificazione

28 N. L. Treponema pallidum Kit Banda specifica per Treponema p. 273 pb Controllo interno 668 pb 273 pb Treponema 668 pb Controllo interno

29 Treponema pallidum PCR casistica centro MST 1° Clinica Dermatologica Torino n. campioniPOSITIVINEGATIVI NO LUE 180 LUE I 44386* LUE II 13121** LUE SIEROLOGICA RECENTE 202 * 3 lesioni alla cervice uterina 3 solco balano-prepuziale ** roseola del tronco

30 Isolamento del Tp da lesioni muco-cutanee MICROSCOPIA IN CAMPO OSCURO sensibilità buona (80%) specificità buona operatore-dipendente risposta immediata labilità del campione economico adatto a qualsiasi laboratorio PCR sensibilità elevata (96%) specificità elevata operatore indipendente risposta in giornata invio dei campioni costo elevato laboratorio attrezzato

31 Indicazioni alla diagnosi diretta La dimostrazione del T. pallidum è raccomandata in: sifilide primaria sieronegativa sifilomi extragenitali (orale, anale) Sifiloma cervicale re-infezioni coinfezione con HIV Sifilide secondaria atipica E poco utile nelle forme secondarie e terziarie

32 DIAGNOSI SIEROLOGICA: dimostrazione di anticorpi anti T. pallidum Il riscontro di anticorpi anti T. pallidum indica solo una risposta immunitaria dellospite alla presenza del Treponema, presente o passata. Non esiste un unico test sierologico che fornisca informazioni certe sullo stadio della malattia. Solo lesecuzione di più test in contemporanea associati alla clinica ci può permettere di definire lesatto stadio.

33 DIAGNOSI SIEROLOGICA dimostrazione di anticorpi anti T. pallidum 1906:Reaz. di Wassermann 1946: Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) 1949: Treponema Pallidum Immobilisation (TPI) 1956: Rapid Plasmin Reagin (RPR) 1964: Fluorescence Treponemal Antibody-absorption (FTA-abs) 1965: Treponema Pallidum HemAgglutination (TPHA) 1975: ELISA 1988: Western Blot

34 CLASSIFICAZIONE DEI TEST NON-TREPONEMICI : VDRL (aspecifici) RPR Test TREPONEMICI : TPHA (specifici) FTA-abs ELISA/EIA Western Blot

35 Test NON-TREPONEMICI (VDRL, RPR) Questi test rivelano anticorpi IgG e IgM diretti contro lipidi di membrana del Treponema pallidum e contro lipidi serici presenti nellospite per il danneggiamento di membrane mitocondriali causato da diverse patologie. A questo scopo si utilizza la cardiolipina di bue che cross-reagisce con questi antigeni Pangborn MC. A new serologically active phospholipid from beef heart. Proc Soc Exp Biol Med. 1941;48:484. Harris, A., A. A. Rosenberg, and L. M. Riedel A microflocculation test for syphilis using cardiolipin antigen. Preliminary report. J. Ven. Dis. Inform. 27:

36 VDRL Harris, A., A. A. Rosenberg, and E. Del Vecchio The VDRL slide flocculation test for syphilis. II. A supplementary report. J. Ven. Dis. Inform. 29: V enereal D isease R esearch L aboratory. VDRL tests. In: Scheele L A., editor; Scheele L A., editor. Manual of serologic tests for syphilis. U.S. Washington, D.C: Government Printing Office; pp. 109–120. La VDRL ha soppiantato la reazione di fissazione del complemento, descritta per la prima volta da Wassermann, Neisser & Bruck, in 1906, conosciuta sotto il nome di reazione di Wassermann

37 VDRL Lantigene VDRL, che è una miscela di cardiolipina, lecitina e colesterolo, è la base di tutti i test non treponemici. Con varie modificazioni lantigene è stato stabilizzato per essere usato in altri test aggiungendo stabilizzatori e pigmenti: USR (unheated serum reagin test) con siero non scomplementato RPR (rapid plasma reagin test) con plasma non scomplementato TRUST (toluidine red unheated serum test) (TRUST) con siero non scomplementato e aggiunta di blu di toluidina. La velocità del test ha favorito lRPR, ma la VDRL rimane lunico test consigliato dalla FDA americana per diagnosticare la neurosifilide su liquor. Inoltre la VDRL rimane il test più economico e perciò è preferito nei laboratori con scarse disponibilità finanziarie (paesi poveri).

38 Antigene: cardiolipina di bue + lecitina + colesterolo VDRL anticorpi del paziente flocculazione

39 VDRL 4 agitazione 2 siero 3 reattivo 1 inattivazione complemento

40 VDRL POS VDRL VDRL NEG Tempo di esecuzione minuti 5 lettura

41 RPR e' un test non-treponemico di flocculazione per la determinazione qualitativa e semiquantitativa delle reagine (anticorpi) in siero o plasma Il test viene effettuato su siero o plasma. l'antigene è costituito da una sospensione colloidale di cardiolipina, lecitina e colesterolo miscelata a microparticelle di carbone. Quando un siero reattivo viene posto a contatto con l'antigene, si ha la formazione di una flocculazione macroscopica. RPR (Rapid Plasma Reagin) Portinoy J, Garson W, Smith Ca. Rapid plasma reagin test for syphilis. Public Health Rep Sep;72(9):761-6.

42 RPR RPR è una variazione della tecnica standard VDRL, ha analoga specificità e sensibilità lievemente diversa offre i seguenti vantaggi: Reagente pronto alluso Stabilità elevata Non è richiesta linattivazione del campione Può essere usato sia siero che plasma Lettura ad occhio nudo dei risultati. Svantaggi: non può essere usata su liquor

43 Test NON-TREPONEMICI (VDRL, RPR): pregi e difetti test quantitativi, se titolati follow-up alta sensibilità basso costo ed esecuzione semplice e rapida positivizzazione precoce (80% positivi nella Sifilide I) negativizzazione entro 2 anni dalla terapia variabilità dinterpretazione legata alloperatore fenomeno prozona bassa specificità (30% falsi positivi)

44 TEST TREPONEMICI (TPPA, FTA-ABS, ELISA, WB) test qualitativi (TPPA e FTA titolo) alta sensibilità (falsi neg eccezionali) buona specificità (rari falsi pos) positivizzazione variabile (IgM > FTA >TPPA) negativizzazione assente (o molto tardiva) costo variabile tempi più lunghi, laboratorio attrezzato

45 TPHA/TPPA TPHA (T. Pallidum HemAgglutination) TPPA (T. Pallidum Particle Agglutination) Il TPHA, ideato nel 1965 è stato recentemente sostituito dal TPPA, più sensibile e utilizza particelle di gelatina al posto di emazie di pollo o altri volatili

46 Particelle di gelatina particelle sensibilizzate antigeni treponemici particelle sensibilizzate anticorpi del paziente agglutinazione TPPA (T. Pallidum Particle Agglutination)

47 TPHA/TPPA 2 siero 3 particelle sensibilizzate e non 1 tampone sorbent 4 lettura Tempo di esecuzione: circa 2h30

48 TPHA/TPPA 2 siero titolazione

49 FTA (Fluorescent Treponemal Antibody) Deacon WE, Falcone VH & Harris A. Fluorescent Test for Treponemal Antibodies. Proc. Soc. Exper. Biol. & Med. 96: , 1957 FTA-abs Hunter Ef, Deacon We, Meyer Pe. An Improved Fta Test For Syphilis, The Absorption Procedure (Fta-abs). Public Health Rep May;79:410-2.

50 E il test storicamente usato per ldentificazione delle IgM (lue congenita), oggi affiancato da ELISA e WB FTA IgG e IgM

51 vetrino con Treponemi adesi FTA-abs anticorpi del paziente (siero adsorbito) rivelazione legame antigene - anticorpo anticorpi anti Ig umane Tempo di esecuzione 2h30 ore

52 ELISA/EIA test qualitativo rapido, di facile interpretazione ed automatizzato per la ricerca di Ig (G+M), IgG e IgM indicato per lo screening di grandi popolazioni a bassa prevalenza di sifilide (donatori, gravide, etc) I casi positivi devono essere confermati con un altro test sensibilità elevata - no fenomeno prozona specificità buona basso costo solo per grandi popolazioni

53 ELISA/EIA Tempo di esecuzione < 2 ore

54 WESTERN BLOT Test qualitativo utilizzato come test di conferma nei casi dubbi: sifilide congenita: ricerca IgM neurosifilide: esclusione di infezione in caso di negatività sensibilità buona: nella s. congenita (83-98% > FTA-abs) specificità alta : > TPHA > FTA-abs promettente per neurosifilide e treponematosi endemiche Tempo di esecuzione 1h30

55 Treponema pallidum immobilization (TPI o test di Nelson) Test altamente specifico Oggi in disuso Necessita di uno stabulario attrezzato per lallevamento dei conigli e le colture dei Treponemi Utilizzo di apposite celle per lesecuzione del test Gli anticorpi del paziente insieme al complemento immobilizzano i treponemi.

56 Il problema dei FALSI NEGATIVI e FALSI POSITIVI

57 REAZIONI FALSAMENTE NEGATIVE FENOMENO di PROZONA Falsa negatività della VDRL per un meccanismo competitivo dovuto all inibizione della agglutinazione per una eccessiva quantità di anticorpi circolanti (TPHA 1:5120) Si verifica in corso di: sifilide secondaria sifilide latente recente reinfezioni HIV+ Si evita titolando la VDRL negativa fino a 1/16 La diluizione va eseguita solo in caso di sospetto clinico

58 REAZIONI FALSAMENTE POSITIVE più frequenti nei test non treponemici (VDRL, RPR) titolo stabile e basso (VDRL< 1: 8) reazione falsamente positiva generalmente isolata identificabili con i test di conferma impossibilità a distinguere le treponematosi endemiche (Framboesia, Bejel, ecc) la reazione falsamente positiva può coesistere con cicatrice sierologica rilevabile solo dallanamnesi Molto frequenti (1% pop. generale, 30% tossicodipendenti) La discordanza coi test treponemici permette la diagnosi

59 POSITIVITA RISCONTRATE SU 400 SIERI CHE DIMOSTRAVANO F.R.P. ALLA VDRL (cortesia Dr. Panuccio Sanità pubblica Milano) n. campioni positivi % Anti-HCV (epatite C) 8922,3% RA TEST (artrite reumatoide) 5313,3% ASMA (anti muscolo liscio) 5213% Anti.HIV (AIDS) 4010% APCA (anti cellule parietali) 143,5% ANA (anti nucleo) 143,5% AMA (anti mitocondrio) 41% HbsAg (epatite B) ALTRE CAUSE 41% ,4%

60 TEST di CONFERMA necessario per Esclusione di test falsamente positivi VDRL TPHA, FTA-abs ELISA TPHA + VDRL TPHA FTA-abs, Western Blot ELISA IgM (neonato) WB- IgM Esclusione di test falsamente negativi fen. prozona: VDRL VDRL diluita, ELISA

61 APPLICAZIONE DEI TEST SCREENING: VDRL/RPR + TPHA ELISA (G+M) TEST di CONFERMA: TPHA FTA-abs (FTA-IgM x sifilide congenita) Western Blot FOLLOW-UP: VDRL titolata

62 SCREENING PER POPOLAZIONI banca del sangue ostetricia (gravide) reparti neuro-psichiatrici centro MST chirurgia durgenza espianto dorgano VDRL/TPPA test rapido: RPR o TPPA ELISA(G+M) VDRL/TPPA

63 Screening per la sifilide negli utenti asintomatici di un Centro MST VDRL / TPPA VDRL - / TPPA + anamnesi infezione pregressa posneg ELISA,WB FTA-abs ripetere TPPA > 15 gg infezione recente titolo VDRL VDRL + / TPPA - infezione pregressa 1:8 1:4 posneg infezione iniziale falso positivo neg VDRL + / TPPA + pos

64 INTREPRETAZIONE SIEROLOGIA

65 In caso di madre con sierologia positiva il siero neonatale sarà positivo per il passaggio transplacentare delle IgG materne ma non per le IgM Gli anticorpi materni si negativizzano < 6° mese: test non treponemici < 15° mese: test treponemici La diagnosi sierologica di sifilide neonatale si basa sulla dimostrazione delle IgM con FTA-abs, ELISA e Western Blot (golden-standard e test di conferma) IgM negative: assenza di infezione neonatale positivizzazione tardiva per infezione > VIII° mese ripetere test mensilmente per 3 mesi o trattare IgM positive: infezione neonatalepossibile falso positivo (Fatt. Reumatoide) conferma con WB SIERO NEONATALE IgG IgM

66 VALUTAZIONE DEL LIQUOR pleiocitosi 5 cell/cc proteinorrachia 40 mg/dl VDRL + (nel 50-70% dei casi) TPPA/FTA-abs [Western Blot ] Nelle forme recenti tutti i parametri sono alterati Nelle forme tardive i test anticorpali possono essere lunico parametro alterato

67 INTERPRETAZIONE dei test su liquor VDRLTPPA ++ NEUROSIFILIDE -+ Falso positivo, frequente +- Falso positivo, eccezionale -- No neurosifilide

68 Il Treponema pallidum….. sfuggente come le Cerastes del Sahara…


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