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Complessi di Coordinazione nelle Scienze Biomediche Biologia –Metalloproteine: proteine che contengono uno o più centri metallici necessari per la loro.

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1 Complessi di Coordinazione nelle Scienze Biomediche Biologia –Metalloproteine: proteine che contengono uno o più centri metallici necessari per la loro funzione Costituiscono circa il 25% delle proteine Trasporto ed immagazzinamento di ossigeno Trasferimento elettronico: riduzioni ossidazioni Enzimi: catalisi di reazioni biochimiche Medicina –Diversi farmaci sono costituiti da complessi metallici Cisplatino ed analoghi di nuova generazione

2 1.Tipi di sistemi di trasporto ed immagazzinamento 2.Struttura elettronica dei complessi di Fe(III) e Fe(II) 3.Mioglobina 4.Emoglobina Trasporto e immagazzinamento di ossigeno molecolare (diossigeno)

3 Sistemi di trasporto ed immagazzinamento di ossigeno molecolare Gli organismi multicellulari richiedono opportuni sistemi di trasporto e immagazzinamento dellossigeno molecolare. Sono noti tre sistemi di trasporto e tutti e tre impiegano metallo proteine di trasporto: emoglobina, emocianina, ed emeritrina. La emoglobina Hb è una ferroproteina presente nella maggior parte degli organismi animali La emocianina Hc è una cuproproteina (il biometallo è Cu) che si trova in diverse specie di artropodi e molluschi La emeritrina Hr è una ferroproteina non-eme presente in alcuni invertebrati marini. Lossigeno trasportato può essere immagazzinato in alcuni tessuti come quelli muscolari grazie a metalloproteine di immagazzinamento quali la mioglobina (Mb) che hanno centri metallici analoghi a quelli delle metalloproteine di trasporto corrispondenti (Hb).

4 Lemoglobina e la mioglobina contengono uno ione ferro coordinato da un gruppo eme (porfirina) che lega lO 2 Porfirina Ferro porfirina Heme Proteina Eme

5 CHIMICA DI COORDINAZIONE DEL FERRO Configurazione: [Ar] 3d 6 4s 2. Stati di ossidazione: -I, 0, +I, +II, +III, +IV, +V e +VI. Fe(II): è un sistema d 6 Fe(III): è un sistema d 5 Formano complessi con una gran varietà di leganti, quali ad esempio il [Fe(H 2 O) 6 ] 2+ o [Fe(H 2 O) 6 ] 3+ I complessi di Fe(III) in acqua possono dar luogo ad idrolisi: [Fe(H 2 O) 6 ] 3+ + H 2 O [Fe(OH)(H 2 O) 5 ] 2+ + H 3 O + Ka = 1, Lo stesso vale per i complessi di Fe(II) : [Fe(H 2 O) 6 ] 2+ + H 2 O [Fe(OH)(H 2 O) 5 ] + + H 3 O + Ka = 3, ma in misura molto minore

6 In un complesso ottaedrico lo ione Fe(II), d 6, può esistere negli stati ad alto e basso spin 0 E d x 2 -y 2 dz2dz2 d xz d xy d yz t 2g egeg basso spin (t 2g ) 6 0 E d x 2 -y 2 dz2dz2 d xz d xy d yz t 2g egeg alto spin (t 2g ) 4 (e g ) 2 Paramagnetico con 4 elettroni spaiati, S=2 Diamagnetico, S=0

7 In un complesso ottaedrico lo ione Fe(III), d 5, può esistere negli stati ad alto e basso spin 0 E d x 2 -y 2 dz2dz2 d xz d xy d yz t 2g egeg basso spin (t 2g ) 5 0 E d x 2 -y 2 dz2dz2 d xz d xy d yz t 2g egeg alto spin (t 2g ) 3 (e g ) 2 Paramagnetico con 5 elettroni spaiati, S=5/2 Paramagnetico con 1 elettrone spaiato, S=1/2

8 Passando da un complesso ottaedrico ad uno piramidale e a uno quadrato planare, le energie degli orbitali d cambiano: gli orbitali con componente z si abbassano in energia E dz2dz2 d xz d xy d yz d x 2 -y 2 dz2dz2 d xz d xy d yz d x 2 -y 2 d xy d xz dz2dz2 d yz n n n n n geometria ottaedrica geometria piramidale geometria quadrato-planare

9 Complessi dellO 2 La molecola O 2 può interagire con alcuni complessi di coordinazione per dare addotti, in cui lunità dinucleare O 2 viene conservata e, apparentemente, il metallo non cambia stato di ossidazione: n [ML m ] + O 2 [ML m ] n (O 2 ) Il primo esempio (Vaska, 1963) è il complesso [Ir(O 2 )Cl(CO)(PPh 3 ) 2 ] Dal punto di vista strutturale i complessi di O 2 possono essere divisi in mono-, di-, fino a tetra-nucleari. Si distinguono inoltre in terminali o mono dentati ( 1 ) e laterali o bi dentati ( 2 ).

10 6x2=12 elettroni di valenza ord. di legame=(84)/2=2 paramagnetica 2p E 2s 2p Struttura elettronica della molecola O 2

11 2p * 2p O 2 O 2 - O 2 2- La molecola di O 2 può acquistare uno o due elettroni formando gli ioni superossido O 2 - e perossido O 2 2- come in KO 2 e Na 2 O 2 Loccupazione da parte di uno o due elettroni in più dellorbitale antilegante 2p * porta alla riduzione dellordine di legame La distanza di legame O-O aumenta quindi nellordine: O 2 ossigeno o.l. = 2 2 el. spaiati O 2 - superossidi o.l. = el. spaiati O 2 -2 perossidi o.l. = 1 diamagnetico Parallellamante si osserva una riduzione della frequenza di stiramento (stretching) del legame O-O nello spettro IR

12 Addotti metallo-diossigeno Gli addotti M-O 2 possono essere caratterizzati dalla frequenza di stiramento del legame O-O nello spettro IR e la distanza interatomica O-O, che indicano la situazione elettronica del diossigeno coordinato. Si parla quindi di: Complessi tipo superossido quando tali parametri si avvicinano a quelli dello ione superossido ( O-O = 1145 cm 1 e d = 1,33 Å, in KO 2 ) Complessi di tipo perossido quando i parametri sono vicini a quelli dello ione perossido, O-O = 738 cm 1 e d = 1,49 Å, in Na 2 O 2 ). I complessi mononucleari terminali 1 hanno O-O = cm 1 e d O-O = 1,25-1,35 Å, e sono quindi di tipo superossido I complessi mononucleari laterali 2 hanno O-O = cm 1 e d O-O = 1,30-1,35 Å, e sono quindi di tipo perossido In O 2 la distanza internucleare è Å

13 Natura del legame ferro-diossigeno Il legame fra il metallo e lO 2 può essere descritto dalla combinazione lineare fra gli orbitali del frammento di tipo [Fe II L 5 ] a geometria piramidale a base quadrata con gli orbitali della molecola di O 2 (di energia e simmetria appropriate) che si coordina al ferro occupando la sesta posizione di coordinazione completando così un contorno ottaedrico. Se la molecola O 2 viene orientata nel piano yz, gli orbitali di simmetria appropriata che essa utilizza sono quelli 2p *, semioccupati, che si combinano con gli orbitali d yz e d z 2.

14 Schema degli orbitali molecolari in Fe II L 5 -O 2 I due MO di legame pieni (d z 2- * ) e (d xz - * ) ricevono maggior contributo da quelli della molecola O 2, suggerendo una polarizzazione del legame Fe + -O 2 e quindi una ossidazione parziale del Fe(II). Questo accumulo di carica parziale negativa sul legante O 2 spiega le caratteristiche tipo superossido di questo tipo di complesso Al limite, il ferro può trasferire totalmente lelettrone passando a Fe(III) e dando origine a un vero ione O 2 Si noti che lo ione Fe(II) è ad alto spin mentre il complesso finale ha tutti gli elettroni appaiati ed è quindi diamagnetico

15 Mioglobina (Mb) E una metalloproteina monomera che ha la funzione di immagazzinare O 2 nei tessuti muscolari dei vertebrati. Ciascuna molecola di Mb può legare una molecola di O 2 : - nella forma deossigenata è denominata deossiMb - quando contiene O 2 è denominata ossiMb. Entrambe le forme devono essere distinte dalla forma metaMb, (metamioglobina), che riguarda una mioglobina che è stata ossidata e contiene pertanto Fe(III) e non è capace di legare diossigeno La molecola ha MM di circa 17,8 kDa. La sua struttura fu risolta per diffrazione di raggi X (1960) lavorando con un campione di sperma di balena. La molecola è formata da una catena polipeptidica chiamata globina, costituita da 153 residui aminoacidici che sono disposti in 8 eliche, (identificate con le lettere comprese fra A e H) e in 7 segmenti di congiunzione fra le eliche anse (p. es. l ansa AB unisce le eliche A e B).

16 Struttura della deossimioglobina La catena proteica si lega, per mezzo di un atomo N di un anello imidazolico di un residuo istidinico (la cosiddetta istidina prossimale, F8 = His-93), a un atomo di Fe(II) che è già coordinato da 4 atomi di N dellanello porfirinico della protoporfirina o heme Struttura della mioglobina con in evidenza il gruppo Fe II -porfirina e le istidine prossimale (F8 = His-93) e distale (E7 = His-64) istidina

17 Struttura della deossimioglobina

18 Protoporfirina IX e il gruppo eme Lanello profirinico presente nella Mioglobina ed in altri metalloenzimi è noto come protoporfirina IX Il corrispondente complesso con il ferro(II) è denominato Fe-protoporfirina IX o anche gruppo eme Protoporfirina IX Fe-protoporfirina IX o eme

19 Lo scheletro ciclico aromatico di 24 atomi dellanione porfirinato delimita una cavità centrale che è adatta ad coordinare cationi metallici di dimensioni compatibili con distanze di legame N p -M di 2,04 Å, anche se lanello è flessibile e permette legami stabili leggermente più lunghi o più corti. Tale cavità risulta particolarmente adatta ad alloggiare Fe(II) a basso spin, Fe(III) a basso spin, Co(II) o Co(III) Nella struttura della deossimioglobina è presente un altro anello imidazolico che fa parte di una istidina situata nella elica E (istidina distale, E7 = His-64), che non è legato al metallo, ma è in prossimità della sesta posizione di coordinazione del ferro, quella occupata dalla molecola di diossigeno nella forma ossiMb. Nella deossiMb il Fe è pentacoordinato; essendo ad alto spin e quindi più grande della cavità lo ione Fe(II) non riesce a coordinarsi nel piano della della protoporfirina IX, ma fuoriesce di circa 0,6 Å verso lazoto imidazolico della istidina prossimale. Aspetti strutturali della deossimioglobina

20 Ossimioglobina Legandosi a O 2 per dare la forma ossiMb, il ferro si sposta verso il piano del macrociclo. Si ottiene un complesso di diossigeno terminale, con un angolo Fe-O-O di 115°. Nella deossiMb lo ione Fe(II) è in uno stato fondamentale ad alto spin con 4 elettroni spaiati Quando viene legato il diossigeno, lo stato di ossidazione del metallo è più ambiguo a causa di possibili trasferimenti elettronici fra ossigeno e centro metallico Sono stati ipotizzati due modelli: (i) uno in cui si assume un parziale trasferimento elettronico dal metallo al legante per formare Fe(III) e O 2 (superossido); (ii) uno in cui si assume che lo ione resti Fe(II) ma passi in uno stato di basso spin per laumento di campo cristallino

21 Ossimioglobina Nella deossiMb lo ione Fe(II) è in uno stato fondamentale ad alto spin con 4 elettroni spaiati: la forma deossi è pertanto paramanetica con S=2 Quando viene legato il diossigeno, la forma ossi è diamagnetica e, se si considera il metallo ancora nello stato di ossidazione (II), si può parlare che nella ossiMb lo ione Fe(II) sia a basso spin con S=0 (diamagnetico) Ciò riduce la dimensione effettiva dello ione e, di conseguenza, ne permette lo spostamento verso la cavità della porfirina trascinando la istidina prossima ad esso mentre il macrociclo recupera approssimativamente la sua forma piana. E d x 2 -y 2 dz2dz2 d xz d xy d yz

22 In altre parole, il legame di O 2 con Fe induce un cambiamento della coordinazione (da penta- a esa-coordinato) e di stato di spin del metallo (HS LS). Questo determina una diminuzione delle dimensioni del metallo e quindi un suo migliore assestamento nellanello porfirinico. Lo ione Fe(II) spostandosi verso lanello porfirinico tira con se listidina prossimale ad esso coordinata e ciò comporta un lieve aggiustamento della struttura terziaria della globina, uno spostamento dellelica F a cui listidina è ancorata, che non ha però alcuna conseguenza funzionale

23 Nella proteina alcuni residui amminoacidici sono in prossimità del centro metallico. In particolare istidina distale (His-64) chiude una angusta tasca idrofobica che è anche delimitata da un residuo Valina ed uno Fenilalanina Lanalisi ai raggi-X dimostra che His-64 può bloccare lentrata in questa tasca e pertanto O 2 non può accedere ad essa a meno che la istidina distale si muova verso lesterno, lasciandogli il passaggio grazie alla flessibilità della globina. L O 2 che penetra nella tasca idrofobica oltre a coordinarsi al Fe interagisce con la istidina distale attraverso un legame a idrogeno che coinvolge il gruppo N-H. Questo legame idrogeno stabilizza ulteriormente lunione di O 2 al metallo. Ruolo della proteina nelle funzioni biologiche della Mb. hh

24 Listidina-64 ha lulteriore funzione di rendere difficile lentrata di altri substrati capaci di legarsi al Fe occupando il posto dellO 2 (es. CO). In particolare il monossido di carbonio è prodotto in modo naturale nel corso della degradazione metabolica dei gruppi eme e per questo può essere un legante competitivo in sistemi biologici. La sua affinità per i gruppi eme, quando questi sono liberi in soluzione acquosa, è circa volte più grande di quella di O 2. Tuttavia i gruppi eme di Mb (e di Hb) legano il CO soltanto circa 250 volte più fortemente che lO 2. Leffetto discriminante della proteina è stato messo in relazione con ragioni steriche. Nella carbossimioglobina (complesso con CO), per permettere la formazione di un legame quasi lineare (Fe-C-O devia dalla linearità soltanto di 6-9°), la proteina deve spostare qualcuno dei suoi residui aminoacidici implicando una spesa addizionale di energia e, pertanto, un effetto di discriminazione positiva a favore dellO 2 che non ha bisogno di questi spostamenti. Coordinazione del CO

25 Infatti: O 2 adotta una geometria piegata piuttosto che lineare, preferita da CO (ibrido sp 2 in O 2, sp in CO). O 2 legato è stabilizzato da legami H con la His distale, mentre la coordinazione di CO è inibita dallingombro sterico di residui aa in prossimità del metallo

26 Ruolo della globina e ossidazione delle Fe-porfirine La globina ha un altro ruolo: impedire che Mb si ossidi irreversibilmente a metaMb con formazione dellanione superossido. O 2 è un potente ossidante e dovrebbe reagire facilmente con la forma ridotta delleme. Perciò la stabilità dei complessi eme-O 2 nelle proteine deve essere attribuita a fattori cinetici e non termodinamici. Infatti i complessi porfirinici di Fe(II) liberi si ossidano facilmente in soluzione acquosa, probabilmente con il seguente meccanismo: Fe(II) + O 2 Fe(II)O 2 Fe(II)O 2 + Fe(II) Fe(III)-O-O- Fe(III) dove O-O rappresenta la forma perossido. In più, il dimero - perossido può essere a sua volta trasformato in un dimero -ossido attraverso lintermedio Fe IV =O.

27 Lossidazione irreversibile di Fe(II) a Fe(III) è prevenuta se esistono barriere strutturali che inibiscono la riduzione bi-elettronica di O 2, come dimostrato da Collman per modelli puramente inorganici (1974).

28 Emoglobina (Hb) La emoglobina (Hb) è una molecola più complessa della Mb. Nei mammiferi è formata da quattro subunità ( 1, 2, 1, 2 ), ciascuna contenente un gruppo eme. Dal punto di vista strutturale ciascuna delle quattro subunità somiglia a una molecola Mb Le subunità di tipo sono costituite da 141 residui mentre quelle di tipo da 146 e la molecola ha in totale un P M di 64,5 kDa circa il quadruplo della Mb. Le subunità 1, 2, 1, 2 sono disposte attorno a una cavità centrale occupata da molecole di acqua. Ciascuna di esse è unita alle altre tramite interazioni elettro statiche (ponti salini) che legano più strettamente due dimeri 1 1 e 2 2

29 Heme Struttura dellemoglobina

30 Deossiemoglobina e ossiemoglobina Poiché lemoglobina contiene quattro subunità, ciascuna con un gruppo eme e quindi uno ione Fe(II), essa può legare fino quattro molecole di O 2. Lossigenazione dellemoglobina altera la struttura di tutta la proteina: LHb può esistere in due conformazioni distinte note come stati T(deossi Hb) e R(ossiHb) che differiscono per la struttura quaternaria cioè per la disposizione delle quattro subunità 1, 2, 1 e 2 Le differenze fra i due stati sono così grandi che i cristalli di deossiHb possono spaccarsi quando assorbono ossigeno e si trasformano in ossiHb La transizione da stato T a R avviene in seguito allassorbimento di una o più molecole di O 2 ed è innescata dallo spostamento dello ione Fe(II) verso lanello porfirinico che tira con se listidina prossimale con un conseguente aggiustamento della struttura terziaria della globina (in particolare dell elica F a cui listidina è ancorata). Questo aggiustamento allinterno di ogni singola subunità, seppur lieve, comporta la rottura di una serie di ponti salini (interazioni elettrostatiche) fra le quattro subunità stesse. Poiché queste interazioni determinano la struttura quaternaria dellemoglobina, questa viene a subire una significativa alterazione conformazionale.

31 Variazione strutturale a livello di eme Spostamento dellistidina prossimale e dellelica F La coordinazione dellO 2 provoca lo spostamento verso lanello porfirinico dello ione Fe(II) che tira con se listidina prossimale con un conseguente aggiustamento della struttura terziaria della globina e in particolare dell elica F a cui listidina è ancorata. Piano della porfirina elica F deossi ossi

32 Passando dallo stato T (deossi) a quello R (ossi) si hanno le seguenti variazioni della struttura quaternaria: - le catene si avvicinano di circa 0.8 Å - il dimero 1 1 ruota, come unità rigida, di 15° rispetto al dimero i contatti tra le subunità alle interfacce 1 2 e 2 1 si spostano T R

33 Effetto cooperativo La transizione dellemoglobina dallo stato T a quello R avviene gradualmente quando i gruppi heme delle sue quattro subunità hanno coordinato da una a tre molecole di ossigeno. Lo stato R ha una maggiore affinità della forma T verso lO 2. Di conseguenza, la coordinazione di una molecola di O 2 ad una sub unità dellemoglobina favorisce la coordinazione di una seconda molecola di O 2 ad unaltra subunità e così via fino allassorbimento di quattro molecole di O 2. Tale effetto è noto come cooperativo. ….. 1 O2O2 2 O2O2 O2O O2O2

34 Il trasporto dellossigeno Nel sangue la solubilità dellO 2 è molto maggiore che in acqua: - In acqua la solubilità è 6.6 cm 3 in 1 dm 3 a 293 K e 1 atm ovvero di 3 x M - Nel sangue, nelle stesse condizioni di T e P, la solubilità sale a 200 cm 3 cioè 9 x M Questo è leffetto della coordinazione dellossigeno alle molecole di emoglobina presenti nei globuli rossi. Lassorbimento dellossigeno da parte dellemoglobina o della mioglobina viene usualmente descritto da curve di ossigenazione in cui si riporta la frazione di proteina ossigenata in funzione della pressione parziale dellossigeno. In queste curve il 100% corrisponde alla saturazione, cioè allassorbimento di una molecola di O 2 da parte di tutte le molecole di mioglobina o di quattro molecole di O 2 da parte di tutte le molecole di emoglobina.

35 Comportamento della mioglobina Nel caso della mioglobina in cui i siti di legame al centro metallico M dei gruppi eme a cui si coordinano le molecole di O 2 sono indipendenti, la reazione può essere descritta dallequilibrio: M + O 2 MO 2 K p = [MO 2 ]/[M]P(O 2 ) Se chiamiamo la frazione di M ossi genata, si ricava facilmente che in funzione della P(O 2 ) segue una funzione iperbolica: = [MO 2 ]/([M]+[MO 2 ]) = Kp·P(O 2 )/ [1+ Kp·P(O 2 )] E conveniente esprimere laffinità di M per O 2 come la pressione parziale di O 2 necessaria per saturare il 50% della specie M, P 1/2 (O 2 ). In tali condizioni, [M]= [MO 2 ], ottenendo: P 1/2 (O 2 ) = 1/K p

36 Comportamento della emoglobina Il comportamento fisiologico della emoglobina (Hb) è diversa da quello della mioglobina. La curva di ossigenazione di Hb ha una forma sigmoidale invece della forma iperbolica che si osserva per Mb (curva b a pH fisiologico di 7.2) Questa forma indica che le 4 subunità non si comportano come una semplice somma di 4 Mb, ma che esse presentano un effetto cooperativo quando legano progressivamente le quattro molecole di O 2. Così, le due prime subunità vengono ossigenate peggio della Mb, ma le ultime due mostrano praticamente la stessa affinità per O 2 di Mb.

37 Sistema emoglobina-mioglobina Nei polmoni la P(O 2 ) è circa tre volte maggiore che nei tessuti ( contro mmHg) Nei polmoni, dove ci sono elevate pressioni di O 2, lHb assorbe efficentemente lO 2 venendo praticamente saturata Nei tessuti, dove le pressioni di O 2 sono basse, Hb è meno efficiente di Mb e rilascia lO 2 alla Mb che mantiene il 90% della saturazione Emoglobina trasporto di O 2 Mioglobina immagazzinamento O 2

38 Laffinità della Hb per O 2 viene diminuita da conc. crescenti di H +, Cl -, CO 2 e 2,3-D-difosfoglicerato (DPG). La cavità centrale della deossiHb contiene un certo numero di leganti positivi ai quali DPG può legarsi. Poiché il cambiamento di conformazione conseguente alla ossigenazione rompe questi siti di interazione, DPF stabilizza la forma deossi (inibendo perciò la coordinazione di O 2 )

39 Laffinità per lO 2 diminuisce inoltre al diminuire del pH e si ha un abbassa mento della curva di ossigenazione (pH=7.2 curva b, pH=6.8 curva c) Ciò è dovuto al fatto che la transizione fra stato T ed R che è responsabile dellaumento di affinità per lO 2 allaumentare della frazione di Hb ossigenata (effetto cooperativo) è inibito dagli ioni H + in quanto essi protonano alcuni anioni responsabili di ponti salini che stabilizzano lo stato R


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