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I NEUROTRASPORTATORI Liberazione del neurotrasmettitore nello spazio sinaptico Attivazione dei recettori (pre-/post-sinaptici) RIMOZIONE NEUROTRASMETTITORE.

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1 I NEUROTRASPORTATORI Liberazione del neurotrasmettitore nello spazio sinaptico Attivazione dei recettori (pre-/post-sinaptici) RIMOZIONE NEUROTRASMETTITORE Degradazione Enzimatica Trasporto all’interno del terminale nervoso (re-uptake o ricaptazione) o delle cellule gliali (x GABA, Glu e 5-HT) ~50%

2 Nel citoplasma il neurotrasportatore può: Essere metabolizzato da E intracellulari (es: MAO) Essere trasportato nelle VESCICOLE sinaptiche [Nt] intravescicolare ~ × [Nt] citoplasmatica Il trasporto è mediato da un trasportatore specifico delle vescicole che utilizza come energia per il trasporto il gradiente elettrochimico di ioni H + generato da una pompa di protoni (ATPasi) localizzata sulla membrana delle vescicole. ATP ADP+Pi H+H+ H + CA H + CA I neurotrasmettitori sono trasportati contro il loro gradiente di concentrazione. L’energia necessaria per il trasporto deriva dall’elevato gradiente di concentrazione del Na +. Il Na+ è co-trasportato con il trasmettitore Terminazione noradrenergica Terminazione colinergica Ch+Na + Ch +AcCoA ACh acetato NA+Na + NA Nelle vescicole le CA sono legate a cromogranine acide, ATP (4), Ca 2+ e Mg 2+

3 Sulla base della struttura molecolare, della distribuzione cellulare e delle proprietà farmacologiche, i neurotrasportatori si classificano in TRE FAMIGLIE:

4 MECCANISMO D’AZIONE DEI NEUROTRASPORTATORI MODELLO CLASSICO A “PORTA GIREVOLE”: Due stati conformazionaliEsposizione del sito di legame per il nt verso l’esterno o l’interno della membrana V REST : alte [Na + ] ext e [Cl - ] ext => Legame di ioni e nt sui siti rivolti verso l’esterno della membrana => modificazione conformazionale del trasportatore => traslocazione del nt e degli ioni attraverso la membrana con conseguente distacco di Na + e Cl - a livello intracellulare => ↓ affinità del trasportatore per il nt => rilascio di nt nella cellula. MODELLO A CANALE: 12 TM → delimitano il poro Domini intra- ed extra-cellulari → regolano il legame e la traslocazione di nt e ioni Tale modello prevede il passaggio di 2 ioni Na + x ogni molecola di nt Tuttavia, mediante la tecnica del pach clamp, è stato osservato che: 1)per ogni molecola di nt passano centinaia di ioni Na + 2)il Na + viene trasportato anche in assenza del nt TRE STATI CONFORMAZIONALI: 1) R: a riposo (inattivo) 2) T (trasporto di nt e ioni secondo una precisa stechiometria) 3) C (canale: il trasporto degli ioni è disaccoppiato da quello del nt => lieve depolarizzazione cellulare)

5 I TRASPORTATORI Na + /K + DIPENDENTI Trasportano gli aa eccitatori: Glu e Asp L’energia è fornita dal gradiente elettrochimico di Na + e K + a cavallo della membrana plasmatica. Dopo liberazione il Glu viene rimosso dallo spazio sinaptico in meno di 1 msec! Il funzionamento del trasportatore è strettamente dipendente dalle concentrazioni ioniche: ↑ [K + ] ext ↓ [Na + ] ext => Il blocco del trasportatore nelle aree ischemiche potrebbe limitare il danno neuronale provocato dall’aumento dei livelli extracellulari di glutammato Il trasportatore può funzionare al contrario => ↑ la liberazione del Glu dalle terminazioni nervose (es: prolungata stimolazione ad alta frequenza dei terminali nervosi, anossia o inibizione della Na + /K + ATPasi) i o Glu 2Na + Flusso netto di cationi depolarizzante K + OH - o HCO 3 - ↓pH intracellulare i o GluT K+K+ K+K+ ↑ Glu  NMDA => morte neuronale Glu Condizioni fisiologiche Anossia, ipossia, ischemia

6 Il processo di trasporto del Glu è bifasico: (effetto “tampone”). FASE I (molto rapida): il trasportatore lega il Glu (effetto “tampone”). FASE II (+ lenta): traslocazione del Glu nel citoplasma neuronale o gliale. L’elevata efficacia di questo meccanismo mantiene la [Glu] ext fisiologica ( 3 μM). Alterazioni funzionali degli EAAT sono probabilmente coinvolte nella patogenesi delle lesioni eccitotossiche che si verificano nelle malattie cerebrovascolari e neurodegenerative (es: SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA e ISCHEMIA).

7 Nell’uomo: EAAT 2 → predomina nel SNC EAAT 5 → nei neuroni della retina INIBITORI EAAT S : La maggior parte: derivati flessibili di Glu e Asp SUBSTRATI → inibiscono competitivamente il trasporto del nt 2 TIPI NON SUBSTRATI → bloccano il trasportatore Scarsa selettività dovuta all’elevata flessibilità molecolare DL-TB Z OA = (β-threo-benzilossi-Asp) → Bloccante non-substrato di EEAT1 e 2. E’ il più potente inibitore di EAAT2 oggi noto (2S, 4R)-4 metil-glutammato → Inibitore-substrato selettivo per EAAT1 NB= Alla famiglia dei trasportatori per gli EAA appartengono anche i trasportatori per gli aa neutri (ASCT1 e ASCT2) (~ STRUTTURA)

8 Organizzazione molecolare dei trasportatori Na + /K + dipendenti TM 1 →TM 6 = 6 segmenti idrofobici ad α-elica localizzati nel dominio N-terminale. = 6 brevi regioni idrofobiche localizzate nel dominio C-terminale (? segmenti transmembranari ad α-elica?) Tyr-450 Arg-479 N   2 siti di N-glicosilazione C Legame con la forma anionica dell’acido L- glutammico

9 I TRASPORTATORI Na + /Cl - DIPENDENTI A questa classe appartengono i trasportatori per: GABA (GAT1 → 4) MONOAMINE (NET, DAT, SERT) GLICINA, TAURINA, PROLINA COLINA L’affinità per il nt è positivamente modulata dalla concentrazione locale degli ioni Na + e Cl - SIMPORTI: Utilizzano l’energia del gradiente per il Na + prodotto dalla Na + /K + ATPasi Alta efficienza nel trasporto = ∆ conc ~ X I trasportatori per le monoamine presentano una elevata omologia della sequenza aa-cidica (69-80%) i o nt 1-3 Na + 1 Cl - ORGANIZZAZIONE MOLECOLARE 12 segmenti TM N- e C- terminali intracellulari Lunga ansa extracellulare fra TM3 e TM4 → presenta siti di glicosilazione → motivo più variabile (specificità di substrato?)

10 I neurotrasportatori di membrana per il GABA Il meccanismo di ricaptazione del GABA è Na + -dipendente ed è mediato da neurotrasportatori localizzati in: TERMINAZIONI NERVOSE (Θ Ac. Nipecotico e L-DABA) CELLULE GLIALI (Θ β-alanina) Struttura rGAT 1/2/3 : 12 TM C- e N- terminali intracellulari Siti di P-azione (PK Ca 2+ -CaM-dipendenti) sulle anse intracellulari rGAT 1/2/3 → hanno elevata affinità per il GABA (k m ~10μM) rBGT → ha > affinità per la betaina GAT 1 → Predomina nei neuroni GABAergici E’ anche presente nei neuroni Glu-ergici post-sinaptici e negli astrociti corticali rGAT 3 → Prevalentemente gliale

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12 Proprietà terapeutiche degli inibitori dei GAT Malattie neurologiche (epilessia spasticità muscolare) GABA Malattie psichiatriche (disturbi dell’ansia) Attività convulsivante → ↑ [k + ] ext => inversione GAT→ ↑ GABA ext → limita la diffusione dell’attività epilettica dal focus ad altre aree encefaliche [Disfunzioni GAT→? causa di epilessia? Epilessia lobo temporale → ↓densità GAT nell’ippocampo] Diversi inibitori sono stati sintetizzati usando come lead-compound il MUSCIMOLO (  GABA A e Θ GAT neuronale e gliale): -GUVACINA selettivi e potenti in vitro, deboli -AC. NIPECOTICO anticonvulsivanti in vivo (passano difficilmente attraverso la BBE) -TIAGABINA = Derivato lipofilo dell’acido Nipecotico. Efficace in diversi modelli sperimentali di epilessia Affinità preferenziale per GAT 1 => Θ re-uptake GABA nelle terminazioni e nella glia => ↑GABA →  GABA B -R sulle terminazioni Glu-ergiche => ↓Glu sinaptico neuronale => →→ ↓contenuto vescicolare GABA NB: Θ GAT gliale =>↑GABA (potente azione anticonvulsivante!)

13 I neurotrasportatori per la Serotonina [ 3 H] citalopram (ARG) → elevatà densità del SERT nei corpi cellulari serotoninergici dei nuclei del raphe e nelle loro aree di proiezione (CX, AMY, SN, CA 3, CPu) Il SERT si trova anche nelle PIASTRINE ( = gene). CARATTERISTICHE STRUTTURALI: 12 TM 1 Asp (su TM1) coinvolti nella traslocazione del substrato e nel x Ser (su TM6) legame competitivo di inibitori t/r/h SERT~ 600 aa Il gene del SERT è localizzato sul cromosoma 17 ed è formato da 14 esoni PKC e cAMP inducono l’attività del promotore Alterazioni della regolazione dell’espressione di SERT sembrano essere la causa più frequente di DISTURBI dell’UMORE.

14 Farmaci e tossine attivi sul SERT -TCA ANTIDEPRESSIVI: occupano siti distinti dal sito di -SSRI legame per il substrato. -AMFETAMINA (+ attiva sul DAT) INIBITORI-SUBSTRATO: -MDMA (ecstasy) vengono conc. nei neuroni -FENFLURAMINA (anoressizzante) serotoninergici da parte -MPTP del SERT MDMA e Fenfluramina possono provocare un’inversione del SERT → ↑ rilascio non-esocitotico di SEROTONINA => formazione di metaboliti neurotossici (es: 5,7-di-idrossitriptamina => degenerazione dei terminali serotoninergici ← Θ da TCA o SSRI)

15 FARMACI ANTIDEPRESSIVI: TCA SSRI A.D. ATIPICI AMINE 3 arie (> effetti anti-M) AMINE 2 arie (< effetti anti-M) IMIPRAMINA e AMITRIPTILINA (Θ SERT e NET) CLORIMIPRAMINA (Θ SERT in vitro) CLORDESIMIPRAMINA (Θ NET in vivo) CH 3 DESIPRAMINA NORTRIPTILINA => Θ NET MAPROTILINA PAROXETINA* FLOXETINA SERTRALINA FLUVOXAMINA CITALOPRAM Θ SERT in maniera selettiva Pochi * o assenza di effetti anti-Muscarinici Tempo di latenza + lungo rispetto a TCA (~ 2 sett) NOMIFENSINA: Θ DAT BUPROPIONE: Θ NET e DAT (insonnia e agitazione psicomotoria per Θ DAT nei gangli della base e nel sist limbico)

16 Il trasportatore di membrana per la DOPAMINA DAT (Na + /Cl - dipendente) → Neuroni DA-ergici → Piastrine → Linee cell. tumorali (es.neuroblastoma) STRUTTURA: Glicoproteina di 620 aa (PM~80 KDa) Molteplici varianti (diverse catene laterali di carboidrati) localizzate in diverse aree cerebrali Alta omologia con SERT, NET e GAT 12 TM: C- e N-term. intracellulari siti di glicosilazione sulle anse extracellulari siti di fosforilazione sulle anse intracellulari 1 Asp (TM1) → imp. per l’efficienza del trasporto e la dipendenza ionica x Ser (TM6, 7, 8) → determina l’affinità per gli inibitori Dominio C-term → influenza la stereoselettività e l’affinità per i substrati SH di Ser (2 a ansa extracell) → imp. per l’inserzione della proteina nella membrana e per la formazione di strutture 4 arie Leucine Zipper → serie di leucine che potrebbe determinare la formazione di omotetrameri 1 Asp N C SH Ser Ser Ser Stereoselettività Affinità x subst

17 Farmaci e tossine attivi sul DAT ANTIDEPRESSIVI: Bupropione, Nomifensina, Amineptina AT nAChRs + Θ DAT→ nicotine addiction (Zyban-USA 1997) COCAINA: Θ DAT (e NET) → ↑DA NAc “shell” → EFFETTI GRATIFICANTI L’effetto dipende dalla liberazione “ESOCITOTICA” di DA provocata dall’impulso nervoso AMFETAMINA : viene trasportata dal DAT nella terminazione nervosa, mentre il DAT trasporta la DA nello spazio extracellulare (=>inversione DAT~antiporto) L’effetto è indipendente dall’impulso nervoso D-Amf > L-Amf. MPP + : Metabolita neurotossico dell’MPTP che viene concentrato nelle terminazioni nervose DA-ergiche attraverso il DAT GBR-12935: Usato sperimentalmente per inibire il DAT (E’ più selettivo rispetto alla nomifensina) EFFETTI PSICOSTIMOLANTI Θ DAT DIPENDENZA PSICHICA

18 I trasportatori di membrana per la NORADRENALINA e l’ADRENALINA Sono poco selettivi per le diverse amine, ma le trasportano con ≠ efficienza Es.: NET→ trasporta con > efficienza (V max ) NE, ma ha > affinità per DA => Nella PfCx le terminazioni NE-ergiche sono più numerose di quelle DA-ergiche => il NET contribuisce in maniera consistente a rimuovere DA => la DESIPRAMINA (inibitore NET) produce un aumento di DA superiore a quello prodotto dai bloccanti del DAT. Il NET è Na + /Cl - -dipendente ma a differenza del SERT non è influenzato da [K + ] CARATTERISTICHE STRUTTURALI: Omologia aa con DAT ~ 65% 12 TM con C- ed N-term. intracellulari Lunga ansa extracell. fra TM3 e TM4 → siti di P-azione ed N-glicosilazione (regolazione della localizzazione subcellulare del NET) TM2 → motivo a “chiusura lampo” di leucina → interazione con altre proteine contenenti questo motivo. TM9-TM12+C-term. → siti selettivi per il legame del nt TM5-TM8 → siti di legame per gli ATs TM2 e TM3 → importanti per regolare la V max del trasporto dell’amina fET: Trasportatore per l’adrenalina recentemente isolato dai gangli del SN simpatico di rana. Alta omologia con hNET (~75%) Efficienza del trasporto: Adr>NE>DA (per hNET: NE>DA>Adr) Alta affinità per TCA (es: desipramina).

19 IL NET GENERA CORRENTI DEPOLARIZZANTI Il NET (~DAT e SERT) mostra una conduttanza tipica dei canali ionici: NET è permeabile al Na + anche in condizioni di riposo ↑[NE], [Na + ], [Cl - ] extracell.→ NE viene traslocata nello spazio intracellulare assieme a ~ 300 Na + In condizioni di intensa attività del trasportatore si ha DEPOLARIZZAZIONE della MEMBRANA Generazioni di potenziali ↓efficienza del d’azione a livello somato- trasportatore dendritico autoregolazione del trasportatore! ↓efficienza dell’esocitosi a livello delle terminazioni nervose

20 FARMACI ATTIVI SUL NET TCA: Amine 3arie (es: amitriptilina) Amine 2arie (Maprotilina, Viloxazina, Reboxetina, altamente selettive per NET) D- ed L-AMFETAMINA: inibitore-substrato COCAINA e METILFENIDATO: Si legano al trasportatore, ma non sono substrati Sono capaci di inibire la liberazione di NE indotta da amfetamina (blocco inversione NET).

21 I TRASPORTATORI VESCICOLARI H + -DIPENDENTI Alta [Nt] all’interno delle vescicole Il trasporto richiede molta energia proveniente dal gradiente elettrochimico del H + generato da una POMPA (ATPasi) localizzata nella membrana delle vescicole (~ lisosomi) Se la membrana è permeabile ad anioni (es: Cl - ) questi entrano nella vescicola assieme ai H + annullando il gradiente elettrico => si crea un gradiente di protoni senza alterare Vm. Se gli anioni non possono attraversare la membrana alla stessa velocità di H + => il trasporto di H + genera un potenziale elettrico che limita il loro ulteriore trasporto. In entrambi i casi si genera l’energia necessaria per il trasporto del nt contro-gradiente. ATP ADP+Pi H+H+H+H+ Sono stati identificati 4 diversi trasportatori vescicolari: VMAT→ MONOAMINE VAChT→ ACETILCOLINA VGAT→ GABA E GLICINA VGLUT→ GLUTAMMATO

22 I trasportatori vescicolari delle monoamine (VMAT) La pompa di protoni Complesso insolubile genera un pH intravescicolare imp. per l’equilibrio di 5,5 e un V m =60mV(positivo osmotico fra compartimento all’interno). vescicolare e citoplasma Il trasportatore lega le catecolamine che si trovano nel citoplasma in forma non ionizzata. Nella vescicola il gruppo aminico viene protonato→ La CA + non può ritornare nel citoplasma! VMAT 1 (512 aa) → Cell. cromaffini MPP + SUBSTRATI: NE~DA~5HT~E>>MPP + Reserpina INIBITORI: Reserpina>Tetrabenazina~Metamfetamina VMAT 2 (521aa) → SNC MPP + SUBSTRATI: NE~DA~5HT~E~MPP + Tetrabenazina~Metamfetamina INIBITORI: Tetrabenazina~Metamfetamina>Reserpina CARATTEISTICHE STRUTTURALI: 12 TM con C- ed N-term intracitoplasmatici TM1 e TM2 → traslocazione substrato Ansa intraluminale fra TM1 e TM2 → legame MPP + (implicata nel processo di rimozione delle neurotossine?) NB: MPP + viene trasportato nelle vescicole => limitazione del danno mitocondriale H+H+ ADP ATP+Pi H+H+ CA-N + H + = CA-NH  H+H+ ATP+CA= ATP-CA

23 Il trasportatore vescicolare dell’Acetilcolina (VAchT) 12 TM C- ed N-term intracitoplasmatici ~ 500 aa INIBITORE: VESAMICOLO La distribuzione del VAchT nei neuroni colinergici cerebrali e periferici è simile alla distribuzione della Colina Acetil Transferasi (ChAT) VAchT e ChAT vengono codificati da geni adicenti => regolazione coordinata dell’espressione delle 2 proteine VMAT Trasporto dipendente dal gradiente di pH VAchT VGLUT → Il trasporto dipende dal gradiente elettrico generato dalla H + -ATPasi VGAT → Il trasporto dipende sia dal gradiente elettrico che da quello chimico

24 Il trasportatore vescicolare per il GABA e la GLICINA VGAT trasporta GABA e Glicina (2 diversi trasportatori?) INIBITORI: Ac. Nipecotico (Θ anche GAT di membrana)  -vinil-GABA (Θ GABA-transaminasi => Epilessia, self-administration nicotina e cocaina) 10 TM con C- ed N-term intravescicolari ~ 500 aa Diverso da VMAT e VAchT→ famiglia genica diversa Il trasportatore vescicolare per il GLUTAMMATO (VGLUT) Fu inizialmente identificato come un trasportatore del fosfato inorganico. Affinità per il Glutammato: VGLUT < EAAT (Km=1-2mM) (Km=5-50μM) INIBITORI = trans-ACPD (mGlu-AG) chinurenato (iGlu-AT) derivati dell’ERGOT (es: bromocriptina) inhibitory protein factors (IPFα/β/γ)

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