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Il ruolo dei microrganismi nella digestione anaerobica Prof. Daniele Daffonchio Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM),

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Presentazione sul tema: "Il ruolo dei microrganismi nella digestione anaerobica Prof. Daniele Daffonchio Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM),"— Transcript della presentazione:

1 Il ruolo dei microrganismi nella digestione anaerobica Prof. Daniele Daffonchio Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM), Università di Milano workshop ERSAF, 28 maggio, 2008

2 Il metabolismo si divide in catabolismo ed anabolismo. I microrganismi possono essere distinti e classificati sulla base del loro catabolismo e delle esigenze nutrizionali. Fonte di energia Donatore di H Accettore di e - Le molecole entrano nelle cellule attraverso trasporto attivo mediato da ATPasi associate alle membrane, o attraverso trasporto passivo con un sistema di traslocazione che coinvolge zuccheri fosforilati IL METABOLISMO MICROBICO Radiazione Ossidazione Fototrofi Chemotrofi Prod. inorg. ridotti Molec. org. ridotte NH 4 + ; NO 2- ; S 2- ; S; S 2 O 3 2- Zuccheri; lipidi; proteine O2;O2; Mol.org.ox; NO 3- ; SO 4 2- ; CO 2 Aerobi Anaerobi

3 Lo schema generale del catabolismo è diviso in tre stadi: STADIO 1 Degradazione delle molecole complesse in monomeri più piccoli. Non viene rilasciata energia. STADIO 2 Ulteriore degradazione dei monomeri con rilascio di parte dellenergia sottoforma di ATP, potere riducente (es. NADH + ) e importanti intermedi metabolici (es. piruvato): STADIO 3 Completamento della degradazione dei substrati e raccolta della maggior quantità di energia (ATP; potere riducente) con il ciclo di Krebs accoppiato alla catena di trasporto degli elettroni (respirazioni aerobiche e anaerobiche) od alle fermentazioni. IL METABOLISMO CATABOLICO

4 Se si sottraggono intermedi dal ciclo (ad es. per le biosintesi metaboliche, o per la produzione industriale) reazioni anaplerotiche (di riempimento) intervengono per ripristinare lequilibrio ricostituendo i precursori del ciclo IL CATABOLISMO OSSIDATIVO Reazioni anaplerotiche

5 IL CATABOLISMO FERMENTATIVO Glucosio

6 dalle vie degradative principali si originano tutti i pathways anabolici: per aminoacidi alifatici e aromatici, lipidi, nucleotidi purinici e pirimidinici, ecc. IL METABOLISMO ANABOLICO

7 LA METANOGENESI POLIMERI MONOMERI ALCOLI SUCCINATO LATTATO ACIDI GRASSI C2 C3 COMP. C 1 H 2 ACETATO CH 4 CO Acidogenesi Acetogenesi Metanazione 1. Batteri fermentanti acidogeni primari 2. Batteri fermentanti secondari (sintrofici) 3. Batteri omoacetogeni 4. Metanogeni idrogenotrofi 5. Metanogeni acetoclasti

8 GLI ARCHAEA METANOGENI ORDINE: METHANOBACTERIALES Famiglia: Methanobacteriaceae Genere:Methanobacterium Genere: Methanobrevibacter H 2 /CO 2 Genere: Methanosphaera formiato Famiglia: Methanothermaceae Genere: Methanothermus ORDINE: METHANOCOCCALES Famiglia: Methanococcaceae Genere: MethanococcusH 2 /CO 2 ORDINE: METHANOMICROBIALES Famiglia: Methanomicrobiaceae Genere: Methanomicrobium Genere: MethanogeniumH 2 /CO 2 Genere: Methanoculleus Genere: Methanospirillum Famiglia: Methanocorpusculaceae Genere: MethanocorpusculumH 2 /CO 2 Famiglia: Methanoplanaceae Genere: MethanoplanusH 2 /CO 2 Famiglia: Methanosarcinaceae Genere: Methanosarcinaacetato H 2 /CO 2 Genere: Methanococcoides Genere: Methanolobusmethanolo Genere: Methanohalophilus Genere: Methanosaeta/Methanotrix acetato LE REAZIONI DI METANAZIONE 4H 2 + HCO H + CH 4 + 3H 2 O 4HCOO- + H + + H 2 O CH HCO 3 - CH 3 COO - + H 2 O CH 4 + HCO 3 - ACETATO: AFFINITA E V max K s V max (mM) (h -1 ) Methanosarcina Methanosaeta

9 GENOMI SEQUENZIATI

10 METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA E un processo metabolico molto meno esoergonico della respirazione aerobica o delle respirazioni anaerobiche La conversione di un esoso a CH 4 rilascia solo il 15% dellenergia ottenibile dalla degradazione aerobica C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O (DG° = kJ/mole) C 6 H 12 O 6 3CO 2 + 3CH 4 (DG° = -390 kJ/mole) La bassa resa energetica della metanogenesi costringe i microrganismi coinvolti a cooperare molto efficientemente ed a stabilire relazione di SINTROFIA la cooperazione tra 2 organismi che dipendono luno dallaltro. La mutua dipendenza non può essere sostituita dallaggiunta di nutrienti. Ad es. la co- coltura di Methanobacillus omelianskii degrada letanolo a: Strain S 2CH 3 CH 2 OH + 2H 2 O 2CH 3 COO - + 2H + + 4H 2 ( G° = +19 kJ per 2 mol of ethanol) Strain M.o.H. 4H 2 + CO 2 CH 4 + 2H 2 O ( G° = -131 kJ per mol of methane) Co-Culture 2CH 3 CH 2 OH + CO 2 2CH 3 COO - + 2H + + CH 4 ( G° = -112 kJ per mol of methane)

11 METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA Un processo che favorisce la sintrofia è il TRASFERIMENTO INTERSPECIE DI H 2, HCOO - E CH 3 COO - in cui un efficiente scavenger per questi substrati (es. metanogeni o solfatoriduttori) ne mantiene una bassa concentrazione, favorendone la produzione da parte degli acetogeni sintrofici

12 METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA

13 Oltre al classico network metabolico con 3 livelli trofici (acidogenesi, acetogenesi, metanazione) è stato identificato un network metabolico a 2 livelli (acetogenesi e metanazione), in cui un gruppo batterico, le spirochete, produce direttamente acetato, H 2 e CO 2 da glucosio insieme a quantità variabili di lattato ed etanolo. In presenza di efficienti scavenger per lH 2 come i metanogeni la maggior parte del flusso elettronico del metabolismo delle spirochete va nella direzione di acetato, H 2 e CO 2 a spese di lattato ed etanolo. In questa situazione metabolica gli acetogeni sintrofici hanno un ruolo insignificante ed il processo di metanogenesi viene completato in due livelli trofici. METANOGENESI: PATHWAYS ALTERNATIVI MONOMERI (glucosio) COMP. C 1 H 2 ACETATO CH 4 CO Spirochete; 2 Metanogeni H-trofi; 3 Metanogeni acetoclasti Metanazione Acetogenesi 3

14 COMUNITA FLESSIBILI E STABILITA FUNZIONALE Quale è la stabilità dei processi metabolici metanogenici esposti a stress? La risposta di reattori con i 2 tipi di pathway metanogenici (a 2 o 3 livelli) a shock da sovraccarico di substrato indica che la miglior reazione metabolica si ha dove il flusso elettronico di degradazione del substrato a CH 4 avviene per vie metaboliche parallele piuttosto che sequenziali. FLUSSI METABOLICI PARALLELI Nel caso di reattori ad alto contenuto di spirochete la formazione dei substrati di metanazione (acetato ed H 2 ) da glucosio avviene attraverso 2 vie indipendenti, quella diretta catalizzata dalle spirochete a quella con lintervento di acetogeni sintrofici FLUSSI METABOLICI SEQUENZIALI Nel pathway metanogenico a tre livelli la produzione di acetato e H 2 avviene attraverso step metabolici sequenziali catalizzati da diversi gruppi trofici.

15 COMUNITA FLESSIBILI E STABILITA FUNZIONALE Per verificare la risposta a stress di sovraccarico organico di comunità microbiche metanogeniche che si differenziano per flussi metabolici paralleli piuttosto che sequenziali, sono stati comparati due tipi di reattori derivanti dal medesimo inoculo e condotti nelle medesime condizioni operative, ma selezionati sulla base di differenze per il tempo medio di residenza cellulare (17,5 contro 5,8 giorni). FLUSSI METABOLICI PARALLELI FLUSSI METABOLICI SEQUENZIALI

16 COMUNITA FLESSIBILI E STABILITA FUNZIONALE Lanalisi dimmagine computerizzata dei morfotipi microbici e lanalisi ARDRA dei cloni in librerie di 16S ottenute dai due set di reattori indicavano una distinta composi- zione in m.o.: REATTORI HS (high- spirochete) dominati da spirocheTe, bastoncini corti e Methanosarcina. REATTORI LS (low spirochete) dominati da cocchi e Methanosaeta. Il sovraccarico di substrato (glucosio) determinava una maggior variazione delle popolazioni nelle comunità HS che ritornavano alla composizione iniziale dopo 24 giorni dallinizio della perturbazione. Mentre le popolazioni nel reattore LS rimanevano relativamente stabili.

17 COMUNITA FLESSIBILI E STABILITA FUNZIONALE Dal punto di vista metabolico, la co- munità LS reagiva più prontamente: ripristinando in un tempo più breve gli equilibri iniziali di concentrazione dei metaboliti del processo di metanogenesi. Le caratteristiche del processo HS erano: i) Più lenta utilizzazione del substrato glucosio. ii) Mantenimento di un livello più basso dei metaboliti intermedi. iii) Inizio simultaneo dei diversi processi fermentativi (produzione dei diversi acidi).

18 METANOGENESI: DIVERSITA MICROBICA E STABILITA FUNZIONALE Comunità microbiche con i principali flussi metabolici paralleli sono funzionalmente più stabili in risposta a perturbazioni esterne come shock da sovraccarico organico rispetto a comunità con flussi metabolici seriali. Comunità microbiche più complesse (con maggiore biodiversità) possono rispondere meno prontamente agli stress di comunità microbiche più semplici ma organizzate in maniera funzionalmente diversa. Per unefficiente risposta agli stress alla biodiversità genetica e fenotipica deve accompagnarsi una biodiversità funzionale.

19 METANOGENESI: I REATTORI Per la digestione anaerobica dei reflui si distinguono diversi tipi di reattori che si differenziano per: Schema idraulico dei sistemi Forma della biomassa (libera, adesa)

20 METANOGENESI: I REATTORI PER REFLUI Reattori a letto fisso espanso fluidizzato Le cellule sono immobilizzate in un biofilm adeso ad un supporto inerte (plastica, legno,ecc.) Reattori a biomassa libera Reattori a biomassa adesa Migliore contatto tra le cellule e migliore sintrofia (es. la rimozione dellH 2 prodotto dagli acetogeni sintrofici, Sintrophomonas e Sintrophobacter, da parte dei metanogeni idrogenotrofi che agiscono da scavenger dellH 2 tossico per gli acetogeni) Stabilità della biomassa nel reattore (basso washout cellulare) Reattori UASB (upflow anaerobic sludge bed) La biomassa è organizzata in biofilm autoimmobilizzato in granuli compatti (diam cm) ad alta sedimentabilità Strati di microrganismi Materiale di supporto

21 METANOGENESI: I REATTORI UASB Influente Effluente Biogas MESOFILI TERMOFILI Ricircolo

22 METANOGENESI: I REATTORI UASB Nei reattori UASB (Upflow anaerobic sludge Blanket) si sviluppano granuli con biomassa strati-ficata in cui sono particolarmente effi-cienti gli scambi tro-fici tra i diversi m.o. (es. metanogeni e acetogeni sintrofici). Libridazione in situ con sonde specifiche per Archaea (rosse) e per Bacteria (verdi) mostra che gli strati superficiali sono prevalentemente colonizzati da batteri, mentre gli strati profondi dei granuli sono colonizzati da archaea, sia in granuli mesofili che termofili. La parte centrale dei granuli non da segnale di ibridazione e sembra costituita da residui cellulari e materiale inorganico.

23 METANOGENESI: I REATTORI UASB M.saeta (rosso) Eubacteria (verde) M.bacteriaceae (rosso) Eubacteria (verde) M.microbiaceae (rosso) Eubacteria (verde)M.sarcinaceae (rosso) Eubacteria (verde) MESOFILI TERMOFILI

24 METANOGENESI: I REATTORI UASB ARC915: sonda universale per Archaea ( fluorescina) SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina) ARC915SYN-7ARC915+SYN-7 ARC915: sonda universale per Archaea (fluorescina) EU338: sonda universale per Bacteria (rodamina) MX825: sonda spec. per Methanosaeta sp. (rodamina) MG1200: sonda spec. per M.microbiaceae (fluorescina) SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina) ARC915+EU338+MX825MG1200+SYN-7

25 Sekiguki et al Appl. Environ. Microbiol., 67:

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29 INTERAZIONE METANOGENI-SOLFATORIDUTTORI IN UASB Linterazione spaziale tra solfatoriduttori e metanogeni, 2 gruppi microbici che competono per i donatori di elettroni diretti (acetato e H 2 ) ed indiretti (es. lattato, etanolo, ecc.) è stata studiata attraverso impiego di microsensori per CH 4 e H 2 S, per misurare negli strati di granuli UASB metanogenici e sulfidogenici-metanogenici, la concentrazione dei 2 gas e lattività metanogenica e sulfidogenica. Le analisi di attività e di microprofili dei gas indicano che i solfatoriduttori si posizionano negli strati più esterni del biofilm, mentre gli archaea metanogeni colonizzano il centro del granulo. Questi risultati venivano confermati da esperimenti di ibridazione in situ. Granuli metanogenici-sulfidogenici Granuli metanogenici

30 STABILITA DELLA BIOMASSA Influente Effluente Biogas Washout FAVORIRE: Bassa idrofobicità superficiale biofilm Batteri a superficie idrofilica sulla superficie del biofilm 1 cm

31 WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La stabilità dei granuli è determinata dallinterazione con le microbolle di gas e quindi dalla tensione superficiale allinterfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i G di adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni interfacciali: Ad alti carichi organici ed alte produzioni di biogas la biomassa granulare inizia a flottare ed è trasportata fuori dal reattore con il fenomeno del wash-out della biomassa

32 WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La maggior parte degli acidogeni sono IDROFILICI, mentre la maggior parte dei metanogeni e degli acetogeni sono IDROFOBICI

33 WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La stabilità dei granuli è determinata dallinterazione con le microbolle di gas e quindi dalla tensione superficiale allinterfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i G di adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni interfacciali: Cè quindi una finestra ottimale di tensione superficiale del liquido che aumenta lesposizione di batteri idrofilici sulla superficie dei granuli e abbassa i valori di G di adesione per i microganismi idrofilici

34 La configurazione 1 risponde anche al flusso trofico che deve essere stabilito tra lesterno e linterno del granulo. Allesterno del granulo è abbondante il glucosio e gli zuccheri substrati del primo gruppo trofico della metanogenesi, gli ACIDOGENI che sono idrofilici WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La configurazione dei granuli UASB in relazione alla tensione superficiale del reflo e in accordo a considerazioni termodinamiche può essere così schematizzata:

35 LA METANOGENESI POLIMERI MONOMERI ALCOLI SUCCINATO LATTATO ACIDI GRASSI C2 C3 COMP. C 1 H 2 ACETATO CH 4 CO Acidogenesi Acetogenesi Metanazione Produzione di idrogeno scorporando le fasi di acidogenesi da quella di metanazione per favorire la produzione fermentativa di idrogeno

36 PRODUZIONE DI IDROGENO

37 Produzione di idrogeno da reflui solidi scorporando acidogenesi da metanazione in due reattori con diverso tempo di ritenzione

38 PRODUZIONE DI IDROGENO Aumento dellaccumulo di idrogeno attraverso sparging di gas nel reattore Aumento delle rese di metano nel rattore metanogenico

39 Grazie per lattenzione !


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