La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE AA 2008/09 LEZIONE 6 Acidi nucleici e farmaci CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE AA 2008/09 LEZIONE 6 Acidi nucleici e farmaci CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi."— Transcript della presentazione:

1 BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE AA 2008/09 LEZIONE 6 Acidi nucleici e farmaci CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi

2 GLI OLIGONUCLEOTIDI ANTI-GENE (TRIPLEX) Loligonucleotide si lega in modo specifco al DNA, intercalandosi nella struttura a doppia elica, formando un tratto di catena tripla che determina linattivazione della replicazione del DNA e della trascrizione dellmRNA

3 VANTAGGI DELLA TERAPIA ANTIGENE RISPETTO AGLI ODN Tale modalità di impiego mostra prospettive alquanto interessanti poiché lazione diretta sul gene implica luso di quantità inferiori di ODN essendo in questo caso solo due i targets (le due copie del gene) rispetto ai numerosissimi targets della strategia ODN (le copie dellmRNA). Si garantisce inoltre una più durevole attività terapeutica contando sulla maggiore durata dellemivita del gene rispetto a quella del messaggero. Questa strategia comporta la formazione di un breve tratto a tripla elica (mediante legami di Hoogsteen) nelle regioni di controllo della trascrizione presenti nel DNA.

4 TRIPLEX Le prime indicazioni, indirette circa la possibilità di formazione di un tratto di DNA a tripla elica risale a studi sulla densità ottica con miscele di poli U e poli A condotti da B. Felsenfeld nel Hoogsteen chiarisce la natura dei legami che consentono la formazione della tripla elica in tratti omopurinici e omopirimidinici (AG o TC). In questo contesto la C non presenta atomi disponibili per un ponte idrogeno con la G prospiciente e deve essere quindi protonata. Tale reazione può avvenire a un pH leggermente acido (6,6) e in presenza di ioni bivalenti. In queste condizioni lODN ibridizza con la sequenza omopurinica complementare mediante legami di Hoogsteen, formando così le due triplette T-AT e C-GC. LODN si colloca nel solco maggiore del duplex preesistente con una orientazione parallela alla sequenza omopurinica del DNA bersaglio.

5 LEGAMI DI HOOGSTEEN

6 PROBLEMATICHE DELLA TERAPIA ANTI-GENE 1.Il bersaglio deve essere costituito da sequenze omopuriniche/pirimidiniche 2.La lunghezza della sequenza bersaglio deve essere minimo di 15 nucleotidi consecutivi 3.Il rapporto A/G non deve essere inferiore a 4 molte sequenze 5 rispetto ai DNA codificanti hanno tratti omopurinici 4. Tutte le C devono essere protonate e quindi occorre agire a pH più bassi di quello fisiologico. Questo problema può essere superato con alcuni stratagemmi

7 METODICHE PER SUPERARE LOSTACOLO DELLA PROTONAZIONE 1.utilizzo nella sintesi dellODN di 5-metilcitosina che consente libridizzazione al duplex anche a pH neutri 2.Utilizzare ODN costituiti da PNA che hanno una migliore capacità di ibridizzare 3.Utilizzo di molecole intercalanti legate allODN, capaci di legare una base sul duplex conferendo una maggiore stabilità alla tripla elica 4.Sostituire la base citosina con leterociclo 2- aminopiridina, il cui pKa è maggiore di quello della citosina e ciò favorisce il legame a pH neutro

8 Watson-Crick PNA Strand Hoogsteen PNA Strand DNA Strand PNA Strand invasion COO- NH CHIMICA DEL LEGAME PNA-DNA I PNA possono legarsi al DNA sia attraverso legami idrogeno sia di Hoogsteen

9 I RIBOZIMI

10 Nel 1982 Thomas Cech dimostra che un introne del protista Tetrahymena termophila è in grado di promuovere in vitro la propria escissione specifica (splicing) dal precursore dellRNA ribosomale di cui fa parte. Exon 1Exon 2Intron1Exon 1Exon 2Intron 1 + pre-rRNA Spliced exon Intron circle Intron linear pre-rRNA Nuclear extract GTP I prodotti di spicing sono stati separati per gel elettroforesi : La catalisi di tale reazione è indipendente da componenti proteiche Richiede solo nucleotidi guanosinici (GMP, GDP, GTP o guanosina) e ioni Mg 2+

11 RIBOZIMI NATURALI Producono nel taglio di un RNA substrato estremità 3OH e 5 fosfato. Sono raggruppabili in classi in base alla loro struttura ed alle reazioni in cui sono coinvolti RNAsi P: Ubiquitaria, è responsabile della maturazione dei tRNA nel loro estremo 5 RNAsi HRP: Replicazione DNA mitocondriale tagliando RNA primer INTRONI tipo I: Tetrahymena pre RNA mitocondriale di lievito geni di cloroplasti INTRONI tipo II: con meccanismo di splicing conservato (precursori di mRNA in organelli di funghi e piante)

12 CARATTERISTICHE COMUNI AI RIBOZIMI Reazione di formazione e rottura di legami covalenti in molecole substrato a RNA I ribozimi sono catalizzatori di reazioni che li vedono altresì implicati come substrato La struttura tridimensionale dellenzima determina la sua specificità di legami con il substrato a creare il sito catalitico Le reazioni catalizzate sono basate sullo scambio di protoni (con conseguente idrolisi o transesterificazione risultanti nel taglio di legami fosfodiesterici) I ribozimi sono metallo-enzimi

13 INTRONI DI TIPO I Lattività catalitica degli introni di tipo I dipende dalla loro struttura secondaria o terziaria altamente conservata La struttura catalizza lo splicing in 5 e 3 entro un sito attivo (core) e attivando i ponti fosfodiesterici ai siti di splicing Molti dei domini conservati esterni al core possono essere eliminati senza evidenti perdite di fonzionalità

14 MECCANISMO DAZIONE DEGLI INTRONI DI TIPO I 1. Attacco nucleofilo della guanina presente nellambiente 2. Generazione di un terminale OH 3. Seconda transesterificazio ne per attacco nucleofilo del terminale libero sul primo nucleotide dellesone in 3

15 SITI ATTIVI NEGLI INTRONI DI TIPO I

16 STRUTTURA SECONDARIA CARATTERISTICA DEGLI INTRONI DI TIPO I esone1 esone2 P1P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P3,P4,P6,P7 rappresentano il core dellintrone, ovvero la minima porzione che mantiene lattività catalitica Le sequenze delle regioni P4 e P7 sono conservate. P1 si appaia alla fine dellesone 1 e linizio dellintrone. La regione tra P7 e P9 si appaia allestremità 3 dellintrone.

17 STRUTTURA TERZIARIA DEGLI INTRONI DI TIPO I

18 INTRONI DI TIPO II 2 G HO 3 Exon 1 Exon 2 OH G Exon 1+ 2 G A HO 2 Exon 1 Exon 2 OH A Exon A + + Group I Group II

19 MECCANISMO DAZIONE DEGLI INTRONI DI TIPO II Usano il 2 OH di una adenina interna allintrone Attacca il 5 fosfato sul primo nucleotide dellintrone Lintrone assume una struttura circolare tipica detta lariat Gli esoni sono uniti e lintrone è exciso mantenendo la struttura lariat Un enzima appositamente deputato taglia il lariat e origina un introne lineare Lintrone lineare viene degradato 2 A HO 2 Exon 1 Exon 2 OH A Exon A +

20 STRUTTURA SECONDARIA DEI RIBOZIMI DI TIPO II Da I a VI sono indicati i domini conservati dellintrone. I segmenti tratteggiati indicano le regioni di interazione a distanza Schema della reazione catalizzata dagli introni di tipo II

21 STRUTTURA DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD Lo schema rappresenta il cambiamento di struttura in due fasi, indotto dal legame di ioni Mg2+. La prima fase consiste nella formazione di un dominio coassiale tra due eliche la seconda genera il core catalitico. Il ribozima con la struttura finale è in grado di auto-tagliarsi nel punto indicato dalla freccia rossa

22 STRUTTURA SECONDARIA E TERZIARIA DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD La sequenza CUGA adiacente allo stem loop I è sufficiente per il taglio Struttura terziaria

23 STRUTTURA CRISTALLOGRAFICA DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD La struttura cristallina evidenzia 5 siti di legame per il Mg 2+

24 PICCOLI RNA CATALITICI-1 VIROIDI Molecole di RNA infettive che funzionano indipendentemente, prive di capside proteico VIRUSOIDI Simili ai viroidi ma sono incapsulati insieme al genoma virale in virus di piante. Non replicano indipendentemente dal virus. Sono perciò detti RNA satelliti

25 Questi RNA promuovono reazioni di auto-taglio. Tale reazione è favorita da cationi divalenti e genera terminali 5 OH e 2-3 ciclici. Molti di essi per tagliare assumono una struttura hammerhead PICCOLI RNA CATALITICI-MECCANISMO DAZIONE 1. legame fosfodiestere intatto 2. Stato di transizione che coordina il mg Taglio del legame fosfodiestere

26 RIBOZIMI MECCANISMO DAZIONE -1 RNA è una molecola meno stabile del DNA perché lO in 2 può attaccare il legame fosfodiesterico adiacente (attacco nucleofilo) e romperlo, lasciando un fosfato 2-3 ciclico e un ossidrile in 5. MODALITA DI TAGLIO DI RNA: RNAsi P e introni di tipo I e II catalizzano lidrolisi del legame fosfodiesterico, lasciando un fosfato in 5 e un ossidrile in 3 Le reazioni di taglio che dipendono dallO in 2 possono essere attivate in due modi: 1)Ambiente alcalino: lO in 2 si attiva per ionizzazione 2)Ribonucleasi A catalizza la reazione di taglio usando un residuo basico di istidina per spostare il protone dellO al 2 e un residuo acido di aspartato per trasferirlo al 5

27 La carica positiva di un residuo di lisina adiacente interagisce con il fosfato e lo stabilizza durante lo stato di transizione. Il fosforo tende ad assumere una conformazione a bipiramide trigonale durante lo stato di transizione e questo può spiegare perché il taglio mediato dallO al 2 è più rapido in presenza di nucleotidi (pirimidina, adenosina) specifici perché le interazioni tra basi possono influenzare la conformazione del legame fosfodiestere RIBOZIMI MECCANISMO DAZIONE -2

28 APPLICAZIONI TERAPEUTICHE DEI RIBOZIMI-1 Ribozima con mRNA corretto Sono attivi in CIS cioè intramolecolarmente. Studi in corso prevedono manipolazioni per indurli a lavorare in TRANS ad esempio per il riparo di RNA mutati o danneggiati. Esempio: ripristino del controllo della proliferazione cellulare agendo su p53 mRNA mutato + mRNA correttomRNA scartato ribozima ++

29 ANGIOZYME TM HEPTAZYME TM Ribozima disegnato per inibire il VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). ANGIOGENESIS Ribozima che lega sequenze altamente conservate del virus dellepatite C HCV DRUG RESISTANCE RIBOZIMI IN CLINICAL TRIALS-1

30 HIV Gene Therapy... Bone Marrow Sample Treat Stem Cells with Retroviral Vector Re-Implant Treated Cells Encodes Gene for anti-HIV Ribozyme RIBOZIMI IN CLINICAL TRIALS-2

31 APTAMERI Sono ORN o ODN capaci di riconoscere una specifica sequenza amminoacidica o un epitopo appartenente ad una proteina Sono stati scoperti per caso osservando lalterazione del processo di coagulazione, dovuto ad un aumento del tempo di protrombina in seguito alla somministrazione di ODN antisenso. In queste molecole e presente un G quartet che conferisce al DNA la capacità di legare la trombina inattivandola

32 APTAMERO PER L -TROMBINA Organizzazione strutturale dellaptamero per l -trombina e disposizione dei quartetti di guanina che ne stabilizzano la conformazione

33 APTAMERI CON STRUTTURA 3D DETERMINATA Ligando Affinita Kd ( M)Acido nucleico Teofillina FMN AMP Arginina Citrullina Tobramicina Neomicina B HIV-1 Rev peptide HTLV-1 Rex peptide MS2 coat protein Trombina RNA DNA/RNA RNA DNA 0,3 0,5 6/10 125/ ,009 0,115 0,004 0,025 ND 0,025

34 STRUTTURA DI ALCUNI APTAMERI Riconoscimento di ligandi aromatici piatti: A: strutture B: teofillina-RNA C: FMN-RNA D: AMP-DNA E: AMP-RNA Riconoscimento di aminoacidi basici: A: strutture B,C: arginina-DNA D: arginina-RNA E: citrullina-RNA Riconoscimento dellantibiotico aminoglicoside tobramicina: A: struttura B: aptamero tobramicina-RNA C: la tasca che accoglie il ligando Riconoscimento di peptidi e proteine: A:peptide derivante dalla proteina Rev del virus umano HIV- 1 B,C: diversi aptameri RNA Rev D, E: aptamero proteina di rivestimento del batteriofago MS2- RNA

35 MOTIVI STRUTTURALI CHE RICONOSCONO IL DNA

36 FLESSIBILITA DEL DNA Struttura del complesso CAP-DNA. Il DNA risulta ripiegato in due punti in seguito allinterazione con la proteina. I cilindri rappresentano la regione proteica interessata.

37 A tuttoggi è impossibile indicare a priori se esistano e quali siano le sequenze di DNA in grado di riconoscere una definita struttura enzimatica Lanalisi basata sui metodi computazionali richiede tempi di elaborazione esageratamente prolungati per stabilire la conformazione spaziale di macromolecole Lisolamento di aptameri ad attività biologica richiede lo sviluppo di metodologie sperimentali specifiche SELEZIONE DEGLI APTAMERI-1

38 SELEX ( Systematic evolution of ligands by exponential amplification) Random or doped DNA pool Trascribed RNA pool cDNARegenerated DNA pool 1.Generazione di una diversità di sequenza (sintesi chimica, manipolazione enzimatica, PCR) 2.Selezione di forme funzionali attraverso il legame con il bersaglio e leliminazione di molecole non affini 3.Amplificazione della popolazione selezionata con metodiche di PCR 4.Step successivi di selezione e riamplificazione per isolare le molecole più efficienti

39 UTILIZZO DEGLI APTAMERI LUTILIZZO TERAPEUTICO è ancora incerto Sono utili MEZZI DIAGNOSTICI grazie alla loro alta affinità e specificità per il bersaglio. Come gli anticorpi possono essere legati a molecole radioattive o ad enzimi la cui attività può essere facilmente valutata. Sono però più piccoli e maneggevoli degli anticorpi

40

41 APTAMERI IN TERAPIA Il primo aptamero approvato come farmaco è stato il MACUGEN per il trattamento della degenarazione maculare (OSI Pharmaceuticals). Archemix (Cambridge, Ma) sviluppa aptameri antagonisti del Fattore di Willebrand attualmente in Fase clinica 2 per sindrome acuta coronarica Aptameri non modificati sono in studio per la coagulazione ematica e per la terapia di patologie oculari

42 APTAMERI IN DIAGNOSTICA Aptamero legante della tenascina per imaging di neoplasie in sviluppo da parte della Schering AG

43 SVANTAGGI DEGLI APTAMERI COME FARMACI 1.Come gli aODN sono molecole relativamente poco stabili 2.Problemi nella distribuzione e nella biodisponibilità 3.Costo di produzione NB. Possono però essere modificati chimicamente per aumentarne la stabilità e si possono utilizzare le metodologie di veicolazione già viste per gli ODN

44 VANTAGGI DEGLI APTAMERI COME FARMACI 1.Interagiscono specificatamente con i loro target 2.La grande area superficiale degli acidi nucleici permette la formazione di più interazioni con il bersaglio rispetto ai farmaci classici, ciò determina un legame molto stretto (Kd nel range nanomolare e picomolare) 3.Sono in grado di inibire la funzione del loro bersaglio ma anche di modificare il metabolismo associato a quel bersaglio es. aptameri anti-trombina bloccano anche la coagulazione del sangue

45 DECOY Sono brevi sequenze di DNA omologhe ad una sequenza consenso per una proteina transattivante. Il decoy inibisce la funzione della proteina legandosi in modo competitivo al sito di riconoscimento della proteina con la sequenza consenso

46 MECCANISMO DAZIONE DI DECOY CHE INIBISCONO LA PROLIFERAZIONE CELLULARE TTTCGCGC E2F cdk P P P RB Ciclina A Silente Transattivante C-myc C-myb Cdc2 Kinase PCNA

47 oligonucleotide mimicking a negative regulatory sequence of promoter C of estrogen receptor alpha (ER alpha) gene is sufficient for its re-expression in ER-negative human cancer cell lines NFκB decoy oligo therapy for IBD (Inflammatory Bowel Disease) E2F Decoy Transfection by HVJ-AVE–Liposome Method Cardiac Allograft Arteriopathy DECOYS IN THERAPY

48 NUOVI TARGET TERAPEUTICI

49 DIFFERENZE APTAMERI/DECOY APTAMERI RNA o DNA singolo o doppio filamento Omologhi di consensus dellRNA legano proteine citoplasmatiche DECOY ODN a doppia elica Omologhi di consensus dellDNA legano proteine nucleari


Scaricare ppt "BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE AA 2008/09 LEZIONE 6 Acidi nucleici e farmaci CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi."

Presentazioni simili


Annunci Google