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Lenergia associata ad ogni radiazione è definita dalla legge di Planck: E = h E = h Campo magnetico Campo elettrico Direzione di propagazione lunghezza.

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1 Lenergia associata ad ogni radiazione è definita dalla legge di Planck: E = h E = h Campo magnetico Campo elettrico Direzione di propagazione lunghezza donda lunghezza donda a a ampiezza donda PROPRIETA DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE : frequenza donda

2 tempo am pie zza spazio am pie zza 4 Hz 1 s tempo am pie zza spazio am pie zza 2 Hz 1 s E importante ricordare che frequenza e lunghezza donda non si possono confrontare sullo stesso grafico Lunghezza donda, frequenza e velocità di una qualsiasi onda elettromagnetica sono correlate dalla relazione c

3 Passando dallaria al vetro, la velocità di propagazione diminuisce a causa dellindice di rifrazione; pertanto, rimanendo costante la frequenza (dipendente solo dalla sorgente luminosa), diminuisce anche la lunghezza donda. Variazione di con lindice di rifrazione del mezzo ampiezza distanza aria vetro = 6,0 x Hz = 500 nm = 6,0 x Hz = 500 nm = 6,0 x Hz = 350 nm

4 Onde radio Microonde IR lontano IR medio IR vicino Visibile UV vicino UV lontano Raggi X Frequenza, Energia Frequenza, Energia m 0,1-100 cm m 2,5-50 m 0,75-2,5 m nm nm nm Å REGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICO 1 Å = m 1 nm = m 1 m = m

5 REGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICO Principali applicazioni delle diverse onde

6 INTERAZIONI TRA MOLECOLE ED ENERGIA RADIANTE E 0, E 1, E 2 : livelli elettronici v 0, v 1, v 2 : livelli vibrazionali r 0, r 1, r 2 : livelli rotazionali Lenergia assorbita viene ceduta per diseccitazione termica o, più per diseccitazione termica o, più raramente, radiativa (fluorescenza o fosforescenza)

7 SPETTROFOTOMETRIA UV E VISIBILE Soluzionecampione I 0 (P 0 )I (P) Potere radiante (P): energia che attraversa unarea unitaria in un secondo (J/sec) Intensità (I): potere radiante per unità di angolo solido (steradiante) della sorgente TRASMITTANZAI I0I0I0I0 T = 0 T 1 0% T 100% ASSORBANZAT 1 A = - log T = log = log I I0I0I0I0 0 A numeriadimensionalinumeriadimensionali

8 radiante r r steradiante

9 Spettro di assorbimento della clorofilla max Spettro di assorbimento: diagramma ottenuto misurando lassorbanza in funzione di max : max : lunghezza donda a cui corrisponde un massimo di assorbimento

10 LEGGE DI LAMBERT-BEER I0I0I0I0 I dn I0I0I0I0I I cammino ottico b Valida per radiazioni monocromatiche - dI = KI dn dI = - Kdn I ln I = - KN I0I0 dI I = - Kdn 0 N I0I0 I ponendo N = Kbc (c: conc. soluzione) ln I = - (K · K)bc = - abc I0I0 I = e -abc I0I0 T = e -abc passando ai log e ponendo a = alog e log T = -abc T = 10 -abc Poiché A = - log T A = - log 10 -abc = abc A = abc N° totale molecole

11 Per b = c = 1 A = a A = a b c A1% 1 cm : in F. U. estinzione specifica di soluzioni 1% p/v e cammino ottico 1 cm A = a (assorbività, costante per costante) coefficiente di estinzione (o assorbanza specifica) se b espresso in cm e c in g/L coefficiente di estinzione molare (o assorbanza specifica molare) se b espresso in cm e c in mol/L a = a = A = abc concentrazione A

12 Deviazioni dalla legge di Lambert-Beer a) deviazioni fisiche - a concentrazioni elevate il soluto può formare dimeri, polimeri o aggregati con il solvente generando deviazioni positive o negative generando deviazioni positive o negative concentrazione A - a concentrazioni elevate cambia anche lindice di rifrazione della soluzione e quindi la della radiazione che lattraversa; di conseguenza, lassorbanza di soluzioni di diversa concentrazione radiazione che lattraversa; di conseguenza, lassorbanza di soluzioni di diversa concentrazione viene misurata, di fatto, a diverse con scostamento dalla linearità viene misurata, di fatto, a diverse con scostamento dalla linearità

13 b) deviazioni strumentali Dipendono essenzialmente dalla monocromaticità della radiazione incidente: le deviazioni dalla linearità sono tanto più grandi quanto maggiore è la banda passante Banda passante: intervallo di radiazioni isolate dallo strumento e convogliate sulla soluzione in esame Skoog, West, Holler, Crouch

14 c) deviazioni chimiche Più apparenti che reali, sono dovute di solito ad alterazioni dellequilibrio chimico tra due specie max : 372 nm max : 372 nm max : 450 nm max : 450 nm Cr 2 O H 2 OCrO H + Esempio Esempio: Se a 372 nm e pH = 1, Assorbanza (CrO 4 2- ) = x Se a 450 nm e pH = 1, Assorbanza (Cr 2 O 7 2- ) = y Diluendo successivamente nel rapporto 1 a 10: Diluendo successivamente nel rapporto 1 a 10: Assorbanza (CrO 4 2- ) > 1 x Assorbanza (Cr 2 O 7 2- ) < 1 y 10 10

15 ANALISI QUANTITATIVA Viene effettuata quasi sempre in corrispondenza della max in modo che: - aumenti lintervallo di linearità della legge di Lambert-Beer (vedi prima) - aumenti la sensibilità del metodo analitico, infatti A = abc Sensibilità = dA = ab dC La sensibilità è cioè al cammino ottico b e al coefficiente di estinzione a

16 ANALISI IN ASSORBIMENTO a) Metodo di confronto Il confronto con soluzioni standard a differente concentrazione è visivo e limitato alle soluzioni colorate A1A1A1A1 A2A2A2A2 A3A3A3A3 A4A4A4A4 AxAxAxAx Mantenendo il cammino ottico costante, se A x = A 1 c x = c 1 A x = A 1 E possibile anche usare una sola soluzione standard e variare i cammini ottici fino a quando: A x = A 1 a b x c x = a b 1 c 1 c x = b 1 c 1 bxbxbxbx

17 b) Metodo diretto A x = a b c x Conoscendo il coefficiente di estinzione a (tabulato o calcolato) ed il cammino ottico b, è possibile risalire alla concentrazione c x Questo metodo implica una linearità tra assorbanza e concentrazione che andrebbe preliminarmente verificata Conc. A c) Metodo retta di taratura A1A1 c1c1 A2A2 c2c2 A3A3 c3c3 AxAx cxcx

18 d) Metodo delle aggiunte (per matrici complesse) - aggiunta singola (di analita puro) x x + a A mg x 0 a A1A1A1A1 0 AxAxAxAx A mga A1A1A1A1 2a A2A2A2A2 3a A3A3A3A3 x 0 AxAxAxAx - aggiunte multiple x x + ax + ax + ax + a x + 2a x + 3a

19 Spettri in derivata: Ottenuti tracciando la derivata della funzione A / Ottenuti tracciando la derivata della funzione A / Nella pratica non si va oltre la derivata quarta perché aumenta troppo il rumore di fondo Derivata 1 a Derivata 2 a A Spettro UV-Vis

20 Gli spettri in derivata consentono una migliore risoluzione di bande sovrapposte negli spettri normali A Spettro UV-Vis Analita 1 Analita 2 Derivata 2 a Analita 2 Analita 1

21 A A ADDITIVITA DELLE ASSORBANZE x y x + y A tot = A i = a i b c i Nel caso di due sostanze: 1 A 1 = A 1 x + A 1 y = a 1 x b c x + a 1 y b c y 2 A 2 = A 2 x + A 2 y = a 2 x b c x + a 2 y b c y 2 1

22 A Punto isosbestico: punto di intersezione degli spettri di assorbimento di specie in equilibrio Es.: HA H + + A - pH: 3.0 pH: 4.0 pH: 5.0 pH: 6.0 pH: 7.0 A is = a is b [HA] + a is b [A - ] = a is b ( [HA] + [A - ]) = a is b ( [HA] + [A - ]) = a is b c tot

23 Operazioni di taratura TRASMITTANZA ASSORBANZA 0% corpo opaco 100% bianco campioneanalitico azzeramento operazione di bianco soluzione identica al campione analitico, ma priva dellanalita Limiti di trasparenza (cut off) di alcuni solventi: Acqua nm Metanolo nm Acqua nm Metanolo nm Cloroformio nm Benzene nm Cloroformio nm Benzene nm

24 Errore fotometrico Valori ottimali di trasmittanza: % Assorbanza: ± 1.0 ± 2.0 ± 3.0 ± 5.0 ± 4.0 Trasmittanza % Errore % relativo

25 Combinazione lineare di orbitali atomici a formare orbitali molecolari (LCAO) ENE EENNEERGIARGIAEENNEERGIARGIA Assorbimento molecolare di una radiazione Per una molecola: E tot = E nucleare + E elettronica + E vibrazionale + E rotazionale + E traslazionale Assorbimento radiazioni dellUV e del visibile transizioni elettroniche Orbitale molecolare antilegante OrbitaleatomicoOrbitaleatomico legante

26 Diagramma dei livelli energetici degli orbitali molecolari ENE EENNEERGIARGIAEENNEERGIARGIA n non legante * antileganti } leganti } Scarso interesse analitico: assorbimenti nellUV lontano Es. di max per * CH 4 : 125 nm ; C 2 H 5 : 135 nm Es. di max per n * H 2 O: 167 nm ; CH 3 OH: 185 nm

27 Limitato interesse analitico; assorbimento nellUV vicino, ma con bassi valori di assorbività ( 10 2, transizioni proibite dalle cosiddette regole di selezione quanto- meccaniche) Esempio: acetone, max (esano) 279 nm, ~ 20 Esempio: acetone, max (esano) 279 nm, ~ 20 Transizioni elettroniche * Collocazione variabile: ~ nm (sistemi isolati, transizioni E o etileniche) ~ nm (sistemi isolati, transizioni E o etileniche) ~ nm (anelli benzenici, transizioni B o benzenoidi) ~ nm (anelli benzenici, transizioni B o benzenoidi) ~ nm (sistemi aromatici e/o coniugati, transizioni K o di coniugazione) ~ nm (sistemi aromatici e/o coniugati, transizioni K o di coniugazione) max (cloroformio): 466, 497 nm -carotene Transizioni elettroniche n * n *) Transizioni elettroniche n * ( R o radicaliche come quelle n *)

28 { { E0E0 E1E1 Possibili transizioni tra due livelli elettronici con sottolivelli vibrazionali e rotazionali VaporeVapore Soluzione di esano Soluzione SoluzioneacquosaSoluzioneacquosa Lunghezza donda, nm AssorbanzaAssorbanza [Skoog-West-Holler] Spettro di assorbimento della 1,2,4,5-tetrazina in tre diverse condizioni

29 Gli elettroni coinvolti in legami doppi e tripli di molecole organiche sono legati più debolmente e sono perciò più facilmente eccitabili CROMOFORI Gruppi funzionali insaturi le cui transizioni elettroniche danno luogo ad assorbimento nel visibile e nel vicino UV Cromofori più comuni: CCCCCNCOCS NNNO Sistemi aromatici in genere Ogni cromoforo ha di massimo assorbimento ( max) e coefficienti di estinzione caratteristici che variano però in funzione del solvente e della struttura molecolare complessiva CromoforoTransizione max C = O * n * n * Possibili transizioni per un carbonile

30 Fattori che influenzano il valore di - Probabilità della transizione elettronica > 10 4 probabilità elevata < 10 3 probabilità bassa - Variazione del momento dipolare legato alla transizione Lassorbimento è tanto più intenso quanto maggiore la separazione di carica nello stato eccitato - Natura del solvente - Tipo di sostituenti Influenzano sia la probabilità di transizione che la variazione del momento dipolare Effetto ipercromico: aumento del valore di Effetto ipocromico: diminuzione del valore di

31 Effetto ipsocromico (blue shift): opposto al precedente e causato dal solvente o da interruzione della coniugazione con un gruppo cromoforo o auxocromico Fattori che influenzano il valore di max Effetto batocromico (red shift): spostamento della max verso valori più alti (frequenza ed energia più basse) Possibili cause -solvente: importante la polarità coniugazione con altri cromofori -sostituenti iperconiugazione coniugazione con auxocromi Auxocromi: gruppi funzionali saturi con doppietti elettronici di non legame; la coniugazione con un cromoforo comporta generalmente un aumento sia di max che di

32 Effetti sulla transizione * delliperconiugazione e della coniugazione con auxocromi cromoforolmaxe CH 2 = CH CH 2 = CH – CH CH 3 – CH = CH – CH CH 3 – CH = C – (CH 3 ) (CH 3 ) 2 – C = C – (CH 3 ) Cl – CH = CH – Cl

33 Cromofori multipli Se non coniugati: sono additivi - max costante CH 3 CH 2 CH 2 CH=CH 2 max = 184 max = ~10,000 CH 2 =CHCH 2 CH 2 CH=CH 2 max =185 max = ~20,000 Se coniugati: - effetto batocromico - effetto ipercromico H 2 C=CH-CH=CH 2 max =217 max = ~21,000

34 energiaenergia N° doppi legami -carotene ( : ) 450 nm Etilene : ) 162 nm Butadiene ( ) 217 nm Esatriene ( ) 258 nm Distribuzione degli orbitali in dieni coniugati

35 Sistemi aromatici Si possono considerare sistemi polienici coniugati; sono caratteristici sia il comportamento chimico che spettroscopico max : 184 nm ( = ) e 204 nm ( = 7.900) (bande etileniche E 1 e E 2 ) max : 256 nm ( = 200) (banda benzenoide B a struttura fine) Solo la prima (E 1 ) non è proibita ed è infatti la più intensa benzene

36 Effetto del pH sullassorbimento È legato alla presenza di gruppi funzionali ionizzabili Esempi:

37 Assorbimento nei composti inorganici Transizioni elettroniche nei metalli di transizione (orbitali d) Caso classico: ioni complessi a struttura ottaedrica Co(NH 3 ) 6 2+ Co(H 2 O) 6 2+

38 Teoria del campo cristallino EnergiaEnergia Orbitali d (nessun legante) 0 Di solito 0 è piccolo per cui la transizione avviene per assorbimento nella regione del visibile (soluzioni colorate) (complesso ottaedrico) Orbitali d

39 Transizioni per trasferimento di carica - Transizione intramolecolare: tipica dei composti di coordinazione, ma anche di ioni quali MnO 4 -, CrO 4 2- ….; di solito consiste nel trasferimento di un elettrone dal legante al metallo Esempio 1: FeSCN 2+ Fe SCN Fe SCN. h Più raramente è lo ione metallico a cedere un elettrone al legante Esempio 2: ferroina: h

40 - Transizione intermolecolare: tipico esempio è quello del complesso I 2 -benzene in cui un elettrone oscilla tra la nuvola del benzene ed un orbitale vuoto di I 2 Un altro esempio classico è quello del complesso I 2 -amido in cui un elettrone oscilla tra la la molecola di I 2 e quella di amido che lavvolge a spirale + I 2 Soluzione Marrone scuro Amido + I 2 Soluzione blu h h

41 COLORIMETRIA E SPETTROFOTOMETRIA UV La colorimetria è limitata alla regione del visibile ed utilizza colorimetri fotoelettrici La spettrofotometria UV è più affidabile, più versatile ed utilizza spettrofotometri Caratteristiche principali: - campo di indagine esteso dal vicino UV (~ 200 nm) al vicino IR (~ 1000 nm) - condizioni di quasi monocromaticità delle radiazioni utilizzate - continuità con cui può essere variata la lunghezza donda della radiazione

42 Componenti di colorimetri fotoelettrici e spettrofotometri Selezionatore di lunghezza donda Sorgente radiante Cella Rivelatore

43 Sorgenti radianti Emettono radiazioni policromatiche contenenti cioè le lunghezze donda della regione richiesta Le sorgenti possono essere continue (a) o a righe (b) Skoog, West, Holler, Crouch

44 (nm) 3400 K 2200 K 2600 K 3000 K Intensità relativa Emissione luminosa di un corpo incandescente Regione del visibile - lampade a filamento di tungsteno (bulbo in vetro) temperatura di esercizio ~ 3000 K intervallo utile di ~ 2200 ÷ ~ 350 nm - lampade a tungsteno/alogeno (bulbo in quarzo) temperatura di esercizio ~ 3500 K intervallo utile di ~ 2500 ÷ ~ 240 nm vita media doppia rispetto alla precedente W sublimato + I 2 WI 2 (gas) W + I 2 filamento caldo si rideposita sul filamento

45 Regione dellUV - lampade a scarica elettrica in vapori di deuterio (bulbo in quarzo) intervallo utile di ~ 380 ÷ ~ 160 nm meccanismo di emissione legato alleccitazione di D 2 : E D 2 * = E D + E D + h E D e E D : energie cinetiche dei due atomi di deuterio E D + E D può variare in modo continuo tra 0 e E D 2 *, quindi anche h può farlo: il risultato è uno spettro di emissione continuo D2D2 D2*D2* D + D + h Scarica elettrica Fotone di luce - lampade a scarica elettrica in vapori di mercurio (bulbo in quarzo) spettro di emissione a righe (UV e visibile) usi analitici particolari soprattutto nella regione dellUV Gli spettrofotometri hanno quindi al loro interno due diverse lampade, una per il visibile e laltra per lUV opportunamente intercambiate. Nei modelli più recenti ununica lampada allo xenon copre tutto lo spettro (~ 200 ÷ ~ 1100 nm)

46 Selezionatori di lunghezze donda Hanno la funzione di scomporre la radiazione policromatica in bande il più possibile monocromatiche. Sono di due tipi: filtri e monocromatori. La caratteristica principale, in entrambi i casi, è lampiezza della banda passante: intervallo di radiazioni che emerge dal selezionatore con unenergia almeno pari al 50% di quella della radiazione nominale Lunghezza donda lunghezza donda nominale

47 Skoog, West, Holler, Crouch Filtri Usati nei colorimetri fotoelettrici Filtri di assorbimento: ampiezza di banda 30 ÷ 250 nm trasmittanza 5 ÷ 30% uso nel visibile (vetro) Filtri a interferenza: ampiezza di banda 5 ÷ 20 nm trasmittanza 50 ÷ 60% uso nel visibile e UV costo più elevato

48 Monocromatori Consentono di selezionare con continuità le radiazioni di qualsiasi lunghezza donda Monocromatore a prisma Quando una radiazione luminosa attraversa la superficie di separazione di due mezzi trasparenti, il raggio rifratto si piega verso la normale alla superficie se il secondo mezzo è più denso del primo. Langolo di rifrazione r è funzione della della radiazione. n 1 : indice di rifrazione dellaria n 2 : indice di rifrazione del prisma i : angolo di incidenza r : angolo di rifrazione

49 Schema ottico di un monocromatore a prisma fenditura di ingresso lente collimatrice prisma lente focalizzatrice fenditura di uscita 1 2 S sorgente

50 50 Scomposizione spettrale operata da tre diversi tipi di monocromatori N.B. : nel visibile, il prisma di vetro è preferibile a quello di quarzo (maggiore dispersione)! assorbimento nm prisma di vetro 200 nm prisma di quarzo nm monocromatore a reticolo

51 Sorgente radiante Sorgente radiante frange di diffrazione ordine zero Sorgente radiante Immagine di una fenditura di larghezza variabile su uno schermo illuminato con luce monocromatica Fenomeno della diffrazione

52 Interferenza costruttiva e distruttiva di una radiazione monocromatica intensità tempo Onde in concordanza di fase Onde in opposizione di fase A A 2A

53 m Monocromatori a reticolo di diffrazione Sono di due tipi: reticoli di trasmissione e reticoli di riflessione Reticoli di trasmissione Costituiti da sottilissime fenditure (600 ÷ 2000/mm) incise su una superficie rivestita di alluminio. Ampiezza delle fenditure e distanza sono dello stesso ordine di grandezza delle radiazioni incidenti. Comportamento delle radiazioni in un reticolo di trasmissione a m = passo del reticolo a = m sen Le radiazioni si sommano solo se: m sen (K = 0, 1, 2, 3…..)

54 Diffrazione di luce policromatica Sorgente radiante frangia di ordine zero: luce bianca Spettro del 1° ordine Ovviamente nello spettro del 1° ordine, come di quelli successivi, sono da includere anche le radiazioni appartenenti a regioni diverse dal visibile!

55 Dispersione di luce bianca attraverso un reticolo di trasmissione Gli spettri dei vari ordini sono tutti lineari in funzione della lunghezza donda, cioè la dispersione è costante in tutte le zone dello spettro! Cozzi, Protti, Ruaro

56 Reticoli di riflessione Costituiti da una serie di solchi (100 ÷ 2000/mm) tracciati sopra una superficie riflettente, piana o concava. I reticoli più comuni sono quelli a gradini: In questo caso, sono i raggi riflessi a dar luogo ai fenomeni di interferenza costruttiva o distruttiva del tutto simili a quelli ottenuti con i reticoli di trasmissione Esempio di diffrazione osservabile guardando con luce radente un comune compact disc!

57 Cellette di assorbimento (cuvette) Hanno la funzione di contenere la soluzione in esame e quella del riferimento Hanno volume variabile e spessore (cammino ottico) che può variare da pochi mm ad alcuni cm (di solito 1 cm) Cuvette in vetro o materiale plastico (polistirene, metacrilato) visibile Cuvette in quarzoUV, visibile

58 Rivelatori Sono trasduttori che convertono lenergia radiante in corrente elettrica misurabile con un galvanometro. La corrente elettrica che si genera è direttamente proporzionale allintensità della radiazione luminosa. Relazione di Einstein per leffetto fotoelettrico: h = E 0 + ½ mv 2 energia fotone potenziale ionizzazione del metallo Energia cinetica dellelettrone Fototubi e fotomoltiplicatori Il loro funzionamento si basa sulleffetto fotoelettrico

59 Fototubi Il catodo è ricoperto da uno strato di materiale fotoemissivo (generalmente cesio) Skoog, West, Holler, Crouch Involucro di vetro o quarzo sotto vuoto Catodo Anodo a filamento Fascio di fotoni elettroni 90 V Amplificatore e misuratore

60 Fotomoltiplicatori Simili ai fototubi ma molto più sensibili. Si basano sul fenomeno dellemissione secondaria. Producono correnti 10 5 ÷ 10 7 volte più intense di quelle di un fototubo per cui possono essere usati solo per misure di bassi valori di intensità luminosa! Skoog, West, Holler, Crouch Griglia Radiazione Catodo fotoemissivo Dinodi D1-D9 Numerosi elettroni per ogni fotone Numerosi elettroni per ogni elettrone Involucro di quarzo Anodo Sezione trasversale Dinodi Catodo Anodo 90 V 900 V Involucro di quarzo Amplificatore Lettura

61 Rivelatori a serie di fotodiodi (DAD) Fotodiodo: dispositivo costituito da una giunzione tra un semiconduttore di tipo p ed uno di tipo n Semiconduttore: materiale la cui conducibilità elettrica è intermedia tra quella di un conduttore (metallo) e quella di un isolante Si Esempio: silicio cristallino La conducibilità elettrica è legata alleccitazione termica di un elettrone (di conduzione) che lascia una lacuna positiva anchessa mobile come lelettrone

62 Semiconduttore di tipo n: semiconduttore drogato con eccesso di elettroni di conduzione Skoog, West, Holler, Crouch Esempio: silicio cristallino drogato con un elemento del V gruppo (As) Semiconduttore di tipo p: semiconduttore drogato con eccesso di lacune elettroniche Esempio: silicio cristallino drogato con un elemento del III gruppo (Ga)

63 Skoog, West, Holler, Crouch Schema di un fotodiodo al silicio Giunzione pn Contatto metallico Buca Elettrone Conduttore Regione p Regione n Regione pRegione n Polarizzazione diretta Polarizzazione inversa Regione pRegione n Strato di deplezione Le condizioni di polarizzazione inversa sono quelle utilizzate nei rivelatori DAD

64 Schema ottico di uno spettrofotometro con rivelatore DAD Acquisizione dello spettro in tempo reale! La sensibilità del DAD è intermedia tra quella di un fototubo e quella di un fotomoltiplicatore. Skoog, West, Holler, Crouch Sorgente Otturatore Specchio Cella Specchio Reticolo di diffrazione Fenditura Serie di fotodiodi

65 Schema ottico di spettrofotometro a raggio singolo Sorgente h Monocromatore Schermo Cuvetta di riferimento Cuvetta del campione Rivelatore A mplificatore Lettore I0I0 Schema ottico di spettrofotometro a doppio raggio nello spazio Skoog, West, Holler, Crouch Sorgente Monocromatore Schermo Cuvetta di riferimento I I0I0 Cuvetta del campione Rivelatore 1 Rivelatore 2 A mplificatore differenziale Lettore Beam splitter Specchio h

66 Schema ottico di spettrofotometro a doppio raggio nel tempo Skoog, West, Holler, Crouch Sorgente h Monocromatore Cuvetta di riferimento Cuvetta del campione Specchio Trasparente Specchio a settori Motore Vista frontale Specchio Cuneo ottico Specchio a settori Rivelatore Amplificatore Lettore I I0I0

67 Titolazioni spettrofotometriche Si misura lassorbanza di una soluzione ad una lunghezza donda opportuna dopo laggiunta di incrementi noti di titolante. AAA VVV A + B C A = C = 0 B > 0 B = C = 0 A > 0 A = B = 0 C > 0 0 Celletta per titolazioni spettrofotometriche agitatore foro per buretta finestre di quarzo

68 A V 0 AA VV A = 0 B > C > 0 C = 0 A > B > 0 A = 0 C > B > 0 Per ridurre leffetto della diluizione, si impiegano soluzioni concentrate di titolante o si correggono i dati sperimentali: Assorbanza corretta = Assorbanza osservata Volume totale Volume iniziale

69 Analisi quantitativa in assorbimento La spettrofotometria di assorbimento nel visibile e nellUV è una delle tecniche di più ampio utilizzo nellanalisi quantitativa strumentale. Caratteristiche salienti: Ampia applicabilità Alta sensibilità (fino a M) Selettività da moderata ad alta Buona accuratezza Facilità e convenienza

70 Saggi immunologici: si basano sulluso di anticorpi specifici per lanalita (proteina) SAGGIO IMMUNO-ENZIMATICO ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Lenzima può trasformare, ad es., un reagente incolore in prodotto colorato (dosaggio colorimetrico) oppure un reagente non fluorescente in prodotto fluorescente (dosaggio fluorimetrico). La quantità di prodotto colorato o fluorescente ottenuto è proporzionale alla concentrazione di analita. Esempio di applicazione della spettrofotometria in campo biologico

71 FLUORIMETRIA E un metodo di analisi basato sul fenomeno della fluorescenza. Fluorescenza: processo nel quale gli atomi o le molecole, eccitate mediante assorbimento di radiazioni elettromagnetiche, rilassano allo stato fondamentale cedendo leccesso di energia come fotoni. Lemissione di radiazioni fluorescenti avviene a lunghezze donda maggiori (frequenza ed energia minori) rispetto alle radiazioni assorbite (spostamento o shift di Stokes) Skoog, West, Holler, Crouch

72 La fluorescenza è possibile solo in presenza di cromofori con particolare distribuzione dei livelli energetici (fluorofori). Le transizioni elettroniche coinvolte sono sempre le stesse: * n * Molti composti fluorescenti contengono anelli aromatici specie se condensati. La fluorescenza è inoltre particolarmente favorita in molecole rigide. Ad esempio: Trans-stilbene (fluorescente) Cis-stilbene (non fluorescente) Fluoresceina (fluorescente) Fenolftaleina (non fluorescente)

73 La fosforescenza è un fenomeno simile alla fluorescenza. Per capirne la differenza occorre prendere in considerazione gli stati di singoletto e tripletto: Nello stato fondamentale le molecole sono generalmente nello stato di singoletto (spin elettronici appaiati). Nello stato eccitato possono assumere invece sia lo stato di singoletto che di tripletto (coppia di spin elettronici spaiati). Fluorescenza singoletto eccitato singoletto fondamentale Transizione probabile e rapida (< sec) Fosforescenza tripletto eccitato singoletto fondamentale Transizione poco probabile e più lenta (> sec) Skoog, West, Holler, Crouch

74 Analisi fluorimetrica Spettri di eccitazione: Eccitazione a variabile Misurazione intensità di fluorescenza a fissa (di solito max ) In teoria, spettri di assorbimento e di eccitazione dovrebbero coincidere Spettri di emissione: Eccitazione a fissa (di solito max ) Misurazione intensità di fluorescenza a variabile In genere, spettri di emissione e di eccitazione appaiono come immagini speculari luno dellaltro

75 Skoog, West, Holler, Crouch Esempio: spettro di eccitazione (a) e spettro di emissione (b) dellantracene in etanolo antracene stato fondamentale stato eccitato stato fondamentale stato eccitato

76 Effetto della concentrazione sullintensità di fluorescenza E possibile dimostrare che: I f = S F I 0 (1 – 10 –abc ) I f = intensità radiazione fluorescente I 0 = intensità radiazione di eccitazione a = coefficiente di estinzione alla di eccitazione b = spessore della soluzione (cammino ottico) c = concentrazione della soluzione S = costante di proporzionalità ( 1) legata allefficienza quantica del campione (rapporto tra fotoni emessi e fotoni assorbiti) F = costante di proporzionalità ( 1) legata alla resa strumentale (rapporto tra fotoni misurati e fotoni emessi)

77 Fattori che determinano la non linearità tra I f e concentrazione: diminuzione di I 0 nellattraversamento della soluzione differente assorbimento della stessa radiazione fluorescente in funzione del cammino ottico percorso Solo per soluzioni molto diluite si ha con buona approssimazione: I f = SFI 0 abc I f = K c I f = S F I 0 (1 – 10 –abc ) concentrazione SFI 0 IfIf Skoog, West, Holler, Crouch

78 Autospegnimento (self-quenching) Una molecola di analita assorbe energia da unaltra molecola di analita eccitata con trasferimento di energia non radiante che alla fine viene dissipata sotto forma di calore. Aumenta con la concentrazione. Autoassorbimento Si verifica quando la di emissione si sovrappone ad una banda di assorbimento. Aumenta anchessa con la concentrazione. Nellanalisi quantitativa occorre assicurarsi dellassenza di quenching! Processi di spegnimento (quenching) Processi nei quali lemissione da parte di una molecola eccitata diminuisce in intensità a causa del trasferimento di energia ad unaltra molecola (spegnitore o quencher). Lo spegnitore eccitato può quindi dissipare la sua energia attraverso altri processi. Un esempio tipico di quencher è rappresentato da O 2 : M* + O 2 M + O 2 * molecola allo stato eccitato tripletto fondamentale singoletto eccitato molecola allo stato fondamentale

79 Fluorimetri e spettrofluorimetri La differenza sta nel selezionatore di radiazioni elettromagnetiche: filtri per i fluorimetri, reticoli di diffrazione per gli spettrofluorimetri. Sorgenti radianti Devono produrre radiazioni di elevata energia (lintensità di fluorescenza, come già visto, è funzione dellintensità di eccitazione) concentrata nellUV: lampade a vapori di Hg o lampade allo xenon. Selezionatori di Sono normalmente due (filtri o reticoli), uno per il lato di eccitazione e laltro per quello di emissione. Rivelatori E indispensabile limpiego di fotomoltiplicatori a causa dei bassi livelli di energia tipici dellemissione fluorescente.

80 Lemissione fluorescente è prelevata di solito a 90° rispetto al raggio incidente. Vantaggi: rivelazione della sola radiazione di fluorescenza (e non eventualmente di quella di eccitazione) maggiore intensità di fluorescenza emessa dai primi strati della soluzione del campione Schema ottico di uno spettrofluorimetro Skoog, West, Holler, Crouch

81 Applicazioni della fluorimetria Pur se di uso meno esteso rispetto alla spettrofotometria, la fluorimetria può essere applicata a numerosi composti sia organici che inorganici. Per questi ultimi si ricorre ad agenti complessanti come ad esempio: Skoog, West, Holler, Crouch Vantaggi dellanalisi fluorimetrica: selettività potenzialmente superiore alla spettrofotometria sensibilità superiore alla spettrofotometria ottenuta aumentando la potenza I 0 delle radiazioni di eccitazione (limite di rivelabilità M) I f = S F I 0 (1 – 10 –abc ) mentre A = abc = - log T = - log I 0 /I


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