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GENETICA FORWARD E REVERSE Obiettivo: assegnare una funzione ad ogni gene principali strategie sistematiche per risalire alla funzione di un gene nelle.

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Presentazione sul tema: "GENETICA FORWARD E REVERSE Obiettivo: assegnare una funzione ad ogni gene principali strategie sistematiche per risalire alla funzione di un gene nelle."— Transcript della presentazione:

1 GENETICA FORWARD E REVERSE Obiettivo: assegnare una funzione ad ogni gene principali strategie sistematiche per risalire alla funzione di un gene nelle piante. Sebbene molte delle tecniche descritte sono utilizzate esclusivamente in ambito vegetale, le strategie generali possono essere generalizzate anche ad altri sistemi. Il metodo classico per determinare la funzione di un gene si basa sulla ricerca e interpretazione di mutazioni in quel gene. Questo metodo si basa sulla mutagenesi sistematica delle sequenze geniche e produce collezioni di mutazioni (prevalentemente recessive) di tipo loss of function. La caratterizzazione genetica e funzionale di queste mutazioni riesce, in molti casi, ad assegnare una funzione al gene in analisi. A partire da questa informazione si risale alla sequenza genica, utilizzando varie tecniche di clonaggio. Questo approccio che parte dalla funzione per risalire al gene è noto come genetica diretta (forward genetics).

2 La grande disponibilità di sequenze geniche conseguenti alla diffusione delle tecniche di sequenziamento del DNA e, specialmente, i grandi progetti di sequenziamento genomici, hanno rivoluzionato lapproccio alla determinazione della funzione di un gene. Frequentemente oggi si fa il percorso contrario; si parte da una sequenza genica ben caratterizzata e si risale alla sua funzione. Per esempio è possibile generare piante transgeniche ed esprimere il gene in versione senso o antisenso, per studiarne il fenotipo e, da questo, cercare di dedurre la funzione del gene. Formalmente questo significa generare mutazioni (dominanti) di tipo gain of function Allo stesso scopo, ma in maniera più sistematica, è possibile analizzare apposite librerie di mutanti per identificare tutti i mutanti di un gene dinteresse e conoscerne i fenotipi mutanti. Questo approccio che parte dal gene per risalire alla funzione è nota come genetica inversa (reverse genetics).

3 Gene Funzione??? Gene Funzione Fenotipo??? mutante T-DNA Fenotipo FORWARD REVERSE PCR-screening

4 Strategie molecolari per studiare la funzione di un gene nelle piante X Knock Out del gene..... genetica forward genetica reverse Aumento espressione del gene endogeno: forte costitutiva ectopica inducibile Riduzione/silenziamento del gene endogeno: AntiSENSO RNAi co-soppressione,

5 Strategie genetiche per studiare la funzione genica Inattivazione di un gene per identificare e caratterizzare un fenotipo Non tutti i geni sono mutagenizzabili perché: geni funzionalmente ridondanti (geni a funzione simile ma non omologhi) (ridondanza strutturale v/s ridondanza funzionale) geni coivolti in diverse fasi dello sviluppo, e mutazioni in tali geni possono causare fenotipi letali o pleiotropici

6 mutagenesi sito-specifica v/s mutagenesi inserzionale random Nelle piante No mutagenesi sito-specifica !!!!! Knock Out del gene..... Quindi mutagenesi inserzionale random

7 a) T-DNA mutageno inserzionale che produce inserzioni stabili no hot spots di integrazione Strategie di Mutagenesi Inserzionale b) Trasposoni il trasposone può essere exciso dal gene inattivato (reversione del fenotipo = complementazione) eventi di trasposizione avvengono in zone limitrofe al sito di inserzione

8 Transposon tagging Il sistema Ac/Ds (agente in trans) Elementi Ac : (4563 bp) codificano per una trasposasi Elementi Ds : corrispondono ad elementi Ac deleti della trasposasi Caratteristiche del sistema Ac/Ds in mais: contiene delle IR di 11-bp alle estremità, essenziali codifica per una proteina di 92kDa con attività di trasposasi 101 aa N-ter non necessari per la trasposizione circa 200 bp ad ogni estremità sono necessari per la trasposizione la trasposasi lega un esamero AAACGG dopo trasposizione vengono generati dei DR di 8-bp altri residui di DNA vengono lasciati a seguito della trasposizione gli elementi DS sono deleti o della trasposasi o delle IRs

9 Transposon tagging Barbara Mc Clintock è stato il 1°scienziato a predirre che i trasposoni, elementi genetici mobili, erano presenti nei genomi eucariotici. Lei ha isolato il sistema Ac/Ds da mais. Il sistema Ac/Ds è stato utilizzato in Arabidopsis x generare collezioni di mutanti. La bassa attività dellelemento Ac, è stata aumentata usando la trasposasi sotto il 35S. Cmq la frequenza di reinserzione dellelemento Ac è relativamente bassa. Ciò puo anche dipendere da successive trasposizioni dellelemento, dovuto a mancato controllo dellattività di trasposizione. Unalternativa a ciò è luso della trasposasi sotto controllo di un promotore HS. Elementi trasponibili isolati da mais e Antirrhinum sono utilizzati in altre specie nelle quali risultano assolutamente attivi.

10 Evitare mutazioni indesiderate (dovute allevento di trasformazione).Cosi la mutagenesi è separata dalla trasformazione perchè la trasposasi ed il trasposone/T-DNA (Ds)sono trasformati in 2 diverse piante. La trasposizione avviene solo in seguito allincrocio tra le due linee. Ottenere mutazioni stabili che possono revertire. Una mutazione causata da un trasposone inerte è stabile finchè il trasposone non è mobilizzato da una trasposasi, in seguito a reincrocio. Quando il trasposone salta lascia il footprint, ma il fenotipo PUO comunque revertire. Ottenere nuove mutazioni. Quando il trasposone salta e lascia il footprint questo può causare una nuova mutazione (frameshift, inserzioni aminoacidiche) Taggare il gene dinteresse x inserzione. I trasposoni di tipo Ac fanno trasposizioni short-range. Identificando una linea con trasposone inerte che mappa vicino al gene dinteresse, si mobilizza il trasposone x incrocio con la trasposasi e si seleziona il salto nel gene. Vantaggi del Transposon Tagging

11 T-DNA tagging Inserzione del T-DNA nel genoma vegetale mediante una illegitimate recombination No hot spots di integrazione Distribuzione random sui 5 cromosomi di Arabidopsis Produzione di >18000 FSTs (Flanking Sequence Tags) x analisi dei T- DNA IS RISULTATI 40% delle integrazioni sono in geni Nessuna categoria di geni è particolare bersaglio di integrazione FSTs più frequenti negli introni che negli esoni (43FSTs/Mb v/s 33FSTs/Mb) LB spesso integrato full-length, mentre RB risulta spesso troncata Coinvolgimento di microsimilarità tra LB e la sequenza vegetale preIS Integrazione influenzata anche dalla composizione nucleotidica Preferenza per regioni T-rich (i.e. promotori e introni)

12 Mutagenesi inserzionale genomica Quante linee bisogna produrre per saturare il genoma? Calcolo teorico: Il T-DNA si inserisce nel genoma seguendo una distribuzione di Poisson, quindi…… F (geni con almeno 1 inserzione= saturazione) = 1 - e -m dove m rappresenta il numero medio di eventi per gene, i.e. m = numero di inserzioni indipendenti/numero di geni Se:1.5 T-DNA locus per line 75/85% saturazione con T-DNA lines Ma noi evidenziamo solo inserzioni in regioni codificanti, quindi ….CORREZIONE! 95% saturazione con circa linee indipendenti

13 Strategia di Isolamento Mutanti Analisi dei mutanti Kana resistenti Propoagazione di piante omo ed eterozigoti T2 Raccolta semi T2 Analisi in vitro delle plantule Kr Ks Kr Autoimpollinazione Selezione in serra dei trasformanti T1 Basta resistenti Raccolta semi T1 In Planta Vacuum Infiltration T0

14 Knockology

15 Analisi di segregazione del marcatore e del fenotipo mutante (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) Analisi PCR su moooooolti mutanti (es. mutante con fenotipo letale, non è possibile ctrl la resistenza a Kana) Clonaggio delle Flanking Sequences

16 T2 Plantsaa(Kr/Kr)Aa(Kr/Ks) AA(Ks/Ks) Total T3 Plants xy1(Kr)WT(Kr/Ks)Ks Total a b c Analisi di segregazione e autoimpollinazione

17 Analisi di segregazione del marcatore e del fenotipo mutante (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) Analisi PCR su moooooolti mutanti (es. mutante con fenotipo letale, non è possibile ctrl la resistenza a Kana) Clonaggio delle Flanking Sequences Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato???

18 GUS nos3 ocs3 KanR Pnos Erbic R 35S RBLB E.RV 0,23 4,4 Digestione EcoRV: 0.23 Kb e 4,4 Kb interne al T-DNA x Kb fino al sito EcoRV sul DNA vegetale x

19 NT Caratterizzazione Molecolare del sito di inserzione 0,23 Kb 4,4 Kb 1,8 Kb RB-LB IR 1,2 Kb RB-RB DR

20 Analisi di segregazione del marcatore e del fenotipo mutante (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) Clonaggio delle Flanking Sequences Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? Analisi PCR su moooooolti mutanti (es. mutante con fenotipo letale, non è possibile ctrl la resistenza a Kana)

21 Estrazione DNA dai singoli mutanti (da seme/embrione se il fenotipo è letale) PCR con oligo specifici per il T-DNA: Kana, RB, LB, Basta Analisi per PCR Analisi dei prodotti di PCR su gel/Southern blotting

22 Analisi di segregazione del marcatore e del fenotipo mutante (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) Analisi PCR su moooooolti mutanti (es. mutante con fenotipo letale, non è possibile ctrl la resistenza a Kana) Clonaggio delle Flanking Sequences Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato???

23 - Plasmid Rescue Strategie di clonaggio delle Flanking Sequences - Inverse PCR (IPCR) - Libreria genomica da DNA mutante, con screening con sonda T-DNA

24 T-DNA Kana GUS XX Digestione T-DNA XX Ligazione intramolecolare T-DNA X Trasformazione E.coli Ori Amp Selezione colonie AmpR, su LB+Amp X X

25 - Plasmid Rescue - Inverse PCR (IPCR) - Libreria genomica da DNA mutante, con screening con sonda T-DNA Strategie di clonaggio delle Flanking Sequences

26 T-DNA Kana GUS X X Digestione T-DNA XX Ligazione intramolecolare T-DNA X PCR CC

27 - Plasmid Rescue - Inverse PCR (IPCR) - Libreria genomica da DNA mutante Strategie di clonaggio delle Flanking Sequences

28 Digestione del DNA genomico mutante (omozigote) o di plantula Kana R (eterozigote) con enzimi adeguati x il clonaggio Clonaggio del DNA genomico così digerito, in vettori x librerie genomiche (, cosmidi) Trasformazione (per elettroporazione) di cellule competenti di E.coli Screening della libreria genomica con sonda T-DNA (Kana, RB, LB, Basta) Isolamento dei cloni positivi, sequenza delle FS Amplificazione delle FS x utilizzarle come sonda su una libreria genomica/cDNA WT Libreria genomica da DNA mutante Isolamento della copia WT del gene/cDNA che, inattivato, è responsabile del fenotipo

29 Il fenotipo mutante dipende dallinserzione del T-DNA, cioé dallinattivazione del gene X ??? DIMOSTRAZIONE FORMALE: COMPLEMENTAZIONE!!!!!!! Complementazione: Trasformazione della pianta mutante con una copia del gene WT, al fine di restaurare la funzione mancante p35S::cDNAX pX::cDNAX pX::geneX

30 Un esempio: I mutanti pasticcino

31 T-DNA RB GUSLB VSNE XNENXSEB V N N X pas1 WT

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