I batteri I batteri sono procarioti, microrgamismi unicellulari dotati di parete in cui il materiale genetico non e’ organizzato in un nucleo. Le loro.

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1 I batteri I batteri sono procarioti, microrgamismi unicellulari dotati di parete in cui il materiale genetico non e’ organizzato in un nucleo. Le loro cellule coesistono di citoplasma che contiene DNA e ribosomi 70S La costituente base della parete e’ il peptidoglicano o mureina, polimero di catene di NAG e NAM unite da ponti trasversali peptidici Una specie batterica e’ piuttosto un gruppo di individui batterici che condividono alcune caratteristiche fenotipiche e genotipiche Quando un ceppo batterico infetta una pianta e altri ceppi della stessa specie no, prende il nome di pathovar di quella specie

2 La parete n Strato peptidoglicano
La mureina costituisce solo il 5-10% del totale Sulla parete esterna ci sono gli LPS, lipopolisaccaridi (antigenici) – antigene O Capsula – strato mucoso (polisaccaridi), antigeni K Flagelli – antigeni H (flagellina) - altre appendici peli e fimbrie protoplasma Membrana plasmatica Membrana esterna capsula EPS Repeating unit n Lipid A O-specific side chain Core region Outer membrane

3 Caratteristiche dei batteri fitopatogeni
Sono circa 100 le specie di batteri fitopatogeni, alcuni dei quali sono saprofiti facoltativi, anche se i FVLB (fastidious vascular limited bacteria) sono difficili da crescere in coltura (xylella) Le malattie batteriche sono particolarmente comuni e severe ai tropici ma con le condizioni favorevoli possono crescere ovunque La maggior parte dei batteri ha forma bastoncellare, l’unica eccezione e’ rappresentata da streptomyces che e’ filamentoso A seconda della disposizione e del numero dei flagelli abbiamo batteri Monotrichi –1 solo flagello Polari – flagelli alle 2 estremita’ Peritrichi – distribuiti sull’intera superficie Quando ad un singolo batterio cresce in un mezzo produce una colonia

4 Riproduzione I batteri fitopatogeni bastoncellari si riproducono asessualmente mediante il processo di scissione binaria o fissione. Questa avviene mediante: crescita verso l’interno della membrana cellulare formando una membrana trasversale che divide il citoplasma in due parti uguali. Due strati di parete cellulare continui con la parete esterna sono poi sintetizzati tra i due strati di membrana In condizioni favorevoli i batteri si dividono ogni min, in tal modo da 1 batterio se ne possono formare 106 in un giorno Come si produce la variabilita’ nei batteri? Nella riproduzione asessuale, che avviene per mitosi, si ha una bassa percentuale di variazione di informazione genetica, che e’ dovuta principalmente a fenomeni di errori di replicazione e a rari eventi di crossing over mitotico Nei batteri pero’ esistono dei meccanismi di variabilita’ attraverso processi pseudo- sessuali La coniugazione. Richiede contatto tra 2 batteri diversi che scambiano materiale genetico (plasmidi) mediante il tubetto coniugativo La trasformazione. Processo in cui una porzione di DNA libero e’ acquisito da una celula batterica in disfacimento ed e’integrato nel genoma ricevente Trasduzione. Un batteriofago compie un ciclo litico in una cellula e acquisice parte del suo genoma e poi lo introduce in un’altra cellula durante un ciclo lisogeno

5 Ecologia La maggior parte dei batteri patogeni si sviluppano nell’ospite come parassiti, sulla superficie delle gemme come epifiti e in parte nei residui vegetali nel suolo Altri patogeni, come Erwinia amilovora, si riproducono solo nell’ospite, infatti questi tipi di patogeni hanno sviluppato dei cicli pianta-pianta grazie agli insetti Alcuni patogeni come l’Agrobacterium, Ralstonia, e Streptomyces sono invece dei veri e propri “soil inhabitants” Molti batteri patogeni sono dei soil invaders, ovvero che invadono i tessuti dell’ospite presenti nel suolo. Data la loro scarsa abilita’ saprofitica sono degli scarsi competitori e quindi permangono nel suolo solo fino a quando sono disponibili i tessuti dell’ospite I batteri possono anche sopravvivere nei semi, in altre parti della pianta, negli insetti del suolo La dispersione dei batteri avviene attraverso l’acqua, gli insetti e altri animali, infatti anche se molti posseggono dei flagelli hanno una limitata capacità di movimento Gli insetti sono sia trasportatori che vettori, infatti depongono i batteri in siti dove e’ facile un loro sviluppo

6 Ciclo delle batteriosi
Sorgente d’inoculo Organi infetti, residui della vegetazione, materiale di propagazione infetto, piante spontanee, insetti, terreno (a parte qualche caso come R. solanacearum, i batteri fitopatogeni non sono buoni competitori Esigenze termiche Sono mesofili min 10C-opt 25C- max 35C Penetrazione Mai diretta sempre per ferite od aperture naturali (stomi, idatodi,acqua di guttazione, lenticelle, nettarii) Alla penetrazione segue sempre una fase di ancoramento alla superficie esterna delle cellule ospiti e una fase di moltiplicazione attiva (che s’interrompe precocememente nelle combinazioni incompatibili) Periodo d’incubazione: da 48 ore a 2 mesi Invasione Si puo’ avere l’invasione attraverso i vasi od attraverso il parenchima, da cellula a cellula o attraverso entrambe le vie, abbiamo pertanto Batteriosi vascolari: avvizzimento Batteriosi parenchimatiche: machie fogliari Batteriosi sistemiche: si trasmettono per fasci e colonizza anche i parenchimi Batteriosi iperplastiche Evasione Emissione di flussi mucillaginosi in condizioni di alta’ umidita’ relativa, a volte non c’è evasione e i batteri restano quiescenti sui e nei semi

7 Controllo delle malattie batteriche
Le malattie batteriche sono molto difficili da controllare Spesso una combinazione di diverse misure di controllo è richiesta per combattere una data malattia batterica Pratiche sanitarie rivolte a ridurre l’inoculo in un campo possono essere effettuate rimuovendo e bruciando piante o rami infetti Regolando le fertilizzazioni e l’irrigamento L’uso di varieta’ resistenti a certe malattie batteriche è uno dei metodi migliori per controllare le malattie Il suolo infestato con i batteri fitopatogeni possono essere sterilizzati con vapore o con calore e con sostanze chimiche come la formaldeide I semi quando infettati superficialmente possono essere sterilizzati usando HCl o ipoclorito di Na oppure portati a 52°C per 20 min La lotta chimica ai batteri e’ di solito meno efficace di quella ai funghi. Comunque vengono usati Poltiglia bordolese (CuSO4+CaOH), rame, CuOH per il controllo dei bacterial leaf spots Zineb, maneb o mancozeb mischiati con rame per il controllo delle malattie su piante giovani Lotta biologica trattamento di tuberi, semi e altro con batteri antagonisti

8 Batteri fitopatogeni Agrobacterium Erwinia Pseudomonas
I batteri hanno forma bastoncellare di circa 1,5-3 mm, hanno 1-4 flagelli peritrichi Quando vengono cresciuti in terreni ricchi in carboidrati producono una capsula polisaccaridica Sono abitanti del suolo e della rizosfera Erwinia Bastoncellari di 1-3 mm e mobili attraverso diversi flagelli peritrichi Sono gli unici anaerobici facoltativi Alcune specie non producono enzimi idrolitici e causano necrosi o avvizzimenti (amilovora) altrihanno una forte attivita’ pectolitica e causano marciumi molli (carotovora) Pseudomonas Bastoncellari di 1,5-4 mm con 1 o più flagelli polari Sono soil inhabitants e si trovano anche in ambiente acquatici Producono un pigmento fluorescente giallo-verde

9 Bacterial spots and blights
I più comuni tipi di malattie batteriche delle piante sono quelle che appaiono come spots di diversa taglia sulle foglie, fusti, bocciuoli e frutti In alcune malattie le macchie continuano ad avanzare rapidamente e diventano blights “bruciature”, le macchie sono necrotiche, circolari e in qualche caso sono circondate da un alone giallognolo Nelle piante dicotiledoni i bacterial spots in qualche ospite sono limitati alle venature piu’ grandi e le macchie appaiono angolari, e per lo stesso motivo nelle monocotiledoni appaiono come strisce Tutti gli spot e i blights delle foglie, dei fusti e dei frutti sono causate dai batteri del genere Pseudomonas e Xanthomonas

10 Wildfire del tabacco L’agente causale del colpo di fuoco del tabacco, Pseudomonas syringae pv. Tabaci (Gram-), ha una distribuzione ubiquitaria Causa perdite sia nei semenzali che in campo. Le plantule infette possono essere uccise. Se invece vengono colpite le piante adulte in campo possono avere una consistente perdita del fogliame o presentare delle foglie commercialmente non sfruttabili Una zona acquosa che separa il tessuto marcescente dal tessuto sano è il primo sintomo della malattia Le foglie sviluppano delle macchie giallognole di 1 cm in cui il centro diventa marrone ed e’ circondato da un alone giallo. Le macchie coalescono e formano larghe aree morte in pochi giorni Il batterio produce una tossina, la tab-tossina, che da sola e’ in grado di produrre le lesioni

11 Il ciclo della malattia

12 Il tumore del colletto Agente causale: Agrobacterium tumefaciens (Gram-) Le galle provocate da questo batterio sono maligne: una volta che le cellule sono state indotte a dividersi ed alrgarsi esse continuano a dividersi senza piu’ obedire ai controlli ormonali Primo sintomo: piccole escrescenze sullo stelo o sulle radici Originandosi in una ferita vengono confuse con il callo (proliferazione di cellule indifferenziate) Le cellule tumorali diventano indipendenti dal batterio e continuano a crescere e a dividersi anche in assenza del batterio Le cellule tumorali contengono piu’ alte quantita’ di IAA e citochinine Il controllo inizia con una spedizione dei semenzali Dato che il batterio penetra solo attraverso ferite fresche si devono evitare pratiche colturali invasive e presenza di insetti maceranti

13 Il ciclo della malattia

14 T-DNA insertion into plant cell
bacterial sec system

15 Bacterial secretion Function - protection (secretion of toxins / enzymes - virulence factors) - transport of cell surface, cell wall, cell membrane proteins - communication Mechanisms - differ between Gram-negative and Gram-positive bacteria Experimental approaches to study bacterial secretion Describe bacterial secretory mechanisms Role of secretory processes in pathogenesis - Type III (Type IV)

16 Bacterial protein secretion
Gram-negative - translocation past the cytoplasmic / periplasm / outer membrane Gram-positive - translocation cytoplasmic membrane / cell wall

17 Gram-negative secretion
Type I - ATP-binding cassette (ABC) transporter Type II - general pathway (Sec-dependent) - major secretory pathway Type III - contact-dependent translocation into eukaryotic cells Type IV - (Sec-like dependent) - translocation of DNA / protein complex Type V - auto-transporter (Sec-dependent) - includes b-pore forming domain Type VI – an intracellular membrane-attached contractile phage tail ~ Tat - (twin arginine transport) - moves folded proteins across CM SRP- (signal recognition particle) (Sec-dependent) - used for CM proteins

18 Gram-negative - Type I secretion (ABC secretion)
Properties: - ATP-binding cassette transporter (also in eukaryotes) - Single step traversal across CM and OM - Signal sequence at C-terminus - is not removed - ABC channel transmembrane helices - Accessory factor - bridges periplasmic space - Post-translationally coordinated synthesis-translocation protein - GGXGSD ABC transporter accessory factor (MFP) Genes fused or coordinately expressed on operon: Outer membrane transport may not be linked ATP ADP N C OM P CM accessory factor Type I secreted proteins: RTX toxin (repeat in toxin) E. coli hemolysin bacteriocins metalloproteases

19 Gram-negative - Type II secretion
Two step process: Step 1 - Transfer across cytoplasmic membrane - Leader (signal) peptide (18-26 aa) - SecA - binds leader (L), inserts in CM channel (requires ATP) - SecB - cytosolic chaperone (keeps unfolded) SecYEG - CM channel complex post-translational translocation signal peptidase leader peptide N hydrophobic C mature protein N C SecB L SecY,E,G ( pathway/map/map03090.html) Sec-dependent secretory pathway

20 Gram-negative - Type II secretion
Step 2 - Transfer through periplasm / outer membrane transfer Periplasm: Protein folded into final structure & complex - signal peptide removal - chaperone-mediated protein folding - disulfide bond formation - oligomerization - proline isomerization OM P Sec Outer membrane translocation: Protein - bacteria specific mechanisms - Secreton - homology to pilus components - Secretins - homology to phage OM proteins - driven by PMF (?ATP) CM ATP ADP Type II secreted proteins: Majority of virulence factors - pullulanase - AB toxins - proteases

21 Type III secretion Host-cell contact induced secretion process
Gram-negative bacterium direct manipulation of host cell actin / function induction / translocation of type III effectors (intracellular enzyme activity)

22 Gram-negative - Type III secretion regulon
pscU pscT pscS pscR pscQ pscP pscO pscN popN pcr1 pcr2 pcr3 pcr pcrD pcrR pscL pscK pscJ pscI pscH pscG pscF pscE pscD pscC pscB exsD exsA exsB exsC popD popB pcrH pcrV pcrG * Type III secretion components Type III effectors spcU exoU orf exoS exoT exoY * * * * * (Pseudomonas aeruginosa regulon, Frank, Yahr 1997; Figure courtesy of Dara Frank) Properties: - Induced by contact with host cell - Coordinately induces - regulatory, structural and effector genes - encoded on a pathogenicity island (chromosomal / plasmid / phage) - No Sec-dependent signal sequence - Provides a conduit for the direct translocation of bacterial proteins into host cells - Evolutionary relationship with flagella

23 Gram-negative - Type III secretory apparatus
Salmonella Shigella Type III apparatus resembles the basal body of flagella, with an injection needle at the tip replacing the hook and flagellar filament. S. typhimurium flagellum (Kubori, 1998; Blocker, 2001; Plano, 2001)

24 Comparison of type III secretion structures
Flagellum Yersinia E. coli P. syringae (Tampakaki et al., Cellular Microbiology, 2004) 10-15 µM 58 nM ~90 nM 2 µM

25 Gram-negative - Type IV secretion
Properties - Used in export of protein complexes / DNA - Can translocate directly into host cell - Show homology to pilus-mediated conjugal transfer systems - Sec-like dependent translocation into periplasm - B11 - related to ATP-ases of type II system - D4 - DNA binding - may function in DNA transfer - B6, B7, B8 B9, B10 - core periplasmic components - B2, B5 - pilus components A. tumefaciens Gene organization of Type IV secretion (H-J. Yeo, G. Waksman, J. Bacteriol. 2004) Bacteria that use type IV secretion: Agrobacterium tumefaciens - VirB-VirD Bordetella pertussis - pertussis toxin Helicobacter pylori - CagA Legionella pneumophila

26 (Wilson, McNab, Henderson Bacterial Disease Mechanisms, 2002)
Type V secretion - autotransporter Properties: - Insertion of b-domain - formation b-barrel pore in outer membrane - Signal sequence - directs protein membrane translocation - Linker region - leads protein secretion through pore - Auto-chaperone - triggers protein folding - Folded protein - released (or not) from membrane (Desvaux et al., Res in Microbiol. 2004) (Wilson, McNab, Henderson Bacterial Disease Mechanisms, 2002) Bacteria that use type V secretion: Neisseria gonorrhoeae - IgA1 protease Helicobacter pylori - VacA Haemophilus influenzae - Hsf fibrillar protein

27 Type VI secretion - a bacterial poison dagger

28 Type VI secretion - a bacterial poison dagger
Figure 2. Model for T6SS Assembly, Effector Translocation, and Component Recycling Baseplate complex forms consisting of TssE, TssJ, TssK, TssL, and TssM VgrG, PAAR, and effector proteins are recruited to this complex and assemble into the structure. VgrG interaction with PAAR or effectors likely contributes to the overall stability of the apparatus assembly. It is thought that the Hcp tube polymerizes from a nucleator that, in part, is a VgrG trimer, and then the VipA/VipB sheath polymerizes around the growing Hcp tube. Analogous to phage, a conformation change in the sheath structure results in a contraction event that launches the Hcp tube out of the cell and across a target membrane. This contraction event delivers the loaded VgrG-effector ‘‘warhead’’ through the layers of the cell envelope. ClpV uses ATP to remodel the contracted sheath, restoring the pool of available sheath subunits. The now unsheathed Hcp tube disassembles; parts of the tube that are not expelled from the cell are recycled within the cytosol. The naked baseplate complex is then ready to be recycled or disassembled, depending on the T6SS and its activation state.

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30 Regolazione del sistema di secrezione di tipo III nei batteri
Il sistema di secrezione di tipo III (TTSS) è un macchinario specializzato nella secrezione di proteine È usato da numerosi batteri patogeni gram-negativi per rilasciare degli effettori direttamente nelle cellule dell’ospite Nei batteri fitopatogeni i geni codificanti per il TTSS sono stati scoperti perché i loro prodotti sono collegati con la risposta ipersensibile e la patogenicità. Infatti la loro delezione altera la capacità dei mutanti di causare malattia negli ospiti e di elicitare l’HR nelle piante non ospite I geni hrp (hypersensitive response and pathogenicity) e quelli del TTSS sono repressi in terreni ricchi ma indotti quando i batteri sono inoculati in planta o incubati in terreni poveri

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32 Il sistema di secrezione di tipo III nei batteri
Numerosi batteri gram-negativi patogeni di piante ed animali usano il TTSS per invadere i loro ospiti. In pratica il TTSS è una struttura simile ad una siringa con ago che consiste di una membrana esterna ed una interna e di un filamento protrudente chiamato pilo hrp nei fitopatogeni Il pilo hrp funziona come un condotto che guida la traslocazione degli effettori di tipo III nell’interno della cellula ospite Il TTSS è codificato da un cluster di circa 20 geni hrp che sono organizzati in diversi operoni sia sul cromosoma che nei plasmidi I cluster genici hrp sono spesso fiancheggiati da altri geni relativi alla virulenza, nell’insieme questi geni formano le cosiddette “isole di patogenicità” che è definita dal resto del genoma dal tRNA o da elementi mobili

33 Il sistema di secrezione di tipo III nei batteri
L’espressione dei geni TTSS è coordinata da diversi ospiti e da fattori ambientali A seconda della struttura dell’operone hrp e del sistema di regolazione che controllano l’espressione dei geni TTSS i geni hrp possono essere divisi in 2 gruppi principali I geni hrp di Erwinia spp., Pantoea stewartii e Pseudomonas syringae appartengono al gruppo I Quelli di Xanthomonas spp. e di Ralstonia solanacearum al gruppo II Molteplici componenti di signal transduction sono stati identificati in ambedue i gruppi dei geni hrp

34 Il sistema regolativo per il gruppo I
Questo gruppo è regolato da HrpL un membro della famiglia ECFG dei fattori sigma (fattori che modulano l’attività della RNA polimerasi batterica)‏ Le proteine HrpL di questi batteri (Erwinia etc) sono molto conservate e riconoscono una sequenza consenso sul DNA (GGAACC-N15/16-CCACNNA) chiamata l’hrp box che si trova nel promotore degli operoni hrp e degli effettori di tipo III Lo stesso hrpL è indotto nelle condizioni che inducono la trascrizione degli hrp

35 Il sistema regolativo per il gruppo I
I geni hrpR e hrpS sono organizzati in un operone controllato dal promotore a monte di hrpR Le proteine HrpR e HrpS appartengono alla famiglia dei regolatori a 2 componenti Le due proteine sono altamente omologhe e formano un eterodimero. La dimerizzazione sembra essere cruciale per l’attivazione trascrizionale di hrpL

36 Il sistema regolativo per il gruppo I
Sia HrpR che HrpS contengono un dominio di legame ad un enhancer ed un motivo che interagisce con l’oloenzima 54-RNA polimerasi Quindi la trascrizione di hrpL è sotto il controllo di un promotore che dipende da 54 In condizioni inducenti HrpR e HrpS formano un eterodimero sul promotore di hrpL per stimolarne la trascrizione interagendo con la 54 RNA polimerasi

37 Il sistema regolativo per il gruppo I
Un sistema a due componenti che consiste dei prodotti dei geni hrpX e hrpY agisce a monte della cascata hrpS-hrpL in Erwinia. hrpX codifica per un sensore istidina-kinasi mentre hrpY per il corrispondente response regulator hrpXY è quindi richiesto per l’induzione dei geni hrp e probabilmente HrpX è il sensore dei segnali chimici o fisiologici che a sua volta attiva HrpY fosforilandolo

38 Il sistema regolativo per il gruppo I
HrpA è il principale componente del pilo di tipo III e influenza la trascrizione dell’operone hrpRS la proteasi Lon ATP-dep. è un regolatore, negativo della proteina HrpR È stata identificata perché i mutanti lon presentavano un’attivazione costitutiva dei geni hrp in terreni ricchi. Questa attivazione è il risultato della non-degradazione di HrpR Lon non modula invece la stabilità di HrpS, d’altronde HrpS attiva hrpL proprio mediante HrpR e quindi la degradazione di quest’ultimo influenza il funzionamento del dimero HrpRS

39 Il sistema regolativo per il gruppo I
In P. aeruginosa l’espressione dei geni TTSS è controllata a livello trascrizionale da ExsA un attivatore trascrizionale del tipo AraC (arabinosio)‏ L’antiattivatore ExsD interagisce con ExsA in condizioni repressive e quindi reprime la trascrizione dei geni TTSS Quando i batteri sono cresciuti in condizioni inducenti un terzo regolatore ExsC interagisce con ExsD e rilascia ExsA dall’inibizione di ExsD e quindi a sua volta attiva l’espressione dei geni TTSS Quindi in questo modello ExsD agisce come un anti attivatore di ExsA e ExsC agisce come anti-anti attivatore! In P. syringae due ulteriore elemento hrpV e hrpG agisce similmente come anti-antiattivatori interagendo con hrpS

40 Il sistema regolativo per il gruppo II
La maggior parte degli hrp operons del gruppo II sono attivati da un attivatore AraC-like designato HrpB in R. solanacearum e HrpX in Xanthomonas spp. Il promotore degli operoni hrp e gli effettori di tipo III sono regolati da HrpX e HrpB che spesso presentano un motivo conservato chiamato plant-inducible promoter (PIP)-box (TTCGC.N15-TTCGC) in Xanthomonas e hrpII-box in R. solanacearum Mutazioni puntiformi nella sequenza consenso di PIP/hrpII box riducono l’attività di HrpX o B

41 Il sistema regolativo per il gruppo II
I geni hrpX e hrpB sono attivati dalle proteine HrpG che appartengono alla famiglia dei regolatori a 2 componenti con un dominio receiver N-terminale e un DNA binding domain C terminale Questa proteina è un punto convergente delle pathways di trasduzione del segnale che mediano l’induzione dei geni TTSS hrpG è costitutivamente espresso in terreni minimi e completi ma la sua trascrizione è indotta solo dopo il contatto con la pianta PhcA è un regolatore negativo di HrpG probabilmente attraverso un meccanismo post-trascrizionale PhcA coordina l’espressione di molteplici fattori di virulenza come gli esopolisaccaridi, diversi CWDE, il quorum sensing e la mobilità batterica

42 Il sistema regolativo per il gruppo II
L'host sensing è cruciale per un'infezione di successo da parte dei batteri fitopatogeni. In R. solanacearum i geni TTSS sono indotti quando il batterio entra in contatto con la pianta L'induzione è mediata da PrhA una proteina di membrana con significative similarità con i recettori siderofori Il segnale proveniente dalla pianta che è percepito da PrhA è probabilmente un componente non diffusibile della parete cellulare che è resistente alla proteolisi e al calore

43 Regolazione dei geni TTSS
Altri componenti che agiscono a valle di PrhA sono PrhR, I, J che funzionano in un ordine sequenziale. PrhR, I e J sono richiesti specificamente per l'induzione da parte dell'ospite. PrhR e prhI si trovano nello stesso operone e codificano per una proteina transmembrana ed un fattore  della famiglia ECF mentre PrhJ è un attivatore trascrizionale della famiglia LuxR/UhpA. PrhR e I agiscono a monte di PrhJ e insieme sono richiesti per l'induzione di hrpG

44 Gli effettori fitopatogenici di tipo III
I batteri fitopatogeni sopprimono l'immunità innata e promuovono la patogenesi iniettando nelle cellule dell'ospite delle proteine chiamate effettori di tipo III (T3Es) usando il TTSS I T3Es usano almeno 3 diverse strategie per alterare Il turnover proteico sia attraverso una proteolisi diretta che mediata dal proteasoma 26S Il metabolismo del RNA attraverso un attivazione trascrizionale o mediante l'ADP-ribosilazione delle RNA binding protein Le pathway kinasiche coinvolte nel signaling difensivo sia attraverso le fosfatasi che un'inibizione diretta coinvolte nelle le risposte dell'ospite al patogeno

45 Attività e target dei T3Es

46 I T3E che hanno impatto sul turnover proteico
Alcuni T3E sono delle proteasi che possono rimuovere alcuni componenti dell’ospite fondamentali per l’instaurarsi della PTI. Ad es. AvrPphB di P. syringae è una cisteina proteasi papain-like che taglia la PK PBS1 di At. PBS1 forma un complesso con RPS5 che riconosce il taglio e inizia l’ETI. AvrRpt2 è una cisteina proteasi staphopain –like che taglia RIN4 un regolatore negativo della PTI. Sembra contro- intuitivo che RIN4 sia un target di virulenza dato che la sua perdita dovrebbe dereprimere la PTI, il che dovrebbe apparentemente avere un impatto negativo sul patogeno. Però RIN4 interagisce con almeno altri 2 T3Es e 2 R protein suggerendo che la sua inattivazione potrebbe destabilizzare questo complesso e dare beneficio al patogeno. Una di queste proteine, RPS2, riconosce il taglio di RIN4 e scatena l’ETI

47 I T3E che hanno impatto sul turnover proteico
Due famiglie di T3E (XopD e YopjJ) sono delle cisteina proteasi/isopeptidasi che sono specializzati nella rimozione dei gruppi SUMO dalle proteine dell’ospite. Dato che l’aggiunta di una singola ubiquitina o di un gruppo SUMO può modificare l’attività o la localizzazione di una proteina, probabilmente la deubiquitinazione/desumoilazione operata da questi effettori altera l’attività o la stabilità di queste XopD è un effettore che viene traslocato nel nucleo dove si ritiene possa mimare delle SUMO isopeptidasi vegetali YopJ è stato studiato nei patogeni umani appartenenti al genere Yersinia insieme ad altri effettori della stessa famiglia come AvrXv4, AvrBsT, AvrRxv e XopJ. Questi effettori sembrano agire come SUMO-isopeptidasi dato che l’overespressione di uno di questi porta ad un decremento delle protien SUMOilate in pianta. AvrXv4 è citoplasmico mentre XopJ è targettato verso la membrana plasmatica. YopJ oltre all’attività deSUMOilante mostra attività deubiquitinante, acetilante ed è capace di bersagliare le pathways di MAPK-signaling

48 I T3E che hanno impatto sul turnover proteico
Piuttosto che avere delle attività proteasiche alcuni T3E usano il macchinario di ubiquitinazione dell’ospite e il proteasoma 26S per alterare i livelli delle proteine coinvolte nella difesa. Ad. es. gli effettori GALA di R. solanacearum hanno degli F-box e LRR domain attraverso i quali interagiscono con le proteine ASK di At. Le proteine F-box e le ASK fanno parte del complesso ubiquitina E3 ligasi che attacca l’ubiquitina alle proteine indirizzandole verso la degradazione da parte del proteasoma 26S AvrPtoB di P. syringae contiene un dominio C-terminale E3 ligasico che ubiquitina la PK Fen di pomodoro indicandola per la degradazione. Però l’ETI avviene quando l’R protein Prf riconosce l’interazione tra Fen e una versione troncata di AvrPtoB che manca prorpio della parte Ubiquitina-ligasica. Questo indica che il patogeno ha sviluppato un forma di questo effettore che invece possiede questo dominio e che quindi ubiquitina Fen e riesce anche ad evitare l’ETI. Questo T3E ha diversi target, perché sopprime anche la PTI indotta da MAPK in At

49 I T3E che hanno impatto sul turnover proteico
Un altro esempio di T3E capace di alterare il turnover proteico è dato da HopM1 di P. syringae. Questo è presente nella frazione delle endomembrane delle cellule vegetali dove aumenta la degradazione di AtMIN7 indirizzandola al proteasoma. AtMIN7 è una ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factor (ARF-GEF) necessari per il trasporto vescicolare. Quindi HopM1 può indirizzare AtMIN7 per la degradazione proprio per impedire il trasporto vescicolare di metaboliti legati alla early defense (fitoalessine, callosio, etc) verso l’apoplasto e quindi alterare la difesa basata sul CWR HopM1 causa l’ubiquinazione e la degradazione attraverso il proteasoma 26S di AtMIN7 che è coinvolta nel traffico vescicolare

50 I T3E che influenzano la trascrizione o la stabilità dell’RNA
I T3E possono anche modificare i livelli proteici alterando la trascrizione dell’ospite, il che può portare ad un incrementata suscettibilità. I T3E in grado di effettuare questo tipo di inibizione sono AvrBs3, PthXo6 e PthXo7 di Xanthomonas spp., HsvG e HsvB di Pantoea agglomerans AvrBs3 altera la trascrizione legandosi al promotore del fattore di trascrizione upa20 e aumentando la sua espressione. Questa up-regolazione di upa20 è in parte responsabile della ipertrofia delle cellule del mesofillo. Nelle piante resistenti, AvrBs3 si lega anche al promotore e attiva la trascrizione del R gene Bs3 la cui proteina riconosce l’effettore e induce l’ETI. Bs3 è una mono-ossigenasi flavina-dipendente e non una NB-LRR protein e induce l’ETI con meccanismo non noto.

51 I T3E che influenzano la trascrizione o la stabilità dell’RNA
Il caso del riconoscimento di AvrBs3 potrebbe essere considerato una variazione dell’ipotesi guardia, infatti Bs3 piuttosto che monitorare una proteina, controlla una sequenza di DNA. Quindi il promotore di Bs3 potrebbe in questo senso mimare (decoy hypothesis) il promotore di upa20 (il reale target di Bs3) e AvrBs3 indurrebbe la produzione della sua controparte R AvrBs3 appartiene ad una famiglia di attivatori di trascrizione, altri membri di questa famiglia sono PthXo6-7 che aumentano l’espressione dei geni di riso OsTFX1 (che codifica per un fattore di trascrizione bZIP) e OsTFIIA1 (una piccola subunità del fattore di trascrizione IIA)‏ L’uso dei T3E di up-regolare l’espressione dei geni dell’ospite che codificano per fattori di trascrizione che a loro volta co-regolano molti geni è una comune strategia di virulenza impiegata da molti batteri fitopatogeni. Queste proteine indotte dai T3E probabilmente rappresentano dei fattori di suscettibilità che rendono la pianta più “predisposta” alla colonizzazione batterica

52 I T3E che influenzano la trascrizione o la stabilità dell’RNA
HopU1 prodotto da P.syringae pv. tomato bersaglia invece il metabolismo del RNA piuttosto che la sintesi del mRNA. HopU1 è una mono-ADP-ribosiltransferasi (ADP-RT) che ADP ribosila diversi RNA-binding proteins di At tra cui la glycine-rich RNA-binding protein GRP7 Inoltre questa attività ADP-RT è necessario per l’abilità di HopU1 per sopprimere la PTI e l’ETI e le piante di At che mancano di GRP7 sono più suscettibili a P. syringae Le ADP-RT sono delle tossine ben caratterizzate nei patogeni animali ma finora mai associate ad una attività di legame all’RNAS. L’ADP ribosilazione delle RNABP probabilmente decrementa la loro abilità nello stabilizzare o processare l’RNA Non è noto come questa alterazione porti alla soppressione delle risposte difensive o se sia in grado di alterare il metabolismo generale dell’RNA o solo quello di alcuni (ad es. quelli legati alla difesa)‏

53 I T3E che influenzano la fosforilazione o defosforilazione delle proteine dell’ospite
La PTI e l’ETI utilizzano dei segnali kinasici per l’attuazione delle risposte difensive (in modo particolare le MAPK). Queste K rappresentano il target ideale per i T3E dato che molte pathways di signaling spesso convergono verso queste proteine di trasduzione, e quindi la loro disattivazione risulta in una soppressione di tutte le risposte a valle necessarie per l’attuazione delle difese 2 T3E che usano questa strategia sono HopAI1 e HopAO1. HopAI1 prodotto da P. syringae ha un’attività fosfotreonina liasica che inattiva irreversibilmente le MAPK. In particolare questo effettore si lega a MPK3 e 6 di At che, come noto, sono coinvolte nelle risposte di difesa a questo batterio HopAO1 è una PTP che contribuisce alla virulenza di P. syringae sopprimendo la PTI e l’ETI. Dato che le MAPK sono fosforilate sui residui di tirosina, questi rappresentano dei target attraenti per questo effettore. Comunque apparentemente HopAO1 non agisce su MPK3-6 e quindi il suo bersaglio deve essere ancora identificato

54 I T3E che influenzano la fosforilazione o defosforilazione delle proteine dell’ospite
Una strategia leggermente diversa è usato da AvrPto, un effettore di P. syringae, che interagisce con i PAMP- RLK FLS2 ed EFR inibendo la loro abilità a autofosforilarsi e attivare la cascata MAPK che porta alla PTI In modo simile ad AvrPtoB, AvrPto induce l’ETI mediata da Pto-Prf. Infatti questo effettore inibisce l’attività kinasica di Pto e questa inibizione porta all’ETI mentre il meccanismo con cui è percepito da Prf è indipendente dall’inibizione dell’attività K In realtà il reale target di AvrPto sembra essere, come detto prima, un PAMP-RLK anche se questo T3E ha la capacità di inibire l’attività K di Pto. Questo ci porta ad ipotizzare che Pto potrebbe essere uno “specchietto per le allodole” nel senso che il suo legame con l’effettore impedirebbe ad AvrPto di bloccare i PAMP- RLK e scatenerebbe l’ETI.

55 I T3E che interagiscono con le proteine dell’ospite
AvrB e AvrRpm1 di P. syringae interagiscono con RIN4 portando ad una sua iper-fosforilazione che apparentemente gli consente di essere riconosciuto dalla RP RPM1 e indurre in tal modo l’ETI. Inoltre AvrB interagisce con RAR1 che rappresenta un target molto “attraente” in quanto questa proteina insieme a SGT1 e HSP90 stabilizza la R proteins e quindi è un componente fondamentale dell’ETI HopI1 è un effettore chloroplast-targeted con un potenziale dominio J. Questo dominio, come detto in precedenza, si trova spesso nelle co-chaperonine di Hsp70 che indirizzano le proteine verso Hsp70 dove accendono la sua attività l’ATPasica e quella legata alla sua capacità di alterare il folding proteico. Il dominio J di HopI1 è necessario per la sua virulenza e la sua overespressione in At altera i tilacoidi sopprimendo la biosintesi di SA

56 I T3E interagiscono con molti target
I T3E spesso hanno molteplici target e quindi possono alterare differenti aspetti dell’immunità innata. Questi target sembrano funzionare ad ogni possibile livello della PTI e dell’ETI, includendo gli stessi recettori, le pathways di segnale a a valle e le risposte trascrizionali e post-trascrizionali In questo modo i T3E si sono evoluti in modo tale da avere la massima capacità di sopprimere un numero sufficiente di risposte dell’immunità innata per consentire il successo dei batteri fitopatogeni

57 Xylella fastidiosa Agente del Complesso del disseccamento rapido dell’olivo (CoDiRO)
6000 piante secolari abbattute nel solo 2014 nel Salento

58 CoDiRO Nell’estate del 2013 sono stati segnalati in alcuni oliveti pugliesi diversi casi di disseccamento di piante di olivo coltivate in una zona a sud di Gallipoli nella Provincia di Lecce. Le piante colpite presentavano la seguente sintomatologia: disseccamenti estesi della chioma che interessavano rami isolati, intere branche e/o l’intera pianta; imbrunimenti interni del legno a diversi livelli dei rami più giovani, delle branche e del fusto; foglie parzialmente disseccate nella parte apicale e/o marginale.

59 “Complesso del disseccamento rapido dell’olivo”
il batterio fitopatogeno da quarantena Xylella fastidiosa,; il lepidottero Zeuzera pyrina o Rodilegno giallo ed alcuni miceti lignicoli vascolari (Phaeoacremonium parasiticum, P. rubrigenun, P. aleophilum, P. alvesii e Phaemoniella spp.) noti per causare disseccamenti di parti legnose di piante arboree e di vite.

60 Xylella fastidiosa Xylella fastidiosa è un batterio fitopatogeno capace di attaccare oltre all’olivo, diversi tipi di piante fra le quali le più importanti sono la vite, il pesco, il mandorlo, diverse specie di agrumi, l’oleandro e diverse altre. In totale le specie di piante ospiti di Xylella fastidiosa sono oltre 150, fra le quali molte infestanti. Xylella fastidiosa colonizza lo xilema delle piante ospiti e il suo sviluppo nella pianta sembra condizionato dalla temperatura: valori compresi fra 25 e 32°C, le temperature più idonee per la moltiplicazione del batterio La sensibilità di Xylella fastidiosa alle basse temperature invernali spiega in parte la sua distribuzione geografica che appare limitata alle aree tropicali e subtropicali.

61 Xylella fastidiosa Xylella fastidiosa si moltiplica nei vasi xilematici della pianta ospite provocandone l’ostruzione. La situazione che si viene così a determinare sarebbe in parte responsabile della comparsa dei sintomi della malattia. Il batterio riesce a muoversi sia verso l’alto sia verso il basso, e per questo motivo può essere rinvenuto anche nelle radici. Si diffonde facilmente, su brevi e lunghe distanze, con il materiale di propagazione o piante intere e, in loco, anche tramite innesto.

62 Rapporto batterio-vettore
La trasmissione più efficiente è però operata da insetti che si nutrono della linfa xilematica. Questo tipo di trasmissione è di norma molto rapida poiché manca nell’insetto il periodo di latenza (periodo intercorrente tra l’acquisizione del batterio e la capacità dell’insetto di trasferirlo in una pianta sana tramite punture di alimentazione). Il patogeno è trasmesso in natura esclusivamente da alcune specie di insetti appartenenti all’Ordine Hemiptera, sub-ordine Cicadomorpha (Famiglie Cicadellidae e Aphrophoridae) che fungono da vettori contribuendo 4 alla diffusione della malattia a breve e medio raggio

63 diffusione La diffusione su lunghe distanze è opera dell’uomo attraverso il commercio di materiale di moltiplicazione infetto. Xylella fastidiosa non si riproduce nel seme. Il periodo di incubazione della malattia è di solito molto lungo (ma molto dipende dalla specie di pianta ospite e, nell’ambito della stessa specie, dalla cultivar), da qualche mese ad un anno e talvolta anche più. In molti ospiti l’infezione può rimanere asintomatica. Ne deriva che in molti casi, ad es. in vivaio, eventuali infezioni possono sfuggire, in tempi brevi, all’osservazione diretta e ciò facilita la propagazione della malattia con il materiale vegetale.

64 Sinergia insetto/fungo/batterio
nei primi mesi del 2013 è stata segnalata, sempre in California, una malattia caratterizzata da disseccamento di rami e branche e causata, verosimilmente, da una pletora di funghi diversi fra cui Paheoacremoium aleophilum, Phaeomoniella chlamydospora e diverse Botryosphaeriaceae. Tutti questi funghi sono già molto noti come funghi implicati nell’altrettanto nota “mal dell’esca della vite”. Nel Salento, le piante di olivo che presentavano sintomi di deperimento rapido con estesi imbrunimenti fogliari e disseccamenti hanno rivelato la presenza di attacchi di Zeuzera pyrina e la presenza nel legno di alcuni funghi tracheomicotici, Phaeoacremonium parasiticum, P. rubrigenum, P. aleophilum, P. alvesii, Phaemoniella spp. e, inoltre, anche la presenza di DNA di Xylella fastidiosa.

65 distribuzione

66 controllo La lotta chimica curativa non è attuabile quindi il controllo di Xylella fastidiosa si basa sulla prevenzione: impiego di varietà resistenti, pratiche colturali e di igiene appropriate, misure di lotta (chimica e/o biologica) contro gli insetti vettori Le ragioni di questi esiti parzialmente negativi sono numerose: Xylella fastidiosa è spesso asintomatica in molte piante ospiti, incluse molte specie di piante infestanti e piante ornamentali; gli insetti che possono fungere da vettori sono numerosi e generalmente polifagi, alcuni forse ancora sconosciuti. Lo stress in particolare idrico, è spesso un fattore aggravante nella manifestazione dei sintomi nelle piante infettate da Xylella fastidiosa. Le pratiche colturali dovrebbero quindi essere orientate verso l’ottenimento di piante sane, ben coltivate e con una nutrizione adeguata.