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Separazione cromatografica enantioselettiva. Una specie chimica chirale esiste come due forme isomeriche che sono luna limmagine speculare dellaltra e.

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Presentazione sul tema: "Separazione cromatografica enantioselettiva. Una specie chimica chirale esiste come due forme isomeriche che sono luna limmagine speculare dellaltra e."— Transcript della presentazione:

1 Separazione cromatografica enantioselettiva

2 Una specie chimica chirale esiste come due forme isomeriche che sono luna limmagine speculare dellaltra e non sono tra loro sovrapponibili (enantiomeri) Per i composti farmaceutici, la chiralità è dovuta, nella maggior parte dei casi, alla presenza di un atomo tetracoordinato al quale sono legati quattro atomi o gruppi di atomi diversi. La difficoltà nella separazione/analisi di enantiomeri è dovuta la fatto che gli isomeri hanno proprietà chimiche e fisiche identiche (es. punto fusione, ebollizione, proprietà spettroscopiche, etc) Per distinguere gli enanatiomeri è necessaria una interazione con unentità anchessa chirale con formazione di diasteroisomeri

3 La tecnica HPLC rappresenta la metodologia più utilizzata per la determinazione delleccesso enantiomerico %e.e. = (E 1 -E 2 )/(E 1 +E 2 ) X100 Ove E 1 e E 2 rappresentano lammontare dei due enantiomeri I metodi HPLC impiegati per la determinazione della composizione enantiomerica sono classificati in metodi diretti e indiretti ADC= agente derivatizzante chirale; SC selettore chirale legato alla matrice silicea

4 il metodo indiretto è basato sulla reazione della miscela di enantiomeri con un reagente a stereochimica definita per formare una coppia di diasterosiomeri (reazione di derivatizzazione chirale) I diasterosiomeri sono quindi separati con fasi stazionarie non chirali La derivatizzazione può anche inserire opportuni cromofori/fluorofori per aumentare la risposta al detector Metodo usato per determinare enantiomeri in matrici complesse METODO INDIRETTO

5 Requisiti per metodo indiretto Derivatizzante: dovrebbe esistere come unico enantiomero o avere eccesso enantiomerico altissimo Reazione di derivatizzazione deve andare a completezza Disateroisomeri devono fornire stessa risposta al rivelatore

6 Metodo diretto Attualmente è il più utilizzato data lampia disponibilità commerciale di fasi stazionarie chirali Si basa su selettori chirali legati alla fase stazionaria che formano addotti diasterosiomerici non covalenti. La diversa stabilità degli addotti diasteroisomerici si traduce in un diverso tempo di ritenzione in colonna per i due enantiomeri Da un punto di vista teorico, la discriminazione chirale richiede almeno tre interazioni simultanee tra il selettore e lenantiomero e uno di queste interazioni deve dipendere dalla stereochimica dellanalita

7 La discriminazione chirale può anche avvenire per aggiunta del selettore chirale alla fase mobile e in questo modo si possono utilizzare fasi stazionarie non chirali Tra gli inconvenienti: costi alti e la possibile interferenza del selettore con il detector.

8 Classi di fasi stazionari chirali Le fasi stazionarie chirali posso essere classificate sulla base del meccanismo di discriminazione chirale coinvolto: 1. A scambio di legante 2. Interazione multipla, fasi tipo «Pirkle» (selettore chirale: composto organico a basso PM) 3. Interazione multipla (selettore chirale: antibiotici macrociclici) 4. Complessi di inclusione (selettore: ciclodestrine) 5. Interazioni attrattive ed inclusione (selettore: polimero sintetico o naturale) 6. Interazioni idrofobiche e polari (selettore: proteine)

9 1. Cromatografia a scambio di legante Utilizzato per la separazione di molecole bidentate capaci di formare complessi con ioni di metalli di transizione. Molto usata per analisi di amminoacidi Selettore chirale maggiormente usato è la (S-)prolina, immobilizzata su fase stazionaria e Cu 2+ in fase mobile La risoluzione enantiomerica si basa sulla diversa stabilità dei complessi disteroisomerici L-Cu-L + (S)-L L-Cu-L + (R)-L L-Cu-(S)-L + L L-Cu-(R)-L + L

10 2. Interazione multipla: fasi di tipo «Pirkle» Utilizzate sia a livello analitico sia preparativo Selettore chirale: molecole semplici con uno o al massimo due centri stereogenici caratterizzate dalle seguenti funzioni: -Gruppo aromatico -Possibilità formare ponti idrogeno -Possibilità formare interazioni dipolo/dipolo -Presenza gruppi ingombranti per il controllo conformazionale dellinterazione

11 Gli antibiotici macrociclici sono utilizzati quali selettori chirali data la loro complessità strutturale con numerosi centri stereogenici e gruppi funzionali che offrono varie modalità di interazioni con analiti enantiosielettivi 3. Interazione multipla: fasi con antiobiotici macrociclici vancomicina

12 4. Complessi di inclusione Separazione basata sulla inclusione enantiosilettiva in cavità chirali del selettore. Tra i selettori più comuni le ciclodestrine (polimeri del d-glucosio) con diametro della cavità in dipendenza del numero di residui monosaccaridici da 5.7 A a 9.5 A)

13 I gruppi OH sono rivolti allesterno e quindi la cavità assume una natura tendenzialmente idrofobica permettendo linclusione di composti non polari. Per una buona separazione è utile la presenza di un anello aromatico vicino al centro stereogenico: lanello aromatico viene incluso nella cavità mentre il resto della molecola (polare) interagisce con i grippi OH esterni Molto usate le ciclodestrine come additivi chirali nella fase mobile per analisi enantioselettive su fasi stazionarie non chirali

14 5. Interazioni attrattive ed inclusione (selettori: polimeri sintetici e naturali) Selettori polimerici (es derivati cellulosa, amilosio) sono ad elevata enantioselettività nei confronti di svariate classi di farmaci Il meccanismo di separazione si basa sullinclusione dellanalita nella cavità chirale formatasi per conformazione ordinata del polimero

15 6. Interazioni idrofobiche e polari (selettore proteine) Le proteine più utilizzate sono le proteine di trasporto nel siero quali lalfa-glicoproteina e la sieroalbumina. Il meccanismo di discriminazione chirale si base sia su interazioni sia idrofobiche sia polari (le interazioni idrofobiche sono necessarie allinterazione con la fase stazionaria quelle idrofile per lenantioselttività)

16 Silica gel BC for chiral chromatography A very finely divided silica gel for chromatography (5 µm) coated with β-cyclodextrin. Higher selectivity may be obtained when cyclodextrin has been derivatized with propylene oxide. 01/2008:2217 corrected 7.3 Lamivudine Lamivudinum C 8 H 11 N 3 O 3 S M r [ ] DEFINITION 4-Amino-1-[(2R,5S)-2-(hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl]pyrimidin-2(1H)-one. Content: 97.5 per cent to per cent (dried substance). Enantiomeric purity. Liquid chromatography (2.2.29): use the normalisation procedure Test solution. Dissolve 25.0 mg of the substance to be examined in water R and dilute to mL with the same solvent.water R Reference solution. Dissolve the contents of a vial of lamivudine for system suitability 2 CRS (containing impurity D) in 1.0 mL of water R.lamivudine for system suitability 2 CRSwater R Column: size: l = 0.25 m, Ø = 4.6 mm; stationary phase: silica gel BC for chiral chromatography R (5 µm) ;silica gel BC for chiral chromatography R temperature: maintain at constant temperature between 15 °C and 30 °C; the temperature may be adjusted to optimise the resolution between lamivudine and impurity D; a lower temperature favours improved resolution.

17 Mobile phase: mix 5 volumes of methanol R and 95 volumes of a 7.7 g/L solution of ammonium acetate R.methanol R ammonium acetate R Flow rate: 1.0 mL/min. Detection: spectrophotometer at 270 nm. Injection: 10 µL. Run time: twice the retention time of lamivudine. Relative retention with reference to lamivudine (retention time = about 8 min): impurity D = about 1.2; impurity B and enantiomer = about 1.3 and 1.5. System suitability: reference solution: peak-to-valley-ratio: minimum 15, where H p = height above the baseline of the peak due to impurity D and H v = height above the baseline of the lowest point of the curve separating this peak from the peak due to lamivudine. Calculate the sum of the percentage contents of all impurity peaks with a relative retention from 1.2 to 1.5. Subtract the percentage content of impurity B as obtained in the test for related substances. Limit: impurity D: maximum 0.3 per cent.


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