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Estrazione ed analisi dei lipidi Lezione del 17- 5- 07.

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Presentazione sul tema: "Estrazione ed analisi dei lipidi Lezione del 17- 5- 07."— Transcript della presentazione:

1 Estrazione ed analisi dei lipidi Lezione del

2 centrifuga H 2 O/CH 3 OH/CHCl 3 0, CELLULE o MEMBRANE in soluzione fisiologica Estrazione dei lipidi CH 3 OH (Bligh & Dyer) Agitazione per 15 + CHCl 3 Agitazione per 15 SISTEMA MONOFASICO

3 SN1 CHCl 3 + H 2 O + ESTRATTO LIPIDICO pellet CH 3 OH / CHCl 3 / H 2 O 1 1 0,9 SISTEMA BIFASICO + H 2 O /CH 3 OH/ CHCl 3 0,8 2 1 centrifuga SN2 SN1+SN2 CH 3 OH+H 2 O CHCl 3

4 Cose la Cromatografia ? La cromatografia e una tecnica che serve a separare i singoli componenti di una miscela omogenea. E basato sulla diversa ripartizione di molecole tra una fase mobile (liquida o gassosa) ed una fase stazionaria (solida o liquida) Analisi qualitativa Analisi quantitativa Purificazione ComponentiMiscela

5 Differenti tipi di cromatografia Cromatografia liquida ( cromatografia su colonna, su strato sottile o TLC, e HPLC) –Fase stazionaria: gel di silice, allumina, etc. –Fase mobile: solventi organici –importanti proprieta: polarita Gas cromatografia –Fase stazionaria: un polimero impaccato o capillare. –Fase mobile: gas inerte (Elio) –importanti proprieta: punto di ebollizione (evaporazione soluti)

6 Cromatografia su strato sottile (TLC) Il gel di silice o di allumina (fase stazionaria) e deposto in strato sottile su una lastra di vetro. La silice e molto polare. La superficie dei granuli di silice è caratterizzata dalla presenza di gruppi silanolici (Si- OH) e di gruppi silossanici (Si-O-Si). Sui primi ha luogo linterazione tra fase fissa e soluto La silice è resa attiva dai gruppi silanolici Si-OH. Questi, però, sono bloccati da molecole di acqua legate mediante legami idrogeno

7 Quindi, è necessario essiccare in stufa ( 180 °C) per eliminare le molecole di acqua, senza però superare i 300 °C, perché si avrebbe la condensazione interna con formazione nuovamente di gruppi silossanici La fase mobile dovrà avere caratteristiche tali da competere, con il soluto, per ladsorbimento sulla fase stazionaria. Leffetto della fase mobile è quello di differenziare la capacità dei vari soluti di essere adsorbiti. Un soluto molto polare interagisce fortemente con la fase fissa e, per far si che la fase mobile competa con il soluto, dovra anchessa essere abbastanza polare.

8 Affinità di classi di composti con fasi stazionarie polari Composto Gruppo funzionale forza di assorbimento crescente Acidi Alcoli Ammine Mercaptani Aldeidi Chetoni Esteri Eteri Alcheni Alcani fosfolipidi R 1, R 2 = catene acidi grassi non polari Glicerolo, gruppi fosfato e X = parte polare

9 R O CH 2 C O CHOCR' O H 2 C O P O O - O CH 2 C NH 3 + H COO - Fosfatidilserina Fosfatidiletanolammina NH 3 + O O - O P OH 2 C O RCOCH ' O C CH 2 O R CH 2 CH 2 Fosfatidilcolina CH 2 O O - O PO H 2 C O RCOCH O C CH 2 O R ' CH 2 N + (CH 3 ) 3 H Fosfatidilinositolo CH 2 O O - O PO OH OH OH OH O H H H H H H CH CH 2 O O O O C C R R'

10 Cromatografia su strato sottile (TLC) Applicazione del campione Corsa cromatografica Visualizzazione Interpretazione dei risultati

11 fronte del solvente 1 cm. A. Disegnare la linea di deposizione e il fronte del solvente con una matita linea di deposizione 1 cm. B. Risospendere i campioni in cloroformio C. Depositare il campione mediante capillari o siringhe tipo Hamilton 1. Applicazione del campione

12 2. Corsa cromatografica Lastra cromatografica Camera di slivuppo A. La lastra viene posta in una vaschetta chiusa saturata dai vapori del solvente di sviluppo B. Il campione viene trasportato attraverso la fase stazionaria C. Rimuovere la lastra dalla cameretta quando il solvente ha raggiunto la linea superiore Solvente di sviluppo (fase mobile) }

13 3. Visualizzazione dei risultati A. Attendere levaporazione del solvente dalla superficie della lastra C. Un metodo fisico si basa sullosservazione della lastra alla luce ultravioletta (254 nm 365 nm). I metodi chimici consistono nello spruzzare sulla lastra reagenti cromogeni come soluzioni di H 2 SO 4, di iodio, blu di molibdeno ecc.. B. Per rilevare la posizione dei componenti esistono metodi chimici e metodi fisici

14 4. Interpretazione dei risultati A. Determinare il fattore di ritenzione (R f ) per ciascuna macchia. B. I componenti incogniti vengono identificati per confronto con gli R f degli standard. miscela std std std incognita distanza tra macchia e linea di deposizione distanza tra il fronte del solvente e linea di deposizione R f = ? ? ? d S d B d A d c R f componente A = R f componente B = dAdSdAdS dBdSdBdS

15 I componenti meno polari presentano una minore interazione con la silice e migrano piu velocemente I componenti piu polari stabiliscono maggiori interazioni con la silice e migrano piu lentamente I componenti neutri migrano con il fronte del solvente

16 TLC preparativa (purificazione dei singoli componenti) Estrazione dei lipidi (Bligh & Dyer) Scraping della silice

17 Analisi quantitativa

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