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ESERCITAZIONE DI FISIOLOGIA ANIMALE Lesercitazione è suddivisa in due fasi: Estrazione dei lipidi di membrana (Bligh & Dyer) Analisi del profilo lipidico.

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1 ESERCITAZIONE DI FISIOLOGIA ANIMALE Lesercitazione è suddivisa in due fasi: Estrazione dei lipidi di membrana (Bligh & Dyer) Analisi del profilo lipidico mediante: CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC) MALDI-TOF

2 ESTRAZIONE DEI LIPIDI DI MEMBRANA (metodo di Bligh & Dyer) SN Pellet - Si parte da unaliquota di coltura cellulare di 0.8 ml, in provetta da centrifuga - Aggiungere 2 ml di CH 3 OH e agitare gentilmente per 15 min (denaturazione delle proteine) - Aggiungere 1 ml di CHCl 3 e agitare per 15 min (ripartizione dei lipidi nella fase organica): si nota la precipitazione delle proteine denaturate bianche. MONOFASE Il rapporto dei solventi è: H 2 O/CH 3 OH/CHCl 3 = 0,8/2/1 Centrifuga: 3500 rpm x 10 min

3 BIFASE: 0.9:1:1 H 2 O/ CHCl 3 /CH 3 OH - Aggiungere 1 ml di CHCl3 e 1 ml di KCl 0.2M Fase metanolo acqua Fase cloroformio-lipidi -Attendere la separazione tra fase acqua/metanolo (superiore incolore) e fase cloroformio. Nella fase cloroformio sono solubilizzati i lipidi; mentre la proteina denaturata si dispone allinterfase. - Raccogliere la fase cloroformio in unaltra provetta. - Portare a secco i lipidi disciolti nella fase cloroformio sotto flusso di N 2. - I lipidi possono essere pesati e risospesi in un piccolo volume di CHCl 3. Infine, lestratto lipidico può essere analizzato mediante TLC.

4 Linea di deposizione Linea del fronte 1 cm 7.5 cm 0,5 cm 1 cm pozzetto spazio tra due pozzetti Preparazione di una lastra per TLC Lavaggio della lastra con CHCl 3 /CH 3 OH (1:1) Attivazione in stufa 180 °C per 2 h

5 Estrazione dei lipidi ( Bligh &Dyer) Allestimento bancone: Pipette graduate in vetro Pipette Pasteur in vetro Provette in vetro pirex (vol=15 ml) Palla di Peleo Carta da bancone Agitatore di provette Centrifuga Occorrente: Coltura cellulare di Salinibacter ruber, Halobacterium salinarum CHCl 3 (cloroformio) CH 3 OH (metanolo) H 2 O bidistillata KCl 0.2M (cloruro di potassio)

6 Cromatografia su strato sottile Occorrente: Lastre in vetro ricoperte da silice (Merck 20x10 cm, spessore 0,2 mm) Microsiringhe Hamilton (5-10 µl) Cameretta cromatografica Cilindri in vetro Solventi organici Carta da bancone Solventi da preparare: Russel acido: CHCl 3 /CH 3 OH/CH 3 COOH/H 2 O (85/15/10/3.5 vol/vol) Solvente A : CHCl 3 /CH 3 OH/CH 3 COOH (65/30/4 vol/vol)


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