La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Identificazione mediante analisi dei lipidi della parete.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Identificazione mediante analisi dei lipidi della parete."— Transcript della presentazione:

1

2 Identificazione mediante analisi dei lipidi della parete

3 gli acidi micolici acidi grassi, ramificati in posizione βacidi grassi, ramificati in posizione β presenti nella parete batterica dei generi:presenti nella parete batterica dei generi: Corynebacterium: atomi di CCorynebacterium: atomi di C Rhodococcus: atomi di CRhodococcus: atomi di C Nocardia: atomi di CNocardia: atomi di C Gordonia: atomi di CGordonia: atomi di C Tsukamurella: atomi di CTsukamurella: atomi di C Mycobacterium: atomi di CMycobacterium: atomi di C presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobattericipresenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici alfa-, alfa'-, metoxi-, keto-, epoxi-, wax ester-, omega' metoxi-mycolatialfa-, alfa'-, metoxi-, keto-, epoxi-, wax ester-, omega' metoxi-mycolati

4 la parete dei micobatteri peptidoglicano arabino-galattano acidi micolici altri lipidi complessi

5 struttura degli acidi micolici Catena alchilica principale (38-58C) Ramificazione alchilica (21-23C) CHOH CH 2 CH-COOH

6 separazione dei vari ac. micolici su piastre di gel di silice e successivo evidenziamento mediante opportune colorazioniseparazione dei vari ac. micolici su piastre di gel di silice e successivo evidenziamento mediante opportune colorazioni identificazione delle macchie in base alla loro posizione rispetto al fronte di avanzamento della fase mobileidentificazione delle macchie in base alla loro posizione rispetto al fronte di avanzamento della fase mobile identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi micoliciidentificazione del microorganismo in base al pattern di acidi micolici cromatografia su strato sottile

7

8 pirolisi degli acidi micolici in esteri metilici saturi di 22, 24 e 26 atomi di Cpirolisi degli acidi micolici in esteri metilici saturi di 22, 24 e 26 atomi di C separazione dei prodotti di clivaggio nonché degli acidi grassi saturi ed insaturi (fra i quali lacido tubercolostearico) e degli alcolseparazione dei prodotti di clivaggio nonché degli acidi grassi saturi ed insaturi (fra i quali lacido tubercolostearico) e degli alcol identificazione delle catene di C preferibilmente usando la spettrometria di massaidentificazione delle catene di C preferibilmente usando la spettrometria di massa identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi grassiidentificazione del microorganismo in base al pattern di acidi grassi gas-cromatografia

9 gas-cromatografia

10 il principio della HPLC la fase mobile è spinta ad elevata pressione attraverso la fase stazionaria (particelle paccate) contenuta nella colonnala fase mobile è spinta ad elevata pressione attraverso la fase stazionaria (particelle paccate) contenuta nella colonna il campione viene iniettato direttamente all'interno del flusso della fase mobileil campione viene iniettato direttamente all'interno del flusso della fase mobile la separazione delle varie frazioni del campione è determinata dalla diversa polarità delle due fasila separazione delle varie frazioni del campione è determinata dalla diversa polarità delle due fasi le frazioni eluite vengono quantizzate in base alla loro assorbanzale frazioni eluite vengono quantizzate in base alla loro assorbanza

11 le componenti del sistema solventi pompe colonna cromatogramma iniettore recorder detector

12 preparazione del campione saponificazionesaponificazione una ansata di colonie in potassa alcolica per 1h a 121°Cuna ansata di colonie in potassa alcolica per 1h a 121°C estrazioneestrazione aggiunta di cloroformio dopo acidificazioneaggiunta di cloroformio dopo acidificazione evaporazione dello strato non acquosoevaporazione dello strato non acquoso aggiunta di bicarbonato e ulteriore evaporazioneaggiunta di bicarbonato e ulteriore evaporazione solubilizzazione del residuo secco in cloroformiosolubilizzazione del residuo secco in cloroformio derivatizzazionederivatizzazione esterificazione con bromofenacil bromuro, in presenza di catalizzatore, per 40 min a 80°Cesterificazione con bromofenacil bromuro, in presenza di catalizzatore, per 40 min a 80°C evaporazione e aggiunta al residuo secco di cloroformio, ac. cloridrico e metanoloevaporazione e aggiunta al residuo secco di cloroformio, ac. cloridrico e metanolo recupero ed evaporazione dello strato di cloroformiorecupero ed evaporazione dello strato di cloroformio

13 identificazione dei picchi 1 SI 5,3 9,6 TRR=5,3/9,6

14 identificazione dei picchi 2 SI 1 SI 2

15 esempi di profili HPLC M. tuberculosis M. simiae

16 le fasi del processo di identificazione mediante HPLC confronto visivo del profilo comatografico in esame con quelli di specie note identificando, quando necessario, i picchi in base ai tempi di ritenzione relativiconfronto visivo del profilo comatografico in esame con quelli di specie note identificando, quando necessario, i picchi in base ai tempi di ritenzione relativi il riconoscimento, per confronto con i tracciati cromatografici presenti in memoria, è operato da un apposito softwareil riconoscimento, per confronto con i tracciati cromatografici presenti in memoria, è operato da un apposito software

17 i vantaggi dell'impiego della HPLC rapido (poche ore)rapido (poche ore) single-stepsingle-step specie-specificospecie-specifico economicoeconomico utilizzabile per:utilizzabile per: diagnostica clinica (identificazione isolati)diagnostica clinica (identificazione isolati) ricerca (riconoscimento di nuove specie)ricerca (riconoscimento di nuove specie)

18 i limiti della HPLC specie con profili simili (MAC e M. scrofulaceum, nuovi micobatteri a crescita rapida)specie con profili simili (MAC e M. scrofulaceum, nuovi micobatteri a crescita rapida) apparecchiatura costosaapparecchiatura costosa non utilizzabile direttamente sui materiali clinicinon utilizzabile direttamente sui materiali clinici


Scaricare ppt "Identificazione mediante analisi dei lipidi della parete."

Presentazioni simili


Annunci Google