Identificazione mediante analisi dei lipidi della parete

Presentazione sul tema: "Identificazione mediante analisi dei lipidi della parete"— Transcript della presentazione:

1 Identificazione mediante analisi dei lipidi della parete

2 gli acidi micolici acidi grassi, ramificati in posizione β
presenti nella parete batterica dei generi: Corynebacterium: atomi di C Rhodococcus: atomi di C Nocardia: atomi di C Gordonia: atomi di C Tsukamurella: atomi di C Mycobacterium: atomi di C presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici alfa-, alfa'-, metoxi-, keto-, epoxi-, wax ester-, omega' metoxi-mycolati

3 la parete dei micobatteri
altri lipidi complessi acidi micolici arabino-galattano peptidoglicano membrana cellulare

4 struttura degli acidi micolici
Catena alchilica principale (38-58C) Ramificazione alchilica (21-23C) CHOH CH2 CH-COOH

5 cromatografia su strato sottile
separazione dei vari ac. micolici su piastre di gel di silice e successivo evidenziamento mediante opportune colorazioni identificazione delle “macchie” in base alla loro posizione rispetto al fronte di avanzamento della fase mobile identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi micolici

6 cromatografia su strato sottile

7 gas-cromatografia pirolisi degli acidi micolici in esteri metilici saturi di 22, 24 e 26 atomi di C separazione dei prodotti di clivaggio nonché degli acidi grassi saturi ed insaturi (fra i quali l’acido tubercolostearico) e degli alcol identificazione delle catene di C preferibilmente usando la spettrometria di massa identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi grassi

8 gas-cromatografia

9 il principio della HPLC
la fase mobile è spinta ad elevata pressione attraverso la fase stazionaria (particelle paccate) contenuta nella colonna il campione viene iniettato direttamente all'interno del flusso della fase mobile la separazione delle varie frazioni del campione è determinata dalla diversa polarità delle due fasi le frazioni eluite vengono quantizzate in base alla loro assorbanza

10 le componenti del sistema
iniettore pompe colonna solventi detector cromatogramma recorder

11 preparazione del campione
saponificazione una ansata di colonie in potassa alcolica per 1h a 121°C estrazione aggiunta di cloroformio dopo acidificazione evaporazione dello strato non acquoso aggiunta di bicarbonato e ulteriore evaporazione solubilizzazione del residuo secco in cloroformio derivatizzazione esterificazione con bromofenacil bromuro, in presenza di catalizzatore, per 40 min a 80°C evaporazione e aggiunta al residuo secco di cloroformio, ac. cloridrico e metanolo recupero ed evaporazione dello strato di cloroformio

12 identificazione dei picchi 1
TRR=5,3/9,6 SI 5,3 9,6

13 identificazione dei picchi 2
SI1 SI2

14 esempi di profili HPLC M. tuberculosis M. simiae

15 le fasi del processo di identificazione mediante HPLC
confronto visivo del profilo comatografico in esame con quelli di specie note identificando, quando necessario, i picchi in base ai tempi di ritenzione relativi il riconoscimento, per confronto con i tracciati cromatografici presenti in memoria, è operato da un apposito software

16 i vantaggi dell'impiego della HPLC
rapido (poche ore) single-step specie-specifico economico utilizzabile per: diagnostica clinica (identificazione isolati) ricerca (riconoscimento di nuove specie)

17 i limiti della HPLC specie con profili simili (MAC e M. scrofulaceum, nuovi micobatteri a crescita rapida) apparecchiatura costosa non utilizzabile direttamente sui materiali clinici