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Il sequenziamento genico Struttura del DNA Doppia elica formata da due filamenti di ac. nucleico uniti da ponti ad idrogeno Ac. nucleico: catena di nucleotidi.

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2 Il sequenziamento genico

3 Struttura del DNA Doppia elica formata da due filamenti di ac. nucleico uniti da ponti ad idrogeno Ac. nucleico: catena di nucleotidi Nucleotide: nucleoside + ac. fosforico Nucleoside: desossiribosio + base azotata Basi azotate: adenina, citosina, guanina e timina

4 Le basi azotate Unico elemento variabile allinterno dellac. nucleico Sequenziamento: individuazione della successione delle basi azotate nel filamento di ac. nucleico

5 Le basi azotate Complementarità fra i due filamenti: A-T G-C 5-3: forward 3-5: reverse

6 Sintesi del DNA

7 Prima del sequenziamento Scelta del bersaglio Presente in tutti gli organismi Conservato ma contenente regioni variabili Disponibilità di un database contenente le sequenze con cui si vuol confrontare il bersaglio Scelta dei primer Estrazione del DNA dalle cellule

8 Le fasi del sequenziamento Amplificazione del bersaglio Verifica dellamplificato Purificazione Verifica PCR di sequenziamento Purificazione dellamplificato

9 Miscela di sequenziamento Primer Due amplificazioni parallele usando in ciascuna un solo primer (per i filamento forward o reverse) Tampone Polimerasi Nucleotidi Nucleotidi terminator

10 Nucleotide (A) che blocca lallungamento del filamento di ac. nucleico poiché la mancanza del gruppo ossidrile in 3 impedisce lattacco allac. fosforico del nucleotide successivo

11 PCR di sequenziamento (metodo manuale) Si esegue in quattro provette diverse Tutte e quattro le provette contengono: polimerasi, nucleotidi normali e primer Ciascuna delle quattro provette contiene inoltre un diverso tipo di nucleotide terminator (adenina-terminator, guanina-terminator,...) Annealing del primer Allungamento del primer: Legame di un nucleotide normale: lallungamento prosegue Legame di un nucleotide terminator: lallungamento si blocca In ciascuna delle 4 provette contenente nucleotidi terminator con una diversa base azotata si formano soltanto filamenti che terminano con tale base. Tali filamenti avranno tutte le lunghezze possibili a seconda che il nucleotide terminator si sia legato alla 1°, 2°,.., ennesima, posizione possibile

12 Il principio del sequenziamento (metodo manuale) Si esegue una elettroforesi disponendo i prodotti di amplificazione delle 4 provette in 4 corsie parallele così che in ognuna di esse siano presenti filamenti che terminano con una diversa base Si usa un gel ad altissima risoluzione, capace di separare frammenti di DNA che differiscono fra loro per un solo nucleotide. Il gel (0,3-0,4 mm di spessore) è interposto fra due lastre di vetro di notevole lunghezza (40 cm circa ).

13 Il principio del sequenziamento (metodo manuale) La migrazione è inversamente proporzionale alla lunghezza del filamento La posizione della banda indica la posizione occupata allinterno della sequenza, mentre il tipo di base è indicato dalla corsia in cui tale banda si trova ATACAGCTGTT......

14 Nucleotidi terminator marcati (metodo automatico) I nucleotidi terminator sono marcati con un fluorocromo Si usa un fluorocromo diverso per ciascuno dei quattro tipi di terminator

15 PCR di sequenziamento (metodo automatico) Si esegue in una singola provetta Tutte le provette contengono: polimerasi, nucleotidi normali, nucleotidi terminator e primer I nucleotidi terminator sono marcati con fluorocromi Annealing del primer Allungamento del primer: Legame di un nucleotide normale: lallungamento prosegue Legame di un nucleotide terminator: lallungamento si blocca Nella provetta si formano contemporaneamente filamenti che avranno tutte le lunghezze possibili a seconda che il nucleotide terminator si sia legato alla 1°, 2°,.., ennesima, posizione della sequenza. Si avranno quindi contemporaneamente filamenti terminanti con ciascuna delle quattro basi

16 Il prodotto della PCR (sequenziamento automatico) Se il bersaglio è composto da n nucleotidi si avranno filamenti di tutte le lunghezze possibili, da 1 ad n Indipendentemente dalla lunghezza, tutti i filamenti terminanti con adenina emetteranno fluorescenza di tipo A ; quelli terminanti con citosina, di tipo B; quelli terminanti con guanina, di tipo C, e quelli terminanti con timina, di tipo D

17 Il sequenziatore automatico E un apparecchio che, dopo aver prelevato il prodotto della PCR di sequenziamento, lo sottopone ad elettroforesi allinterno di un capillare Un raggio laser colpisce il capillare eccitando la fluorescenza dei fluorocromi che lo attraversano Un cellula fotoelettrica rileva i segnali fluorescenti che vengono memorizzati

18 Lelettroferogramma Durante lattraversamento del capillare i vari spezzoni di DNA vengono colpiti da un raggio laser Il raggio laser eccita i vari fluorocromi che marcano i singoli spezzoni Ciascuno dei quattro fluorocromi emette una diversa lunghezza donda Una cellula fotoelettrica rileva sequenza, tipo ed intensità delle varie emissioni luminose ed il tutto viene registrato in forma grafica La sequenza dei picchi corrisponde alla sequenza dei nucleotidi; il tipo (colore del picco) corrisponde al tipo di base azotata mentre lintensità (altezza del picco) è irrilevante

19 Lelettroferogramma Normalmente il sistema interpreta automaticamente lelettroferogramma Quando linterpretazione non è ovvia, il sistema inserisce una N al posto della base azotata mancante, questa può essere corretta manualmente, dopo aver letto ad occhio lelettroferogramma, o in base alla sequenza del filamento reverse G

20 Il sequenziamento in microbiologia Identificazione Sequenziamento di regioni specie-specifiche Antibiogramma Sequenziamento di regioni in cui possono aversi mutazioni associate alla resistenza ai farmaci Filogenesi Confronto della sequenza della medesima regione in specie diverse, per ricostruirne la storia evolutiva

21 Identificazione mediante sequenziamento Scelta della regione da sequenziare 16S rDNA Internal transcribed spacer 23S rDNA hsp65 rpoB Sequenziamento Confronto della sequenza con quelle presenti in un database

22 GenBank Banca dati pubblica (in Internet) contenente circa 50 milioni di sequenze geniche delle più varie regioni di, praticamente, tutti gli organismi viventi Chiunque può depositare (ovviamente non in maniera anonima) sequenze in GenBank E possibile confrontare la propria sequenza con tutte quelle presenti in GenBank Un motore di ricerca individua e restituisce le sequenze presenti in GenBank che hanno il più elevato grado di somiglianza con la sequenza in esame

23 GenBank BLAST

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25 GenBank, risultati

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28 Interpretazione Identità 100% con una specie nota Identità 100% con una sequenza non appartenente a specie conosciute Identità <100% con una specie nota (il significato varia a seconda della regione in esame) Verifica delle discordanze Correzione della sequenza (identità 100%) Nuovo sequevar Nuova specie

29 Antibiogramma mediante sequenziamento Scelta della regione da sequenziare rpoB katG embB pncA Sequenziamento Confronto con la sequenza wild type

30 Interpretazione Confronto con la sequenza wild type Identità 100% = sensibilità Mutazioni = resistenza Conferma con lantibiogramma fenotipico

31 Allineamento delle sequenze

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33 Le mutazioni Principali mutazioni Inserzione Delezione Sostituzione Conservativa Non conservativa Mutazioni: errori della natura? La selezione naturale premia le mutazioni favorevoli e elimina quelle sfavorevoli Regioni genetiche più o meno tolleranti

34 Mutazioni e filogenesi Evoluzione da un organismo ancestrale Sviluppo di nuovi organismi per effetto di mutazioni e selezione naturale Il numero, il tipo e la posizione delle mutazioni comparse, in regioni conservate, durante levoluzione costituiscono il metro con cui è possibile misurare le distanze filogenetiche Numero di mutazioni tanto più elevato quanto più remoto è il progenitore ancestrale Organismi con mutazioni concatenate appartengono allo stesso phylum

35 Regioni di studio Ideale: lintero genoma Compromesso accettabile:16S rRNA Sequenziamento Multiallineamento Costruzione dellalbero filogenetico

36 Lalbero filogenetico 2 mutazioni 5 mutazioni 7 mutazioni 4 mutazioni

37 Lalbero filogenetico 2 mutazioni 5 mutazioni 7 mutazioni 4 mutazioni

38 Non sempre, alberi basati su sequenze di regioni diverse, sono compatibili Non sempre alberi basati sulle stesse sequenze, ma costruiti con algoritmi diversi, sono sovrapponibili Lalbero filogenetico, limiti

39 Conclusioni Luso del sequenziamento per lidentificazione e lantibiogramma è particolarmente vantaggioso con: Organismi a crescita lenta Organismi difficilmente coltivabili Organismi non coltivabili Organismi morti (paleomicrobiologia) Per lidentificazione il sequenziamento è il metodo di riferimento; NON lo è per lantibiogramma Il sequenziamento è una metodica: Rapida Automatizzata Economica


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