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Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata.

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Presentazione sul tema: "Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata."— Transcript della presentazione:

1 Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati e quantitativi Analisi PCR quantitativa Real time PCR

2 impiego di marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione PCR. La misurazione della fluorescenza dà in tempo reale la quantità dello specifico prodotto di PCR impiego di marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione PCR. La misurazione della fluorescenza dà in tempo reale la quantità dello specifico prodotto di PCR Termociclatore con detector per fluorocromi e software per analisi dati Linea di base (baseline): valore al di sopra del quale inizia laccumulo di un amplificato Linea soglia (Threshold): scelta dalloperatore in modo da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale Ciclo soglia: E il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold Analisi PCR quantitativa Real time PCR Analisi PCR quantitativa

3 Linea soglia scelta dalloperatore In maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale Indica il valore al di sopra del quale inizia laccumulo di un amplificato E il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold

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5 Real time PCR Sistemi di rilevamento 1. Coloranti che si intercalano nella doppia elica SYBR Green 1 Tm random La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici Allinizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente

6 Durante lallungamento si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all aumento del numero di copie dellamplicone

7 SYBR Green 1 metodica semplice, non costosa MA aspecifica Analisi della curva di melting Tm melting peak

8 2. Sonde specifiche marcate con molecole fluorescenti Primer RQQ53 Sonde TaqMan R REPORTER: fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter Q Si libera 1 molecola di reporter per ogni copia di DNA duplicata è disegnata in modo da ibridarsi allinterno La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare: è disegnata in modo da ibridarsi allinterno del frammento amplificato nella reazione di PCR

9 Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q RQ Forward primer Probe Reverse primer

10 Quantificazione ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i C T Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve) Gli unknowns vengono quantificati paragonando il loro C T con quello del controllo endogeno

11 VOGLIO QUANTIFICARE IN TEMPO REALE LA PRESENZA DI UN MICRORGANISMO ALLINTERNO DI UNA MATRICE 1. Devo avere a disposizione una sonda specie-specifica in grado di amplificare una regione specifica del genoma del microrganismo in esame, di dimensioni comprese tra bp verifica in PCR (specificità e curva di melting) 2. Devo preparare concentrazioni cellulari a titolo noto da cui estrarre e dosare il DNA totale 10 8 cellule 125 ng 10 6 cellule 10 ng 10 4 cellule 0.9 pg 3. Devo sottoporre ciascun campione ottenuto a q-PCR per ottenere delle curve di calibrazione, per trovare il range di linearità e la corrispondenza tra: CT : quantità di DNA : quantità di cellule

12 A QUESTO PUNTO POSSO ANALIZZARE LA MATRICE IN ESAME Estraggo il DNA totale dalla matrice ed eseguo una real-time PCR utilizzando tutti i dati ottenuti in fase di messa a punto del metodo: primers specifici curva di calibrazione

13 Quantitativa relativa Plot di amplificazione Numero di cicli C T Sample Control

14 Studio dellespressione genica 1. Primers specifici per amplificare il gene di interesse 2. Estrazione dellRNA e Real-time PCR per valutare se il gene viene trascritto L RNA estratto deve venire retrotrascritto in DNA

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16 Quantitativa relativa: analisi dei dati Normalizzare il gene target con un controllo endogeno (ref) espresso costitutivamente ( C T ) in una condizione di controllo Variare le condizioni di crescita del ceppo in esame ed eseguire lanalisi. Il controllo endogeno non dovrebbe variare. La variazione di espressione del gene in studio va valutata in riferimento allespressione dello stesso gene nelle condizioni di controllo Comparare ciascun C T così ottenuto con il C T del controllo ratio = ( E target ) ΔCt target (control-treated) (E ref ) ΔCt ref (control-treated) E = efficienza della reazione: in teoria ad ogni ciclo di amplificazione si ha raddoppio delle copie di DNA Il valore così ottenuto permette di determinare la concentrazione relativa del target

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