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Lez 13-14 IngGen 24_XI_06 Race e nested PCR Date degli esami sessione invernale - scritto 18 Gennaio 2007; orale 24 Gennaio 2007 - scritto 15 Febbraio.

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1 Lez IngGen 24_XI_06 Race e nested PCR Date degli esami sessione invernale - scritto 18 Gennaio 2007; orale 24 Gennaio scritto 15 Febbraio 2007; orale 21 Febbraio 2007

2 Regole per disegnare i primers Ricapitoliamo le regole essenziali Escludere dai primers: - terminazioni AT o GC che si possono ripiegare - palindromi interne e tantomeno alle estremità - terminazioni complementari nella coppia di primers (formazione di dimeri di primers) Preferire nei primers: - terminazioni 3 in G o C che favoriscono un legame più forte - la lunghezza dei primers generalmente tra 15 e 25 bp (salvo eccezioni motivate) - T°C melting omogenee per la coppia di primers (calcolo T melting 4 °C per G/C ; 2 °C per A/T - T annealing 5-6 gradi sotto la T melting

3 Altre regole di scelta primers Paradossalmente si potrebbe pensare che un primer più lungo sia più specifico Invece ha più probabilità di trovare regioni omologhe allinterno del genoma da cui amplificare Dopo la scelta confronto dei primers contro le sequenze genomiche per analizzare possibili appaiamenti spuri 5 3primer 3 5 templato È più efficiente lomologia di un primer al 3 che al templato 3 5

4 Informazioni che caratterizzano una PCR Informazioni sulla sequenza da amplificare, conoscenza della sequenza Caratterizzazione dei primers e dellamplicone: - scegliere i primers secondo i criteri necessari (si indicherà la lunghezza di ognuno e dove mappano sulla sequenza di riferimento dal nucleotide x al nucleotide y per ognuno dei due) - di conseguenza si identifica lamplicone la cui lunghezza sarà contata dal 5 del primo nucleotide del primer frw al 3 dellultimo nucleotide del primer rev (dato che i primers vengono incorporati dalla polimerasi) 1° nucleotide 5 del primer ultimo nucleotide 3 del primer amplicone

5 Correzione parametri di una PCR La PCR deve dare dei prodotti che approssimano gli attesi Quando i prodotti non corrispondono agli attesi: Smear - poca specificità nonostante i primers specifici - si gioca sulla temperature di annealing, temp. su - cicli troppo lunghi rendono aspecifica lamplificazione Bassa amplific. - stringenza annealing alta, temp. giù - ciclo troppo corto, allungare tempi di annealing o extension Ritocco dei parametri del protocollo, le variabili, il ciclo,

6 Aggiustare il protocollo Dopo le evidenze sperimentali si ottimizza il sistema con ritocchi empirici del protocollo Se la lunghezza dellamplicone è diversa dallatteso: - sbaglio sul genoma o sul calcolo - polimorfismo Accertamento tramite sequenziamento della corrispondenza dellamplificato In caso di polimorfismo va dimostrato e si deve clonare e osservare su un certo numero di genomi Eliminare la possibilità di errore, ripetere lesperimento con altri DNA

7 Controlli della PCR Controlli di estrazione: quali? - ripetibilità della amplificazione - ripetibilità su campioni indipendenti - univocità di amplificazione col protocollo ottimizzato Controlli di contaminazione: quali? - a. estrazione di controllo con i prodotti di estrazione - assenza di amplificazione su a. - b. assenza di amplificazione su tutti i prodotti di reazione della PCR: primers taq polimerase nucleotidi tampone acqua di diluizione

8 (Rapid Amplification of cDNA Ends ) La RACE è una tecnica per lamplificazione di sequenze nucleotidiche, usando come stampo un mRNA tra una ben definita regione interna ed una sua estremità (3 o 5). Questa tecnica, nota anche come one-sided PCR o anchored PCR, puo essere considerata una variante della più classica PCR. La RACE richiede almeno una regione a sequenza nota e interna allmRNA che si vuole tipizzare. LIMITE PRINCIPALE Principi della RACE

9 Dalle banche EST (expressed sequence tag); Da studi di funzione (per esempio EXON e PROMOTER TRAPPING); Un aiuto non indifferente è dato: DallIBRIDAZIONE con sequenze conservate evolutivamente e/o funzionalmente. Cosa serve per fare la RACE

10 mRNApoly A5 noto3 ignoto sintesi del I filamento di cDNA con RT con primer oligo dT TTTTTT 5 3 trattamento con RNase PCR con primer frw. noto e primer rev. con coda aggiunta TTTTTT 5 noto 3 5 prim rev. prim.frw TTTTTT ignoto Race ricerca del 3 ignoto

11 Scelta dei primers per la RACE 3 Il primo primer obbligato è quello per la RT (poly T) Il secondo primer viene scelto nella regione nota e deve essere specifico cDNA 53 TTTTT regione nota regione ignota primer specifico Una amplificazione con un solo primer specifico potrebbe dare dei prodotti anche aspecifici. Quale strategia si può adottare ? Esiste una possibilità per aumentare la specificità di reazione, per ottenere il prodotto specifico corrispondente a ciò che sto cercando ?

12 RACE 3 TTT…..TTT5 5 AAA….AAA n mRNA poly(A) tail 1 - Annealing tra la coda di polyA dellmRNA e un primer contenente una coda di oligo(dT) allestremità 3 e retrotrascizione 5 AAA….AAA n TTT…..TTT5 3 Alla facile degradabilità dellRNA; Allalta probabilità di avere un RNA con strutture secondarie; Alla bassa specificità di questa fase;

13 2 - Degradazione del templato di RNA TTT…..TTT Amplificazione per PCR usando un primer specifico del gene (GSP) ed uno specifico alla nuova estremità 5(AUAP o UAP) TTT…..TTT5 3 GSP AUAP UAP …e la specificità??? gsp = gene specific primer Uap = universal amplification primer Auap = abridget univ.ampl. primer Race fasi successive

14 GSP 2 TTT…..TTT 5 3 AUAP UAP 3 5 La SPECIFICITA può essere garantita da un ulteriore amplificazione con un secondo primer gene specifico (GSP2) - SEQUENZIAMENTO DIRETTO; - CLONAGGIO E SEQUENZIAMENTO; - STUDI FUNZIONALI; Specificità GSP2 I primers UAP e AUAP servono per avere delle T melting su cui disegnare i GSP

15 Nested PCR o PCR interna cDNA 53 TTTTT regione nota regione ignota I primer specifico II primer specifico Il secondo primer specifico dovrà corrispondere ad una regione interna a quella nota e più al 5 del cDNA e cioè più al 3 nella regione nota dell mRNA La seconda amplificazione perderà la regione corrispondente al primo primer, -si tratta di sequenza già nota e non si perde informazione, -probabilità alta di avere un frammento specifico - probabilità bassa di due sequenze omologhe limitrofe due volte nel genoma. - si può ricorrere ad un terzo primer interno.

16 cosa è unaNested PCR Per aumentare la specificità con PCR ottimizzata e non ulteriormente ottimizzabile con i parametri di reazione Se si deve avere un prodotto di amplificazione con alta efficienza eliminando altri prodotti indesiderati -a) omologia parziale dei primers già ottimizzati -b) sequenze omologhe, pseudogeni, sequenze duplicate caso a: trovare una seconda coppia di primers interni al primo amplicone (probabilità limitata di omologia di entrambe le sequenze in una stessa regione) caso b: cercare le regioni divergenti dove scegliere altre coppie di primers primer frw. I primer rev.I primer frw. II primer rev.II II amplicone interno

17 PCR nested primo esempio Quando abbiamo un amplicone per esempio di 500 bp pr frw pr rev ° amplicone II pr frw II pr rev 2° amplicone nested il secondo amplicone sarà più breve secondo la posiz. dei primers

18 PCR nested RACE 3 Nel caso di una RACE 3 cambia solo il verso dei primers interni alla regione nota ed il primer del 3 ignoto può essere anche un poly T con una coda per avere una T° melting più consona ai primers interni Solammente il primer della seq nota si può cambiare con un secondo più interno mRNA 5 3 AAAA RT reverse trascrittasi cDNA 3 TTTT 5 RACE 3 I filamento 5 TTTT 3 seq nota amplicone finale contenente il 3 ignoto I prim II prim II filamento AAAA 3 5 prim esterno con coda eventuale TTTT

19 RACE 5 Cerchiamo il 5 ignoto Dobbiamo comunque ottenere il cDNA ed utiliziamo gli stessi metodi utilizzati per ottenere il cDNA della ricerca del 3 ignoto. Cè anche la possibilità di fare la RT direttamente con un primer noto. Lunico problema è che pochi sono gli enzimi RT che funzionano ad alta temperatura per cui è possibile che il primer specifico non faccia una RT molto specifica. Per questo motivo si tende a fare una RT di tutti i messaggeri. Dopodichè si deve fare una terminal transferasi come spiegato nelle diapositive successive, si preparano dei primers con una coda che possono aumentare lefficienza rispetto al primer poly C. Si devono usare invece i primers interni specifici nested in maniera simile alla RACE 3.

20 5 AAA….AAA n mRNA poly(A) tail 1 - Annealing tra una regione interna dellmRNA e un primer gene specifico (GSP1); oppure con poly T o random priming (esanucleotidi random). GSP1 NON deve essere interno o sovrapposto ad introni; NON deve avere una Tm molto alta (lavora circa a 42°C); NON deve avere una bassa specificità o omologia con altri geni; Race 5 fase I

21 2 - Retrotrascrizione e tailing allestremità 3 del cDNA 5 AAA….AAA n 5 3 GSP1 Degradazione 5 3 GSP1 Purificazione del cDNA 3 5 GSP1 CCC….CCC Race 5 fase II

22 3 - Amplificazione per PCR usando un secondo primer specifico al gene (GSP2) ed uno contenente una coda di oligo(dC) allestremità GSP1 CCC….CCC GIG…..GGI 5 GSP2 La SPECIFICITA può essere garantita da un ulteriore amplificazione con un altro primer gene specifico (GSP2) GSP2 GSP3 5 3 CCC….CCC 5 GIG….GGI 3 UAP AUAP Race 5 fase III

23 mRNApoly A Sintesi del I filamento di cDNA tramite rev.transcript. primer rev. specifico cDNA singolo filamento rev. transcript. a temp. restrittiva con enzima mutante RH - trattamento con RNase 5 3cDNA singolo filamento trattamento con terminal transferase CCCC primer frw di poly G 5 3cDNA singolo filamento CCCC sintesi secondo filamento PCR selettiva c cc cc c c cc c primer rev. specif. race 5ignoto

24 dopo la sintesi del I filam. di cDNA e la terminal transferase, PCR selettiva con II primer rev. selettivo interno 5 3 CCCC I primer rev. specif. 53 II primer rev. spec. interno (nested) GGGGG CCCCCC 5 sconosciuto II primer rev. spec. interno (nested) Clonaggio in un vettore per inserzione con estremita coesive per restrizione delladattatore o con A-T Race 5 ricapitolazione

25 Clonaggio in plasmidi dedicati di prodotti PCR con TAQ polymerase w.t. si hanno aggiunte di A terminali spuri TAQ proof reading o altri producono ampliconi blunt ends Secondo che enzima si usa, si sceglie un plasmide adeguato. Esistono in vendita: - plasmidi gia linearizzati con coda di T terminale per facilitare la ligasi tra lamplicone ed il plasmide - plasmidi con topoisomerasi coniugata allestremita del plasmide che attacca direttamente lamplicone senza bisogno di ligasi Clonaggio dei prodotti PCR


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