La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

MODULO GENETICA METODI PER LA RICERCA DI MUTAZIONI NEL DNA Lezione III.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "MODULO GENETICA METODI PER LA RICERCA DI MUTAZIONI NEL DNA Lezione III."— Transcript della presentazione:

1 MODULO GENETICA METODI PER LA RICERCA DI MUTAZIONI NEL DNA Lezione III

2 Relazione tra condizioni patologiche umane ed elementi genetici

3 Linee Guida per I test genetici ISS DIAGNOSTICI consentono di stabilire una diagnosi o di confermare un sospetto clinico in un individuo già affettoconsentono di stabilire una diagnosi o di confermare un sospetto clinico in un individuo già affetto permettono di stabilire unassociazione tra Malattia, Gene, Mutazione Ereditariapermettono di stabilire unassociazione tra Malattia, Gene, Mutazione Ereditaria Validità Clinica: Sensibilità probabilità che il test sia positivo in soggetti con la malattia, Specificità la probabilità che il test sia negativo in soggetti senza la malattia

4 PRECLINICI o PRESINTOMATICI consentono di valutare se un soggetto asintomatico possa sviluppare in futuro la malattia

5 VALUTAZIONE DELLA SUSCETTIBILITA GENETICA consentono lindividuazione di genotipi che comportano un aumento di rischio a sviluppare una determinata patologia in seguito allesposizione a fattori ambientali favorenti o alla presenza di altri fattori genetici scatenanti Linee Guida per I test genetici ISS

6 INDIVIDUAZIONE DEGLI ETEROZIGOTI in caso di patologie autosomiche recessive, finalizzate alla prevenzione della nascita degli omozigoti Linee Guida per I test genetici ISS INDAGINI MEDICO-LEGALI consentono laccertamento o lesclusione di paternità e lattribuzione di tracce biologiche a determinati individui, con un grado di probabilità molto elevato

7 Consulenza genetica pre-test Estrazione del DNA genomico da sangue periferico Analisi molecolare: PCR e sequenziamento DiagnosiConsulenza genetica post-test ITER PER UN TEST GENETICO

8 Fase preanalitica ACCETTAZIONE del CAMPIONE: Consulenza genetica Consenso informatoinformato Nome del paziente, Data di nascita, Luogo di nascita del paziente, dei genitori e dei nonni, Origine etnica, Storia familiare (raccomandata in tutti i casi) Conoscenza dei test genetici da parte di chi richiede lesame

9 Relazione tra condizioni patologiche umane ed elementi genetici

10 MUTAZIONI E MALATTIE GENETICHE EREDITARIE Le mutazioni sono responsabili di un gran numero di malattie ereditarie (emofilia, fibrosi cistica, distrofia muscolare, degenerazioni retiniche…) Isolare dallintero genoma il tratto di DNA che si desidera studiare Ottenere molteplici copie (amplificazione) della sequenza di interesse Presupposti necessari per lo studio di geni o di sequenze di interesse

11 Tecniche utilizzate nella diagnostica molecolare Sequenziamento diretto PCR CSGE DGGE DHPLC

12 Mediante tecniche di biologia molecolare ogni segmento di genoma di interesse può essere amplificato sufficientemente per analizzarne in dettaglio la sequenza AMPLIFICAZIONE DEL GENE DI INTERESSE

13 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) (PCR) 1983 Kary Mullis scopre la reazione a catena mediata dalla polimerasi 1985 Anno della pubblicazione del primo esperimento La PCR rivoluziona la biologia molecolare

14 Il processo, ad alta efficienza, permette di amplificare milioni di volte una sequenza specifica in 2-4 ore. CRESCITA ESPONENZIALE 2n2n n=numero di cicli

15 SEQUENZIAMENTO manuale automatico PCR DGGE CSGE SSCP TECNICHE DI SCREENING

16

17 Wild-type Paziente Wild-type DHPLC

18 Adenina Guanina Citosina ddTimina ddAdenina ddGuanina ddCitosina + dNTPddNTP marcati LA REAZIONE AVVIENE IN UNA SOLA PROVETTA SANGER IN AUTOMATICO Timina Ogni ddNTP è marcato con un diverso fluorocromo

19 SANGER IN AUTOMATICO Denaturazione del prodotto di PCR

20 Primer 1 SANGER IN AUTOMATICO Annealing del primer

21 Estensione: la DNA polimerasi inizia lestensione del filamento a partire dallestremità 3 del primer in presenza di dNTPS e ddNTPS. Primer 1 DNA polimerasi SANGER IN AUTOMATICO

22 Estensione Primer 1 DNA polimerasi SANGER IN AUTOMATICO

23 Lelica del DNA viene estesa finchè non viene incorporato un ddNTP Primer 1 ddNTP SANGER IN AUTOMATICO

24 Lelica neosintetizzata viene rilasciata e lelica originale è pronta per essere estesa di nuovo. ddNTP SANGER IN AUTOMATICO

25 Si ripete il processo : denaturazione 95° Primer 1 Annealing Estensione 60° 25 CICLI SANGER IN AUTOMATICO

26 La sintesi procede: grazie alla incorporazione casuale dei ddNTPs vengono sintetizzate centinaia di copie di DNA, ciascuna terminante con una diversa base. Ogni frammento neosintetizzato differisce dagli altri per una base in lunghezza. 27 basi 25 basi 26 basi 24 basi 28 basi Gruppo di frammenti SANGER IN AUTOMATICO

27 PCR Primer AnnealingEstensione ACTG Taq e dNTPS A AC ACC ACCG ACCGT ACCGTA Eliminazione dei ddNTPs non incorporati Preparazione gel di acrilammide Elettroforesi Analisi dei dati Denaturazione

28 SANGER IN AUTOMATICO Elettroforesi su gel di poliacrilammide mediante sequenziatore

29 Un laser eccita le molecole durante la loro migrazione SANGER IN AUTOMATICO Ogni fluorocromo emette ad una determinata lunghezza donda Ognuno dei quattro ddNTPs è coniugato ad un fluorocromo di colore diverso: C, T, A, G Il colore della banda che passa è registrato: i dati vengono inviati ad un computer che ne permette lanalisi

30 SANGER IN AUTOMATICO

31 ANALISI DEI DATI ATGGCTGAAAATGCACCTG wild-type ATGGCTGAAAATGCTTCTG paziente *

32 Wild-type Paziente R218C (652C T) ANALISI DEI DATI

33 G>A: G1961E C>A: C1177X Wild-type Paziente Wild-type Paziente

34 Interpretazione e nomenclatura delle mutazioni

35

36 ESEMPIO: nomenclatura per mutazione di splicing ivs24+1G>T

37 ESEMPIO: nomenclatura per mutazione missense c. 2456G>A (p.Arg869His)

38 ESEMPIO: nomenclatura per mutazione frameshift insC1065


Scaricare ppt "MODULO GENETICA METODI PER LA RICERCA DI MUTAZIONI NEL DNA Lezione III."

Presentazioni simili


Annunci Google