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FASE SPERIMENTALE 1 OBIETTIVO : LA COMPETENZA Rendere le cellule di Escherichia coli competenti, cioè in grado di far entrare geni estranei attraverso.

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Presentazione sul tema: "FASE SPERIMENTALE 1 OBIETTIVO : LA COMPETENZA Rendere le cellule di Escherichia coli competenti, cioè in grado di far entrare geni estranei attraverso."— Transcript della presentazione:

1 FASE SPERIMENTALE 1 OBIETTIVO : LA COMPETENZA Rendere le cellule di Escherichia coli competenti, cioè in grado di far entrare geni estranei attraverso DNA plasmidico Classe 5^ BIO2 Primo Levi

2 Una cellula è chiamata competente se è in grado di assumere del DNA esogenota e integrarlo nel suo genoma. COMPETENZA NATURALE La competenza è determinata geneticamente: -proteina legante DNA -proteina di competenza -proteina RecA COMPETENZA ARTIFICIALE I batteri non hanno i geni per la competenza e questa viene indotta in laboratorio con tecniche specifiche.

3 LA COMPETENZA In laboratorio Raffreddare le cellule dellinoculo standardizzato per 10 minuti in ghiaccio tritato Trasferire 2 ml in provetta e centrifugare a rpm per 2 min Scartare il surnatante e risospendere in CaCl 2 e MgCl 2 freddo Centrifugare a rpm per 2 minuti a 4° C Risospendere in CaCl 2 freddo Mantenere in ghiaccio Si vuole aumentare la permeabilità della membrana cellulare

4 Inoculo standardizzato Concentrazione nota Confronto allo spettrofotometro: Standard Turbidimetrico Inoculo Mc Farland max 10 8 cell/ml

5 Inoculo standardizzato Come si ottiene Inoculare una colonia singola in 20mL di LB broth incubare in agitazione o/n a 37°C Trasferire unaliquota della brodocoltura o/n in LB broth sterile in beuta, effettuando una diluizione 1:100 (es. 250 mL di inoculo in 25 mL di brodo fresco) e controllare lassorbanza a λ=595nm. Il valore non dovrebbe essere superiore a 0.05 O.D. Far crescere in agitazione a 37°C da 3 a 4 ore circa. Controllare lassorbanza a λ=595nm, avendo presente che le cellule vanno raccolte quando la brodocoltura ha raggiunto unassorbanza a λ=595nm, pari a 0.4 O.D., che corrisponde a circa 10 8 cell/ml. Se lassorbanza va bene raffreddare le cellule, incubandole per 10 min in ghiaccio tritato.

6 Il protagonista: Escherichia coli È un Enterobattere coliforme: Enterico" perché è un componente della flora intestinale; Coliforme perché vive nel colon. E di forma bastoncellare e aerobio facoltativo; Gram negativo in base alla composizione della parete cellulare; E oggetto di molti studi e per questo si è a conoscenza dellintera mappatura genomica (4500 geni)

7 Ed ora… Passiamo il testimone


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