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Tecnica di analisi e/o separazione di sostanze in miscela, basata sulla differente distribuzione delle specie da separare tra una fase mobile, (un liquido,

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1 Tecnica di analisi e/o separazione di sostanze in miscela, basata sulla differente distribuzione delle specie da separare tra una fase mobile, (un liquido, un gas o un fluido supercritico), e una fase stazionaria immiscibile, eventualmente opportunamente supportata. CROMATOGRAFIA FASE MOBILE FASE FISSA CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC) liquido solido in una colonna strato sottile GAS CROMATOGRAFIA (GC) gas solido o liquido in una colonna CROMATOGRAFIA SUPERCRITICA (SFC) fluido supercritico solido o liquido in una colonna In base al tipo di fase mobile e di ripartizione si distinguono vari tipi di cromatografia

2 In base al principio chimico o chimico-fisico che determina linterazione tra il soluto o lanalita e la fase stazionaria invece si hanno: CROMATOGRAFIA FASE FISSASEPARAZIONE CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO solido adsorbente avviene in base alla diversa tendenza dei soluti ad adsorbirsi sulla superficie attiva delladsorbente in funzione della polarità della fase mobile CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE solido o liquido immiscibile con la fase mobile, supportato su un inerte avviene in base alla diversa solubilità del solito nelle due fasi CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO resina a scambio ionico avviene in base alle interazioni di tipo elettrostatico che hanno luogo tra soluto e fase stazionaria in funzione della forza ionica o del pH delleluente acquoso CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE setacci molecolari avviene in base alle dimensioni del soluto e alla sua tendenza ad essere trattenuto allinterno delle particelle

3 In base alla modalità di supporto della fase stazionaria infine si ha: CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA SU COLONNA la fase stazionaria è posta in una colonna CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE riempimento totale dello spazio interno rivestimento delle pareti interne la fase stazionaria è posta come strato sottile di materiale adsorbente su un supporto di vetro, alluminio o plastica

4 diversa affinità dei composti da analizzare per la fase fissa e per la fase mobile CROMATOGRAFIA La fase mobile viene fatta fluire a contatto con la fase stazionaria Si stabilisce una competizione tra la fase fissa e quella mobile per la ritenzione di ciascun analita La migrazione degli analiti lungo la fase fissa avviene con velocità diverse gli analiti si separano

5 POTERE DI TRASCINAMENTO DELLA FASE MOBILE TEMPERATURA GAS CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA LIQUIDA COMPOSIZIONE CHIMICA DENSITA CROMATOGRAFIA CON FLUIDI SUPERCRITICI In tutti i processi cromatografici la separazione dei componenti di una miscela si ottimizza variando degli opportuni parametri che permettono di spostare gli equilibri tra soluto, fase mobile e fase stazionaria, ovvero che influenzano le affinità relative dei soluti per le due fasi.

6 FASI DEL PROCESSO CROMATOGRAFICO Caricamento del campione allinizio della fase stazionaria Eluizione della miscela con la fase mobile Rivelazione dei composti separati dipende da Distribuzione del composto tra le due fasi coefficiente di ripartizione costante di distribuzione K natura del soluto natura della fase mobile natura della fase stazionaria K = concentrazione del soluto nella fase stazionaria concentrazione del soluto nella fase mobile

7 K = concentrazione del soluto nella fase stazionaria concentrazione del soluto nella fase mobile coefficiente di ripartizione costante di distribuzione per ciascun componente della miscela soluto tempo di permanenza nel sistema tMtM tRtR Intensità Tempo A B t M tempo morto: tempo impiegato dalleluente per percorrere la fase stazionaria t R tempo di ritenzione assoluto: tempo impiegato dalla sostanza per percorrere la fase stazionaria t R tempo di ritenzione corretto: t R = t R - t M t R dipende da K

8 tempo di ritenzione RELATIVO rapporto tra i tempi assoluti del soluto e di una sostanza di riferimento INDIPENDENTE DALLE CONDIZIONI SPERIMENTALI RISOLUZIONE = indicazione quantitativa della capacità di separazione di un sistema cromatografico differenza tra i tempi di ritenzione tra due specie (somma delle larghezze dei picchi a metà altezza) : 2 R = [t RB - t RA ] (Wh B - Wh A )/2 = 2. [t RB - t RA ] (Wh B - Wh A )

9 R dipende da affinità di un composto per la fase stazionaria (velocità di migrazione) selettività: separazione di due sostanze in funzione del rispettivo fattore di capacità capactà di un sistema di minimizzare il BROADENING delle bande cromatografiche fattore di capacità k = (t R - t M )/t M fattore di separazione = k B /k A efficienza N = 16 (t R / Wb) 2 n = 5.54 (t R / Wh) non dipende dalle condizioni analitiche, meglio di t R k ritenzione numero dei piatti teorici

10 PIATTO TEORICO spazio della colonna nel quale si attua lequilibrio di ripartizione del soluto tra fase fissa e fase mobile nel piatto teorico il soluto è presente nella fase fissa e nella fase mobile alla concentrazione di equilibrio CIOE + PIATTI TEORICI+ EQUILIBRI + SEPARAZIONE + EFFICIENZA HETP = L/N - HETP + PIATTI TEORICI dipende da diametro delle particelle velocità di flusso natura del supporto

11 Un modello più realistico per descrivere i processi di equilibrio durante una separazione cromatografica si basa sul TEMPO necessario per lo stabilirsi dellequilibrio di ripartizione del soluto tra le due fasi. Diventa quindi importante la VELOCITA di eluizione. VELOCITA troppo bassa aumenta il BROADENING tempo di contatto troppo breve perché si instauri un equilibrio efficace troppo alta VELOCITA LINEARE OTTIMALEMASSIMA EFFICIENZA

12 HETP = A + B/u + Cu A diffusione microvorticosa B diffusione molecolare longitudinale C resistenza al trasferimento di massa u velocità lineare media del fluido di trasporto Equazione di Van Deemter trasferimento di massa diffusione a vortice diffusione longitudinale HETP u cm/s EQUAZIONE DI VAN DEEMTER

13 Diffusione vorticosa (A) Diffusione longitudinale (B): Trasferimento di massa (C): A, B, C influiscono suquindi su AMPIEZZA DELLA BANDA HETP allinterno della fase fissa sono possibili vari cammini per le molecole e non tutti hanno la stessa lunghezza. Ciò che parte assieme arriva in tempi diversi la concentrazione dellanalita è maggiore al centro della banda rispetto alla periferia, quindi il soluto tende a migrare. Tempi di contatto brevi (= velocità alta minore broadening). tempi di contatto brevi scarso equilibrio tra soluto e fase stazionaria maggiore broadening

14 Dimensione delle particelle -colonne più lunghe -impaccamento meno uniforme -contropressione più bassa -colonne più corte -impaccamento più efficiente (meno cunicoli) -contropressione più alta

15 RISOLUZIONE da R = 2. [t RB - t RA ] (Wh B - Wh A ) R =N/4. [( -1)/ ]. [k/(1+k)] t R tempi di ritenzione Wh larghezza a metà altezza N n.ro dei piatti teorici fattore di selettività k fattore di ritenzione aumentare il numero dei piatti teorici allungare la colonna ridurre lHETP diminuendo la dimensione delle particelle PER MASSIMIZZARE R modificare k variando T (GC) variando la composizione della fase mobile (LC) modificare variando la composizione della fase mobile variando la composizione della fase stazionaria usando accorgimenti (complessanti, basi,…) variando T


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