Il cancro è una malattia genetica Deriva da alterazioni della sequenza del DNA Mutazioni somatiche Mutazioni che non vengono trasmesse alla generazione successiva e che non possono essere perciò ereditate Tali mutazioni vengono trasmesse alle cellule figlie dopo la divisione cellulare

Il cancro è una patologia monoclonale Tutte le cellule neoplastiche di un individuo originano da una singola cellula progenitrice La cellula clonale tumorale esposta ad un agente mutageno subisce un danno irreversibile al DNA Lo sviluppo del tumore è un processo che avviene in diverse fasi

COME SI SVILUPPA IL CANCRO Lo sviluppo dei tumori nell’uomo è il risultato di una complessa interazione tra: Fattori genetici Fattori ambientali Sono necessarie diverse mutazioni in geni diversi per la trasformazione neoplastica della cellula

Vie cellulari alterate dal cancro Tre sono i processi importanti che regolano il numero globale delle cellule di un individuo: La divisione cellulare La morte cellulare Il differenziamento

Tre tipi di geni Esistono tre tipi principali di geni mutati che contribuiscono allo sviluppo di un tumore Oncogeni Geni oncosoppressori Geni coinvolti nel riparo del DNA

Oncogeni Oncogeni: geni che controllano positivamente la proliferazione cellulare Scoperti nei virus trasformanti ad RNA Il nome deriva dal virus in cui sono stati identificati: e.g. ras da Rous Sarcoma Virus Controparti cellulari normali: proto-oncogeni che stimolano crescita e divisioni cellulari Proto-oncogeni Oncogeni

Mutazione per acquisizione di funzione

Ruolo degli oncogeni Ruolo normale: stimolazione crescita e proliferazione cellulare Mutazione > Aumento della funzione > trasformazione, invasività

Funzioni dei protoncogeni: stimolazione della crescita Fattori di crescita secreti Recettori di superficie cellulare Fattori intracellulari di trasduzione del segnale Proteine nucleari che legano il DNA

Mutazioni Mutazioni puntiformi Traslocazioni cromosomiche

Mutazione puntiforme Oncogene ras (carcinoma della vescica) sul cromosoma 12 Mutazione puntiforme: Gly12Val Blocco della conversione di ras dalla forma attiva, legata al GTP, alla forma inattiva, legata al GDP, che deregola la crescita cellulare

Ras signaling pathway

Traslocazione cromosomica: CML t(9;22)(q34;q11)

t(9;22)(q34;q11) 9q34: abl (abelson virus) proto-oncogene 22q11: bcr (breakage cluster region) Fusione bcr-abl sul cromosoma 22 (cromosoma Philadelphia)

Oncogeni Mutazioni negli oncogeni sono di solito acquisite Mutazioni dominanti: una sola copia genica mutata è sufficiente a produrre il cancro per acquisizione di funzione - “gain of function”

Tumor-suppressor genes Oncosoppressori Controllo negativo della proliferazione cellulare Prevenzione di crescita cellulare abnorme Normalmente inibiscono la crescita e la divisione cellulare PRb (proteina del retinoblastoma): protoncogene presente su 13q14

Ereditarietà degli oncosoppressori La maggior parte dei tumori ereditari sono dovuti all’ereditarietà di un gene oncosoppressore mutato (first hit) Ma è necessario un secondo colpo (second hit) per lo sviluppo del tumore, pertanto il gene agisce in modo recessivo a livello cellulare L’ereditarietà degli oncogeni è di tipo dominante in quanto basta che sia mutata una copia del gene affinchè compaia il tumore, Nel caso degli oncosoppressori è necessario che entrambe le copie siano mutate.

Geni coinvolti nel DNA repair Riparano i danni al DNA sono considerati un sottogruppo di Geni Oncosoppressori La perdita della loro funzione determina l’accumulo di mutazioni in altri geni cruciali

Il gene p53 La più comune modificazione genetica associata a cancro oncosoppressore, “guardiano del genoma” Espresso in grande quantità in cellule con danni al DNA Coinvolto nella fase G1/S del ciclo cellulare (blocca la replicazione di cellule danneggiate) Coinvolto nell’apoptosi

BRCA1 e BRCA2 Proteine la cui espressione si modifica in caso di “risposta al danno del DNA” hanno attività di oncosoppressori Responsabili dell’insorgenza del cancro della mammella

PROTEINA APC E’ un tumor suppressor gene che controlla l'espressione di geni fondamentali nel processo di divisione cellulare Mutazioni della proteina APC determinano aumento della divisione cellulare Tumor suppressor gene nel cancro del colon retto

LEUCEMIE La leucemia è una malattia che deriva dalla proliferazione neoplastica di cellule emopoietiche Le leucemie sono suddivise in due classi principali in base alla morfologia della linea cellulare da cui originano: Leucemia mieloide Leucemia linfoide Inoltre la leucemia mieloide e linfoide vengono distinte in: croniche caratterizzate da cellule neoplastiche relativamente mature e più simili alle corrispondenti cellule normali. acute caratterizzate da cellule neoplastiche più immature

Cellule Rosse del sangue Emopoiesi Cellula Staminale Proeritroblasto Mieloblasto Linfoblasto Monoblasto Megacarioblasto Eritroblasto basofilo Promielocita Mielocita Eritroblasto policromatofilo Megacariocita Rottura Piastrine Basofilo Eosinofilo Neutrofilo Espulsione del nucleo Eritroblasto ortocromatico Reticolocita Meta-mielocita Monocita Eritrocita Cellule Rosse del sangue Basofilo Eosinofilo Neutrofilo Linfocita Granulociti Agranulociti Cellule Bianche del sangue

EMOPOIESI LEUCEMIE MIELOIDI LEUCEMIE LINFOIDI Apoptosis Proliferation CFU-G Myelocyte Granulocyte Multipotent Stem cells BFU-E Erythroblast LTC-IC Erythrocyte CFU-M Monoblast Monocyte CFU-MK Megakaryocyte Platelets LEUCEMIE MIELOIDI CFU-L Lymphocyte LEUCEMIE LINFOIDI Apoptosis Proliferation Differentiation

X MECCANISMI DI LESIONE GENICA NEI TUMORI EMOPOIETICI Traslocazioni X t(9;22) in LMC t(15;17) in LMA t(9;22) in LLA t(4;11) in LLA 11q23 in LLA LMA Inv(16) in LMA Delezioni cromosomiali parziali 5q- in LMA 6, 13, 11q- in LLC Duplicazioni cromosomiali Trisomia 12 in LLC Mutazioni puntiformi ..AGCTCGG.. ...AGTTCGG.. Attivazione RAS in LMA, LLA Internal tandem duplication Duplicazioni in tandem nel gene FLT3

MECCANISMI MOLECOLARI DI TRASFORMAZIONE NEOPLASTICA 1 Alterazione di geni che codificano: 1: fattori di crescita 2: recettori dei fattori di crescita 3: trasduttori del segnale 4: fattori di trascrizione 5: proteine regolatorie del ciclo cellulare 2 3 4 5 Apoptosi Differenziamento Proliferazione

Leucemia Mieloide Cronica (LMC) Incidenza : 1–2 per 100.000 Mediana dell’età di insorgenza: 53 anni Aumento di incidenza con l’età (30% dei pazienti ha più di 60 anni) Unica lesione genetica: Cromosoma philadelphia Alla presentazione 50% diagnosticati attraverso analisi di laboratorio

Decorso Clinico: le fasi della LMC Sopravvivenza mediana 3–6 mesi Fase Avanzata Fase Cronica Durata Mediana 5 - 6 anni Fase Accelerata Durata mediana 6–9 mesi Crisi blastica Sopravvivenza mediana 3–6 mesi

Cromosoma Philadelphia:Traslocazione t(9;22)

BCR Breakpoint cluster region gene Locus at 22q11 Codifica per la proteina bcr, di 160-kDa proteina attivatore di GTPase (GAP)

ABL Abelson’s murine leukemia viral oncogene homolog Locus at 9q34 è una proteina con attività chinasica strettamente regolata dall’interazione sterica tra domini di SH1 con SH2 e SH3 e l’ATP

BCR-ABL M-bcr 2. m-bcr 3. μ –bcr In BCR sono state identificate 3 differenti breakpoint cluster regions M-bcr 2. m-bcr 3. μ –bcr M-bcr m-bcr μ-bcr

BCR-ABL Punti di rottura In ABL, i breakpoints di solito cadono in un’ampia regione che parte a monte dell’esone 1b e finisce a valle dell’esone 1a. a2

BCR-ABL Tre diversi trascritti di fusione e1a2 b2a2 b3a2 e19a2 BCR ABL p190 kD p210 kD p230 kD Contributo costante di ABL → Potere trasformante Contributo variabile di BCR → Fenotipo della patologia

BCR-ABL BCR incrementa l’attività chinasica di ABL Incremento della proliferazione Riduzione dell’apoptosi Riduzione della adesione delle cellule allo stroma midollare

Bcr-Abl tirosina-chinasi: la proteina ‘chimerica’ che causa la trasformazione neoplastica Substrato P P P Y ATP La proteina Bcr-Abl catalizza il trasferimento di un gruppo fosfato dall’ATP a proteine substrato che, così fosforilate, trasmettono segnali di attivazione cellulare con conseguenti effetti leucemogenici. Substrato fosforilato P Y Y = Tirosina P = Fosfato Effettore

ATTIVAZIONE COSTITUTIVA DELLE VIE DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE Incremento della migrazione dal midollo osseo Inibizione morte cellulare Proliferazione incontrollata

APPROCCIO DIAGNOSTICO ALLA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA ESEMPIO: PAZIENTE CON SOSPETTA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA INDAGINI DI I°LIVELLO

LMC in fase cronica: presentazione clinica Obiettività clinica Splenomegalia (50% dei casi) Asintomatica nel 50% dei casi Sintomatologia clinica Astenia Febbricola Perdita di peso/anoressia References Faderl S, Talpaz M, Estrov Z, et al. Chronic myelogenous leukemia: biology and therapy. Ann Intern Med. 1999;131:207-219. Goldman JM. Chronic myeloid leukemia. Curr Opin Hematol. 1997;4:277-285.

DIAGNOSI DI LMC: ESAMI DI LABORATORIO Sangue periferico:Emocromo Valori di riferimento 4.500 a 11.000 per µL. FASI CRONICA ACCELERATA BLASTICA LEUCOCITI (granulociti) 20000/µL BLASTI >10% 30% PIASTRINE O NORMALI Sangue periferico normale Sangue periferico LMC Puntato midollare

Tipizzazione genetica leucemia mieloide cronica traslocazione t(9;22) Richiesta esami Tipizzazione genetica leucemia mieloide cronica traslocazione t(9;22)

INDAGINI DI II LIVELLO Citogenetica Convenzionale Citogenetica Molecolare (FISH Fluorescence in-situ hybridization) se la citogenetica convenzionale non è indicativa Genetica Molecolare Diagnostica basata su PCR Qualitativa Monitoraggio basato su PCR Quantitativa

CITOGENETICA CONVENZIONALE La citogenetica convenzionale è una tecnica che permette lo studio del numero e della struttura dei cromosomi (studio del cariotipo) I cromosomi vengono esaminati “bloccati” in metafase.

CITOGENETICA

Citogenetica convenzionale Limiti Riarrangiamenti cromosomici complessi Cattiva morfologia cromosomica Basso indice mitotico delle cellule neoplastiche Bassa crescita o fallimento della coltura

INDAGINI DI II LIVELLO Citogenetica Convenzionale Genetica Molecolare Citogenetica Molecolare (FISH Fluorescence in situ hybridization) Genetica Molecolare Diagnostica basata su PCR Qualitativa Monitoraggio basato su PCR Quantitativa

CITOGENETICA MOLECOLARE (FISH) La Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) è una tecnologia che utilizza sonde nucleotidiche marcate (DNA probes) per identificare specifiche regioni di un cromosoma ovvero determinate sequenze del DNA.

FISH (fluorescence in situ hybridization) Wang YL, Bagg A, Pear W, Nowell PC, Hess JL. Chronic myelogenous leukemia: laboratory diagnosis and monitoring. Genes Chromosomes Cancer. 2001;32:97-111.

INDAGINI DI II LIVELLO Citogenetica Convenzionale Citogenetica Molecolare Fluorescence in-situ hybridization (FISH) Genetica Molecolare Diagnostica basata su PCR Qualitativa Monitoraggio basato su PCR Quantitativa

BCR-ABL Tre diversi trascritti di fusione e1a2 b2a2 b3a2 e19a2 BCR ABL p190 kD p210 kD p230 kD Contributo costante di ABL → Potere trasformante Contributo variabile di BCR → Fenotipo della patologia

METODOLOGIE D’INDAGINE: LA PCR BCR ABL

PCR qualitativa (t 9;22)

PCR qualitativa (t 9;22) proteina p210 CN 2 5 6 8 3 1 4 7 9 CP b2a2

VARIABILI PRE-ANALITICHE VOLUME SANGUE: DX: 10 ML in EDTA SANGUE PERIFERICO F.UP: 20 mL in EDTA SANGUE PERIFERICO TEMPI DI CONSEGNA: in giornata/max entro le 24 ore

TERAPIA LMC è una malattia devastante con un prognosi terribile per molti pazienti Fino a pochi anni fa le opzioni terapeutiche erano poche e il goal terapeutico rimaneva solo il ritardo della progressione di malattia Anni 20 Anni 50 Anni 70 Anni 80 Anni 90 1920 viene introdotto il primo trattamento per la LMC con scarsi risultati: Radiation 1970:approccio al trapianto: cure in termini di remissione a lungo termine delle cellule cancerose È mirato e blocca la principale causa della leucemia 1950 e 1960 è il periodo degli agenti chemioterapici: aumento survival rate fino a 5 anni Interferone

Monitoraggio della risposta Risposta ematologica Risposta citogenetica molecolare Conta completa delle cellule ematiche Cariotipo (RT-PCR) qualitativa Ibridizzazione in-situ fluorescente (FISH) Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RQ-PCR)

Terapia Convenzionale: Interferone Trapianto allogenico di midollo Trapianto autologo di midollo Terapia molecolare STI-571 (Gleevec)

Interferone Citochina con effetto antiproliferativo Remissione ematologica in 70-80% Risposta citogenetica in 40-60% : Effetti collaterali

Terapia Convenzionale: Interferone Trapianto allogenico di midollo Terapia molecolare STI-571 (Gleevec)

Trapianto di midollo osseo Unica terapia curativa Per pazienti in fase cronica Guarigione totale in > 60% entro 1-2 anni dalla diagnosi per i migliori risultati Compatibilità sistema HLA

SISTEMA MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITÀ

Terapia Convenzionale: Interferone Trapianto allogenico di midollo Idrossiurea Interferone Trapianto allogenico di midollo Terapia molecolare STI-571 (Gleevec)

STI-571 Signal Transduction Inhibitor STI-571 blocca il legame dell’ATP a BCR-ABL inibendone l’attività kinasica

TERAPIA DELLA LMC GLIVEC: inibitore selettivo della tirosin chinasi BCR/ABL

Glivec (imatinib mesilato) Meccanismo d’azione Traslocazione 9;22 Proteina di fusione Bcr-Abl Proteina di fusione Bcr-Abl LMC Ematopoiesi normale

Efficacia del trattamento Ph+ 1 2 3 4 5 N = cellule normali Riduzione della massa leucemica

Monitoraggio della risposta: 3-6-9-12 MESI WBC < 10 x 109/L Platelets <450 x 109/L Midollo Emocromo Completa 100% cell. Ph- Parziale 60%–90% cell. Ph- Minore 30%–60% cell. Ph- Citogenetica PCR QPCR

Monitoraggio: necessità di quantificare la quantificazione dei livelli di un determinato mRNA Efficacia della terapia farmacologica Valutazione della malattia minima residua Real Time PCR: applicazioni

MRD (Minimal Residual Disease): Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia farmacologica ad esempio delle leucemie Tali cellule neoplastiche, presenti ad un livello inferiore alla capacità di rilevazione delle metodiche convenzionali, sono in grado di espandersi e dare origine alla recidiva

TECNOLOGIA TAQMAN Sonda oligonucleotidica complementare alla sequenza target, interna ai primers di PCR La sonda è marcata con un fluoroforo ad una estremità ed un quencher all’altra La distanza tra fluoroforo e quencher è tale da bloccare l’emissione di fluorescenza.

Q R TECNOLOGIA TAQMAN R = Reporter Q = Quencher Q Forward primer 5’ 3’ BCR/ABL 5’ 3’ Reverse primer

Q R TECNOLOGIA TAQMAN R = Reporter Q = Quencher Q Forward primer BCR/ABLL Forward primer BCR/ABLL BCR/ABLL 5’ 3’ 5’ 3’ Reverse primer

R TECNOLOGIA TAQMAN R = Reporter Q = Quencher Forward primer Reverse BCR/ABLL BCR/ABLL BCR/ABLL BCR/ABLL BCR/ABLL Forward primer BCR/ABLL BCR/ABLL BCR/ABLL 5’ 3’ 5’ 3’ Reverse primer

Espressione dei dati in PCR Quantitativa Lo strumento è in grado di calcolare in maniera precisa il numero di copie di gene bcr-abl rispetto al numero di copie di un gene normale sempre Copie BCR-ABL quantizzazione relativa Copie ABL 100

CML:MALATTIA MINIMA RESIDUA Non-clonal cell Ph+ cell Hybrid BCR/ABL mRNA Housekeeping Treatment Quantitative PCR Ratio = ­ BCR/ABL/ ABL 100% Quantitative PCR Ratio = ¯ BCR/ABL/ ABL 0,01%

L’informazione Il referto Cosa trasmettere al clinico Alla diagnosi Nel follow up

REFERTO alla diagnosi Dati anamnestici del paziente Data prelievo- Data di accettazione Tipo di campione Struttura di provenienza Ipotesi diagnostica: Sospetta Leucemia Mieloide Cronica INDAGINI RICHIESTE: Ricerca Riarrangiamento Genico BCR/ABL (giunzione b2a2 o b3a2 - p210) Tecnica utilizzata: RT-PCR Risultati …..L'analisi RT-PCR permette di evidenziare, nel campione di sangue periferico esaminato,la presenza di una popolazione clonale con un gene ibrido bcr/abl con giunzione di tipo b2/a2 che codifica per una proteina di tipo P-210 dovuta a traslocazione t(9;22). Il quadro è compatibile con la diagnosi di leucemia mieloide cronica.

L’informazione Il referto Cosa trasmettere al clinico Alla diagnosi Nel follow up

REFERTO al follow up (3-6-9-12 mesi) Dati anamnestici del paziente Data prelievo- Data di accettazione Tipo di campione Struttura di provenienza INDAGINI RICHIESTE: Ricerca Riarrangiamento Genico BCR/ABL Tecnica utilizzata: "Real Time” RT-PCR (RQ-PCR) Risultati I risultati dimostrano che la massa leucemica residua nel campione di sangue periferico, misurata come livello di mRNA di fusione BCR/ABL (in rapporto percentuale al livello di mRNA del gene ABL) è di 0,1 % (valore all’esordio della malattia =100%). Il paziente in risposta molecolare maggiore mostra una diminuzione di circa tre logaritmi della massa leucemica residua rispetto al valore presentato all’esordio della malattia .

Leucemia Mieloide Cronica (LMC) 09/04/2014 Leucemia Mieloide Cronica (LMC) CLASSI DI RISPOSTA Time points di una risposta Ottimale alle terapie con TKI Risposta molecolare MR5 BCR-ABL% I.S. 100% 10% 1% 0,1% 0,01% 0,0032% 0,001% Log reduction 1 2 3 4 4,5 5 diagnosi Risposta ematologica completa (CHR) Risposta citogenetica completa (CCgR) Risposta molecolare MR3 (MMR) Risposta molecolare MR4 Risposta molecolare MR4,5 3 mesi 6 mesi 12 mesi se entro i 18 mesi non c’è una diminuzione di tre log oppure si ha una diminuzione e successivo aumento della malattia Filomena Daraio

RESISTENZA AL TRATTAMENTO CML clone Treatment with Imatinib Primary Resistance Cytogenetic response Reemergence of Ph chromosome Acquired (Secundary) Resistance

Meccanismi di resistenza a imatinib Numerosi sono i meccanismi di resistenza alla terapia con Imatinib mutazioni del dominio tirosin- chinasico di ABL (80%)

Effetto della mutazione T315I sul legame imatinib-BCR-ABL Wild-type T315I Mutant

SCHEMA DELLE MUTAZIONI PUNTIFORMI a.a. coinvolti nel legame con imatinib

D-HPLC = Denaturing-High Performance Liquid Chromatography Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) specificamente adattato alla rilevazione di variazioni nella sequenza nucleotidica del DNA Transgenomic Wave 3500HT

Sequenziamento automatico (metodo di Sanger)(I)

Riassumendo Imatinib è stata la prima Target Therapy Mutazioni puntiformi nel dominio chinasico di Bcr-Abl comportano un’alterazione conformazionale che riduce l’affinità di legame con Imatinib e dunque la sensibilità al farmaco Una nuova strategia terapeutica dopo Imatinib

Profilo di tollerabilità simile ad imatinib DASATINIB (Bristol Meyers): 2006 come farmaco di II linea Inibitore di ABL Profilo di tollerabilità simile ad imatinib E’ efficace sulle mutazioni puntiformi resistenti ad Imatinib Effetti collaterali: Tossicità ematologica: neutropenia e piastrinopenia (> di nilotinib) Tossicità non ematologica:versamentpleurici/pericardici

imatinib Bcr-Abl Mut. Bcr-Abl imatinib Mut. Bcr-Abl dasatinib

NILOTINIB ( Novartis): 2008 come farmaco di II linea Profilo di tollerabilità simile ad imatinib E’ efficace sulle mutazioni puntiformi resistenti ad Imatinib Tossicità ematologica: inferiore al dasatinib Tossicità non ematologica: inferiore al dasatinib Inibitore di ABL

Nilotinib: legame preferenziale per Bcr-Abl Nilotinib è stato sviluppato per colpire in modo preferenziale la causa riconosciuta della LMC Ph+: Bcr-Abl Nilotinib: Bcr-Abl > PDGF > c-KIT Dasatinib: Src > Bcr-Abl > PDGF > c-KIT

Nilotinib: migliore affinità su Bcr-Abl Imatinib Legami idrogeno con specifici aminoacidi del sito di legame ATP binding site Sezione disegnata per un legame più efficiente con l’ATP binding site Legami idrogeno sostituiti da interazioni lipofiliche ® minore suscettibilità alle mutazioni puntiformi Nilotinib Nilotinib richiede un adattamento strutturale meno restrittivo all’interno della tasca di legame (è cioè una molecola più “flessibile”). Ciò permette a Nilotinib di legarsi più saldamente alla tasca di legame per l’ATP anche in presenza delle mutazioni puntiformi che determinano la resistenza a Imatinib. Grazie alla maggiore affinità sul target, Nilotinib è efficace sulle mutazioni di Bcr-Abl resistenti a Imatinib