L'ozono (O3) è un gas dall’odore caratteristico, le cui molecole sono formate da tre atomi di ossigeno La sua struttura chimica è un ibrido di risonanza tra tre formule limite: Lo scopritore di questa sostanza, Friedrich Schonbein, riconobbe l’odore dell’ozono (dal greco ozein, che significa “puzzare”) durante la scarica di alcuni fulmini, così come aveva notato lo stesso odore sgradevole durante gli esperimenti di elettrolisi che stava conducendo nel suo laboratorio.

Nitrato di perossiacetile Ciclo “VIRTUOSO” Ciclo “MALATO”

Perché il fenomeno si manifesti, ci devono essere delle precise condizioni ambientali. Se queste persistono, allora si realizzano le numerose reazioni chimiche che portano alla formazione dello smog fotochimico. Le condizioni ambientali richieste non sono per nulla eccezionali: radiazione solare intensa elevata temperatura dell’aria

Elevato potenziale redox (+ 2,07 V) Dimensioni molecolari simili alla CO2: incontra la stessa resistenza nella penetrazione stomatica Elevata solubilità in acqua (10 volte maggiore dell’O2): dall'apoplasto raggiunge facilmente la membrana Cellule morte Elevato potenziale redox (+ 2,07 V) Stoma CO2 F: 2.87 V; OH: 2.86 V; O: 2.42 V; O3: 2.07 V; H2O2: 1,78 V; Cl: 1.36 V; ClO2: 1.27 V; 02: 1,23 V)

EMISSIONE DI IDROCARBURI SINTOMI VISIBILI EFFETTI SUBLIMINALI comportamento stomatico fotosintesi metabolismo carboidrati produzione biomassa rapporto shoot /root cere epicuticolari metabolismo secondario qualità dei prodotti EFFETTI SECONDARI risposta a stress idrico risposta a stress termico risposta a organismi nocivi ASSORBIMENTO DI OZONO EMISSIONE DI IDROCARBURI

“Sindrome da stress da ozono” I danni da ozono Variazioni anatomiche, biochimiche e fisiologiche, caratteristiche dei naturali processi di invecchiamento della pianta Clorosi, necrosi ed abcissione fogliare Sintomi: Diminuzione dell'attività fotosintetica, riduzione della produttività e dello sviluppo, senescenza precoce Effetti subliminali: “Sindrome da stress da ozono” Quadro sintomatico tipico dei naturali processi di senescenza delle piante Ozono accelera la senescenza

1952

L’esempio che meglio sintetizza le possibilità anche operative delle metodiche di biomonitoraggio è rappresentato dalla cv. Bel-W3 di tabacco, usata sin dal 1962 per il rilevamento degli effetti dell’O3. Essa presenta interessanti aspetti, a cominciare dalla elevata sensibilità all'inquinante, essendo sufficienti esposizioni di poche ore a concentrazioni dell’ordine di 40 ppb per provocare la comparsa di lesioni tipiche; è da segnalare che proprio 40 ppb è considerata la soglia discriminante tra i livelli di O3 naturali e quelli derivanti da attività fotochimica.

1962 Il tabacco cv. Bel-W3, supersensibile all’ozono troposferico, è stato utilizzato in campagne di monitoraggio integrate su base biologica e chimico-fisica ASSENZA di criteri di standardizzazione (es. banche del germoplasma, condizioni di allevamento, criteri di valutazione ) e riconoscimenti normativi

Bel-W3, supersensibile Bel-B, resistente

La pianta di tabacco è a ciclo annuale La pianta di tabacco è a ciclo annuale. Produce in continuazione nuove foglie durante la stagione vegetativa, e quelle a diverso stadio di maturità variano nella sensibilità, così che gli effetti macroscopici sono assolutamente inequivocabili. Le lesioni provocate dall'O3 sono facilmente identificabili e quantificabili, in quanto sono costituite da necrosi bifacciali puntiformi, del diametro di alcuni millimetri, a contorno netto. E’ possibile individuare se siano di vecchia o nuova formazione (il loro colore schiarisce da nerastro a bianco-sporco in pochi giorni. Le foglie giovani (sino ad una lunghezza di 6-7 cm) sono esenti dal danno; in quelle in via di maturazione sono solo le regioni distali a presentare sintomi, mentre nelle vecchie sono le aree prossimali.

30 µm a e d c b Biomonitoraggio dell’ozono troposferico con piante supersensibili di tabacco (Nicotiana tabacum cv. Bel-W3. (a): pianta adulta esposta per una settimana all’aria ambiente (a sinistra), in confronto ad una mantenuta in aria filtrata; (b): vista dall’alto: si noti la peculiare distribuzione dei sintomi nelle foglie di diversa età; (c): confronto tra lesioni fresche (di colore più scuro) e mature; (d): dettaglio di una foglia; (e): particolare al microscopio elettronico a scansione di una delle lesioni

La risposta è di tipo quantitativo, essendo possibile una correlazione (non sempre lineare) tra la superficie necrotizzata e la dose a cui le piante sono esposte. Le foglie disseccate rimangono attaccate allo stelo, così come si verifica per i processi di senescenza fisiologica.

Di norma, si affiancano alle piante della cv Di norma, si affiancano alle piante della cv. Bel-W3 (sensibile), alcuni individui della cv. Bel-B (resistenti) e della cv. Bel-C (a risposta intermedia), allo scopo di avere la certezza che le lesioni che compaiono eventualmente sulle indicatrici siano effettivamente attribuibili all'O3. Analogo risultato si può ottenere circondando una parte delle piante della cv. Bel-W3 con reti trattate con un composto anti-ozonante (es. ETILENDIUREA, EDU).

l metodo operativo più frequentemente applicato è stato messo a punto dai ricercatori dell’Imperial College di Londra, basato sulla determinazione di un Indice di Danno Fogliare (IDF; Leaf Injury Index, LII), opportunamente modificato per incrementare la qualità del dato e la correttezza del campionamento, quindi dell’informazione che si ottiene.

Il procedimento punta alla ricostruzione dei pattern distributivi sul territorio delle concentrazioni al suolo dell’ozono, e sue variazioni temporali su scala settimanale o mensile per l’intero periodo della stagione fotochimica. Per la sua elevata standardizzazione e frequenza di applicazione, questo procedimento può essere considerato un ottimo esempio - benché non il solo - dell’applicazione di tecniche di biomonito- raggio per la caratterzzazione della qualità dell’aria relativamente ad un singolo inquinante.

La standardizzazione delle metodologie, anche a livello internazionale è strettamente necessaria per ottenere il riconoscimento ufficiale delle procedure di biomonitoraggio Un primo tentativo è stato condotto con successo dell'agenzia ambientale italiana (ANPA, Roma) per descrivere le procedure standard fondamentali dei bioindicatori di O3 (dalla distribuzione del seme alla crescita della pianta, all'addestramento del personale ed all'analisi dei dati) Norme VDI (Verein Deutscher Ingenieure) International Co-operative Programme on effects of air pollution and other stresses on vegetation (ICP - VEGETATION)

Piante adulte

1. metodi di coltura del materiale vegetale; 2. esposizione nelle stazioni di rilevamento; 3. rilievi; 4. elaborazione dei dati e loro rappresentazione cartografica; 5. metodi alternativi. 6. Strategie e tattiche di distribuzione e localizzazione delle stazioni di rilevamento;

1. Metodi di coltura del materiale vegetale Vengono predilette specie vegetali che presentano: 1) notevole sensibilità all’ozono, in particolare mostrano evidenti sintomatologie fogliari che in genere si manifestano quando la concentrazione dell’inquinante supera soglie di 40-50 ppb (parti per “bilione”=miliardo, parti per 10-9, in volume), per esposizioni di 4-5 ore; 2) specificità dei sintomi, che possibilmente mostrano una spiccata evoluzione temporale sia nella distribuzione spaziale sulla lamina fogliare che nel colore; 3) ottima resistenza ad altri fattori di stress.

Protocollo rigoroso di coltura:  quanti semi usare, come piantarli, come e quando trapiantare le giovani plantule;  condizioni di crescita: in cella climatica a 20-23°C, 70-80% RH, fotoperiodo luce/buio 14/10, 500-550 µmol photons m-2 s-1, buona disponibilità idrica.  ARIA FILTRATA

Semina: a) seme di Nicotiana tabacum cv. Bel-W3; b) terriccio Einheitserde Patzer ED73; c) semenzaio; d) fase di post-germinazione: cotiledoni distesi.

Sistema a reservoir idrico: a) sistema realizzato per l’esposizione dei bioindicatori; b) disegno esemplificativo del montaggio; c) schema esplicativo del funzionamento.

Coltivazione delle piante: a) Sistema di filtraggio di aria a carbone attivo; b) Box in plexiglass ad aria filtrata.

Marcatura della quarta foglia di ogni pianta: a) Schema esemplificativo tratto dalle linee guida VDI 3957/Part 6 (2003); b) Pianta indicatrice contrassegnata con filo di lana colorato.

2. Esposizione nelle stazioni di rilevamento Dopo 8 settimane dalla semina (quando le piantine hanno 4-5 foglie completamente espanse) si devono selezionare le piante per omogeneità e trasferirle nei siti di esposizione, lontano da strade, alberi ad alto fusto, muri.

Realizzazione di strutture secondo le prescrizioni e le indicazioni contenute nella norma VDI di riferimento [VDI 3957/Part 6, 2003]

In ogni sito collocare almeno 6 piante della cv In ogni sito collocare almeno 6 piante della cv. Bel-W3 e almeno 3 di Bel-B (come controllo), possibilmente all’interno di intelaiature con rete ombreggiante, all’interno di una recinzione, ad una distanza di 50 cm l’una dall’altra secondo uno schema del tipo: S S R S R S R S S

Piante indicatrici di Nicotiana tabacum esposte nel centro urbano di Civitavecchia (stazione n. 12), nel corso della campagna di biomonitoraggio attivo dell’ozono troposferico, condotto nell’area circostante la Centrale Termoelettrica Enel di Torre Valdaliga Nord di Civitavecchia (RM), nell’anno 2012; rispettivamente: a) inizio e b) fine di un ciclo espositivo.

Assegnare ad ogni pianta una sigla di riferimento, quindi procedere con la numerazione delle foglie a partire dalla prima foglia inferiore; continuare la numerazione con quelle che si formeranno con la crescita. Il set di piante viene mantenuto per 4 settimane, e quindi viene sostituito con un nuovo set di piante di 8 settimane di età, 4-5 foglie espanse proveniente da aria filtrata; eventualmente si sostituiscono in corso d’opera le piante danneggiate da atti vandalici con “gemelle” mantenute in coltura in condizioni controllate.

A cadenza settimanale, sempre lo stesso giorno, vengono valutati i sintomi. Si contano il numero di foglie presenti su ogni pianta, e si registra la percentuale di superficie necrotizzata per ciascuna foglia. La percentuale di danno viene espressa in Classe di intensità del fenomeno: 0 = nessun danno; 1= >0 ma <5%; 2 = >5 ma <10%; 3 = >10 ma <15%; 4 = >15 ma <20%; 5 = >20 ma <30%; 6 = >30 ma <40%; 7 = >40%;

Si calcola quindi l’indice di danno fogliare, sulla base delle foglie di lunghezza superiore a 6 cm, e quelle che la settimana precedente non avevano subito un danno superiore alla classe 2: IDF = nN (Dt-Dt-1)/N dove: n = numero progressivo della foglia dal basso verso l’alto; N = numero totale delle foglie valutate; Dt = danno fogliare alla fine della settimana considerata; Dt-1 = danno fogliare alla fine della settimana precedente.

Il processo di valutazione dei dati e della successiva loro validazione deve tenere conto delle caratteristiche di precisione e di accuratezza degli operatori. La precisione è definita come la dispersione dei risultati ottenuti da un metodo quando vengono analizzati diversi replicati dello stesso campione omogeneo. Essa viene distinta in ripetibilità (lo stesso operatore in breve tempo valuta più replicati, nelle stesse condizioni) e riproducibilità (risultati ottenuti da operatori diversi, nel tempo). L’accuratezza è definibile come la misura del grado di concordanza tra il valore reale di un campione e quello determinato dal metodo in oggetto.

Un fenomeno ricorrente nelle valutazioni quantitative delle risposte fogliari delle piante bioindicatrici è la sovrastima delle porzioni “minoritarie”. Infatti, in ossequio alla legge di Weber-Fechner, secondo cui la risposta di un organismo ad uno stimolo è funzione lineare del suo logaritmo, l’occhio legge in termini logaritmici, tendendo a dare:  maggiore risalto a poche lesioni necrotiche presenti su una superficie uniforme (sovrastima delle classi inferiori di danno);  a poche aree verdi residuali in una foglia severamente danneggiata (sottostima della classi superiori). Questo comporta la necessità di un idoneo addestramento degli operatori.

In alternativa, il rilevamento dei dati di campagna può essere effettuato mediante l'interpretazione di fotografie di foglie con sintomi o con tecniche più sofisticate di elaborazione dell’immagine. In ogni caso è utile avere a disposizione fotografie di riferimento per: a) confrontare i danni osservati; b) stimare correttamente l’intensità del fenomeno.

I LIMITI DELLE PIANTE ADULTE Le principali limitazioni operazionali consistono in: necessità di ampi spazi (e lungo tempo) in ambiente con aria filtrata; a causa della fragilità delle foglie, il trasporto per lunghe distanze è difficoltoso; le piante indicatrici rimangono in postazione per diverse settimane (solitamente 4).

6. Metodi alternativi “CUCCIOLI DI TABACCO” Solo alcuni anni fa, una procedura innovativa per il biomonitoraggio dell’ozono è stata sviluppata e brevettata dall’Università di Pisa. Semi di Nicotiana tabacum sono fatti germinare in un ambiente privo di ozono e quando le plantule hanno 15 gg, con la prima foglia lunga 1 cm, vengono singolarmente trapiantate in normali piastre di coltura tissutale in poliestere (13 × 9 cm) con 24 pozzetti rotondi (16 mm diametro, 20 mm di profondità), riempiti con un suolo standard. Le piastre sono opportunamente modificate per permettere il passaggio dell’acqua da un pozzetto all’altro. Dopo un ulteriore giorno in ambiente privo di ozono per la necessaria acclimatazione, le piastre sono esposte nei siti.

Il kit miniaturizzato E’ stato recentemente sviluppato un sistema basato sull’impiego di germinelli di tabacco allevati in piastre per colture di tessuti… … la sensibilità dei cotiledoni e delle prime foglie in espansione è ben correlabile a quella delle foglie mature

Un kit di plantule di tabacco Bel-W3 dopo sette giorni di esposizione all’aria inquinata da ozono.

Valutazione del sintomo

L’intensità del danno ai cotiledoni e alla prima foglia è valutata a vista e posta in relazione con la dose di ozono alla quale le plantule sono state esposte. L’area necrotica percentuale viene stimata per confronto con standard di riferimento, e quindi espressa in termini di Indice di Danno Cotiledonare (IDC) and Fogliare (IDF), espresso su una scala ordinale da 0 a 4 (0: nessuna lesione; 4: più del 50% di superficie coperta da necrosi).

Scala patometrica Classe 2: percentuale di superficie necrotizzata da 11 a 25% Classe 3: percentuale di superficie necrotizzata da 26 a 50% Classe 4: percentuale di superficie necrotizzata superiore al 50% Classe 1: percentuale di superficie necrotizzata da 1 a 10%

I vantaggi derivanti dal biomonitoraggio dell’ozono con questo kit miniaturizzato possono essere così riassunti: (i) si riduce lo spazio necessario per la crescita delle piante; (ii) si può esporre un elevato numero di individui; (iii) le piastre sono piccole e quindi sono facilmente trasportabili, per cui possono essere spedite, riportate in laboratorio facilmente per effettuare comodamente la stima del danno per opera dello stesso operatore, assicurando la standardizzazione della lettura; (iv) dopo l’esposizione si possono far permanere le giovani plantule per 1 giorno in condizioni di assenza di ozono, permettendo così il pieno sviluppo dei danni indotti dall’inquinante.

E A B C D F G IDC AOT 40

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