UTILIZZO DEI BATTERI BIOLUMINESCENTI PER IL MONITORAGGIO DELLE ACQUE MARINO-COSTIERE DELLA CAMPANIA Sardo A., Guarino G., Sorrentino T., Giovinazzi F.   ARPA CAMPANIA - Dipartimento provinciale di Napoli Fig. 1: piastre di Photobacterium. Premessa   I criteri adottati per valutare la qualità degli ambienti marini e, in particolare, delle acque costiere, hanno avuto, finora, come obiettivo prario la tutela della salute umana, minacciata da acque di balneazione inquinate o, eventualmente, dal consumo dei prodotti di pesca provenienti da queste zone. Un approccio di questo tipo, tuttavia, risulta parziale e totalmente inadeguato per la descrizione di ecosistemi marini integri e delle alterazioni che tali ecosistemi possono subire in seguito alle modifiche apportate dall’uomo all’ambiente naturale. E’ necessario, dunque, identificare degli indicatori biologici che permettano di valutare in maniera più accurata la qualità degli ambienti marino – costieri e che risultino sensibili, in particolare, ai parametri che maggiormente influenzano questi ecosistemi, come la concentrazione di sostanze organiche e quella delle sostanze tossiche. I batteri luminescenti eterotrofi sembrano possedere i requisiti richiesti, anche se la loro efficacia deve essere ancora dimostrata. I batteri luminescenti eterotrofi I batteri marini eterotrofi possono essere suddivisi in due categorie: -      planctobatteri: sono batteri che si nutrono essenzialmente della DOM (Dissolved Organic Matter) disponibile lungo la colonna d’acqua; -      epibatteri: sono batteri di dimensioni piuttosto grandi, che prediligono substrati solidi come nutrimento.  Gli epibatteri e, in particolar modo, le specie in grado di emettere luce appartenenti a questa categoria – epibatteri di Sieburth – rappresentano l’oggetto della nostra discussione. Studi biochimici hanno dimostrato che la bioluminescenza batterica è catalizzata da un enzima, la LUCIFERASI, e consiste nell’ossidazione del FMNH2 (forma ridotta del flavin mononucleotide) e di un aldeide alifatica da parte dell’ossigeno (fig.2). La bioluminescenza batterica è blu – verde e presenta un massimo della lunghezza d’onda di 490 nm. Fig. 2: Luciferasi Materiali e metodi  I campioni di acqua di mare sono stati prelevati a 5 – 10 cm dalla superficie, con contenitori in polipropilene sterili da 150 – 200 ml e mantenuti a circa 15 °C . All’arrivo in laboratorio, per ogni campione sono state filtrate sei aliquote da 1 ml – 5 ml – 50 ml in doppio, su membrane di cellulosa da 0.45 m e di 47 mm di diametro. Il filtro è stato posto su terreno di coltura Seawater Complete Agar Medium (SWC). Le piastre sono state incubare a 18 °C + 0.2 C per 48 ore. Risultati Le colonie di epibatteri totali vengono conteggiate alla luce e danno la Apparent Bacterial Concentration (ABC) espressa in UFC/ml. Le colonie luminescenti vengono determinate al buio e danno la Apparent Luminous Bacterial Concentration (ALBC) sempre in UFC/ml. Al fine di contenere l’errore sperimentale entro limiti accettabili, vengono utilizzate per il conteggio soltanto le piastre che presentano valori compresi tra 5 e 300 colonie.  Qui di seguito sono stati riportati i risultati ottenuti campionando alcuni tratti della costa campana nel Maggio 2003. CAMPIONAMENTO LUNGO UN TRATTO DI COSTA SALERNITANO Coordinate del punto campionato UFC/1mL UFC/5 mL UFC/50 ml 1 N 40° 32’ 421’’ E 14° 54’ 450’’ 2/20 1/4 1/27 4/42 36/patina 25/patina 2 N 40° 31’ 388’’ E 14° 55’ 128’’ 0/2 2/8 2/12 1/14 33/patina 43/patina 3 N 40° 30’ 561’’ E 14° 55’ 442’’ 0/1 4/13 0/9 33/245 29/242 4 N 40° 29’ 498’’ E 14° 56’ 064’’ 2/13 1/7 4/48 4/38 63/patina 46/patina 5 N 40° 27’ 899’’ E 14° 57’ 104’’ 2/5 1/3 5/15 5/19 52/348 37/260 Tab.1 ALBC/ABC nei punti campionati punto campionato del Coordinate Coliformi totali UFC/100 ml 900 500 Non rilevati 400 Tab.2 Determinazione dei coliformi totali nei punti campionati ALBC/ABC RISULTATI DEL CAMPIONAMENTO NEL GOLFO DI SALERNO Se consideriamo i risultati ottenuti filtrando 50 ml di acqua di mare (sicuramente più significativo da un punto di vista statistico) risulta evidente che il rapporto tra il numero di batteri luminescenti rispetto al numero di batteri totali è maggiore nei punti 3 e 5 georeferenziati in Tab.1, mentre negli altri punti la frazione bioluminescente non solo rappresenta solo un’esigua parte degli epibatteri, ma non può essere neanche valutata con esattezza perché le UFC presenti sulle membrane filtranti sono talmente numerose e così ravvicinate da non essere contabili. I siti in cui il rapporto ALBC/ABC risulta più elevato sono risultati anche quelli meno inquinati, meno contaminati da scarichi organici, come evidenzia l’analisi dei coliformi totali effettuata nei medesimi punti (Tab.2). CAMPIONAMENTO LUNGO UN TRATTO DEL LITORALE DOMIZIO – ZONA CASTELVOLTURNO Coordinate del punto campionato UFC/ 1 ml UFC/5 ml UFC/50 ml 1 N 40° 59’ 199’’ E 13° 57’ 277’’ 1/302 3/326 2/patina 0/patina 5/patina 2 N 40° 59’ 951’’ E 13° 56’ 538’’ 14/452 9/358 58/patina 56/patina 1/patina 3/patina 3 N 41° 00’ 792’’ E 13° 55’ 687’’ 12/207 14/242 86/patina 55/patina 44/patina 64/patina 4 N 41° 01’ 699’’ E 13° 54’ 828’’ 6/243 3/250 35/patina 26/patina  100/patina ALBC/ABC Tab.3 ALBC/ABC nei punti campionati Coliformi fecali UFC/100 ml  550 33 9 Tab.4 Determinazione dei coliformi fecali nei punti campionati RISULTATI DEL CAMPIONAMENTO A CASTELVOLTURNO La percentuale di batteri luminescenti è più elevata nei punti 3 e 4 (come si evince soprattutto dalle piastre in cui sono filtrati 50 ml di soluzione) descritti in Tab.3. Non a caso questi siti sono risultati essere anche quelli meno contaminati da inquinamento organico, come dimostrano anche le analisi dei coliformi fecali riportate in Tab.4. Il rapporto batteri luminescenti / epibatteri totali stimato dall’analisi dei campioni di acqua di mare può risultare un parametro estremamente interessante, da tener presente quando si effettua il monitoraggio di una zona costiera; il valore di questo rapporto, infatti, dipende da una serie di fattori: - Temperatura Ciò determina variazioni stagionali della densità delle popolazioni batteriche (massima nel periodo estivo – autunnale e minima in quella invernale – primaverile). Studi effettuati su un tratto di costa toscana hanno evidenziato un aumento della densità di epibatteri totali e della frazione bioluminescente nei mesi più caldi, e una diminuzione del loro numero in quelli più freddi. - Inquinamento Nei siti contaminati si rileva, generalmente, un’elevata densità di epibatteri totali e valori molto bassi della frazione bioluminescente (basso valore del rapporto). - Materiale organico In prossimità di scarichi organici la concentrazione di epibatteri totali subisce un notevole incremento; l’elevata densità batterica persiste anche nel caso in cui le acque siano fredde. Conclusioni Bibliografia 1) Sbrilli G. et al., Marine heterotrophic bacteria as indicators in the quality assessment of coastal waters: introducing the “Apparent Bacterial Concentration” approach; Environmental Toxicology and Chemistry, Vol.16, No.2,pp. 135-139, 1997. 2) Bacci E. et al., Marine bacteria as indicators of water quality; Chemosphere, Vol. 28 No.6,pp. 1165-1170, 1994. 3) Sbrilli G. et al., Batteri eterotrofi e qualità delle acque costiere: studio di un tratto di costa toscana; Biologi Italiani,1996,17: 785-788. 4) Sbrilli G., Cruscanti M., I batteri marini planctonici,componente fondamentale dell’ecosistema pelagico e sensibili indicatori della qualità delle acque costiere; Biologi Italiani, 4/99. 5) Cruscanti M. et al., I batteri luminescenti: variazioni stagionali ed effetti di uno scarico termico sull’abbondanza e composizione in specie in acque costiere temperate; Biologi Italiani, 11/97. Ringraziamenti Si ringrazia per la preziosa collaborazione la Sig.ra Emilia Antonacci, il Sig.Angelo De Biase, il Sig. Marino Caracciolo