Fibrosi Cistica I Lezione 7 By NA.

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1 Fibrosi Cistica I Lezione 7 By NA

2 Cos’e’ la Fibrosi cistica
FACIES ECCESSIVA PRODUZIONE DI SECREZIONI DENSE. Malassorbimento cronico che comporta incapacita’ di crescere normalmente(deficit della secrezione degli enzimi pancreatici e quindi insufficiente digestione delle proteine e grassi). Frequenti infezioni del tratto respiratorio da semplici raffreddori a polmoniti (ostruzione delle vie respiratorie minori da parte di un muco denso e loro colonizzazione da parte di batteri). SECREZIONE DI NaCl NEL SUDORE(TEST DIAGNOSTICO) 1 affetto/2500 1 portatore/25 H-W q2 = 1/2500 q=1/50 p=1-q=49/50   2pq=2x49/50x1/50= 1/25 LA CF E’ SOGGETTA AD EFFETTO DEL FONDATORE (e’ presente in molte razze, ma e’ piu’ frequente nella popolazione del Nord-Europa) By NA

3 Eredita’ autosomica recessiva
GENITORI PORTATORI HANNO IL 25% DI PROBABILITA’ DI AVERE UN FIGLIO AFFETTO E INDIVIDUI SANI CON UN FRATELLO O SORELLA AFFETTO HANNO 2/3 DI PROBABILITA’ DI ESSERE PORTATORI. Aa Aa aa aa A- I portatori di CF sono molto frequenti anche per effetto del VANTAGGIO DELL’ETEROZIGOTE: gli eterozigoti hanno un vantaggio riproduttivo rispetto agli omozigoti (potrebbe essere dovuto al fatto che sono maggiormente resistenti alla salmonella tiphi, un batterio che richiede Cl per crescere e riprodursi e la CF e’ causata da un difetto del canale del Cl). By NA

4 Fibrosi Cistica un po’ di storia
1985: Analisi di linkage: il gene della fibrosi cistica (CF) viene associato ad un polimorfismo proteico (enzima paraossonasi) di cui si ignora la localizzazione. Perche’ il linkage? Perche’ non si hanno informazioni sulla natura del prodotto del gene: si sa solo che da qualche parte del genoma c’e’ un locus la cui sequenza, quando mutata, provoca la Fibrosi cistica. Si applica il clonaggio posizionale By NA

5 Ripuntualizziamo la definizione di gene
il “gene” mendeliano e’ un entita’ astratta identificata dalla modalita’ di segregazione e dalla mappatura in un locus il “gene” molecolare e’ una sequenza codificante con una organizzazione definita: 5’UTR, esoni,introni, 3’UTR corrispondente ad una sequenza amminoacidica o piu’genericamente ad un trascritto il locus e’ una regione genomica la cui espressione porta ad un fenotipo: per cui e’ piu’ giusto parlare di locus-malattia che di gene-malattia. Il locus puo’ essere piu’ grande del gene molecolare. Il linkage si fa fra locus, non fra geni molecolari By NA

6 adesso so dove andarlo a cercare
Come fare il linkage Testando tutte le famiglie in cui e’ presente almeno un affetto con polimorfismi del DNA di cui si conosce la localizzazione. Quando si trova il linkage ho mappato fisicamente il locus Ho trovato il gene?! NO!!! Non ho trovato il gene corrispondente al mio carattere : adesso so dove andarlo a cercare Torniamo a Mendel By NA

7 Durante la formazione dei gameti la segregazione di una coppia di
alleli di un locus e’ indipendente dalla segregazione degli alleli di un’altro locus 2a legge di Mendel By NA

8 Risultati possibili Rapporto fenotipico diverso dovuto alla formazione di 4 tipi di gameti che si originano tutti con la stessa probabilita’ e diano tutte le possibili combinazioni RY 1/4 Ry ry rY RRYY 1/16 RRYy RrYy RrYY RRyy Rryy rryy rrYy rrYY Gameti 1 : : By NA

9 Rapporto mendeliano nell’assortimento indipendente
A1 A1 B1 B1 A2 A2 B2 B2 X P A1/A1;B1/B1 A2/A2;B2/B2 A1 A2 B1 B2 F1 A1/A2;B1/B2 Meiosi 4 tipi di gameti in rapporti uguali A1 B1 A1 B2 A2 B1 A2 B2 A1 B1 X gamete A1/A1 B1/B1 1A1B1 1A1B2 1A2B1 1A2B2 1 A1/A1;B1/B1 : A1 A1 B1 B1 1 A1/A1;B1/B2 : A1 A1 B2 B1 1 A1/A2;B1/B1 : A2 A1 B1 B1 1 A1/A2;B1/B2 A2 A1 B2 B1 F2 By NA

10 Rapporto genotipico nell’associazione completa
A1/A1;B1/B1 X P F1 A2/A2;B2/B2 A1 B1 A2 B2 A1/A2;B1/B2 meiosi A1 B1 1 A2 B2 1 A2 B2 2 tipi di gameti in rapporti uguali X gamete A2;B2 A1 B1 A2 B2 A2 B2 F2 A1/A2;B1/B2 A2/A2;B2/B2 By NA

11 Rapporto genotipico nella associazione parziale
B1 A2 B2 P X A2/A2;B2/B2 A1/A1;B1/B1 A1 B1 A2 B2 A1/A2;B1/B2 F1 4 tipi di gameti in rapporti non uguali 80% parentali 20% ricombinanti A1 B1 A2 B2 A1 B2 A2 B1 A1 B1 gamete A1;B1 X A1 B1 A2 B2 A1 B1 A1 B2 B1 A2 B1 A1 F2 : : : By NA 4 A1/A1;B1/B1 4 A1/A2;B1/B2 1 A1/A1;B1/B2 1 A1/A2;B1/B1

12 Ricordiamo l’incrocio a 3 punti
A B C a b c tutti i possibili gameti A B C A B c crossing over #2 parentali a b c a b C crossing over #1 A b c crossing over 1+2 A b C a B C a B c Ma questo incrocio ha “l’aplotipo” noto! By NA

13 Ancora terminologia Aplotipo: genotipo del gamete. Se prendo in considerazione 3 locus ognuno presente nella popolazione con 2 alleli i genotipi possibili nei gameti sono: A1,B1,C1; A2,B1,C1; A1,B2,C2; A1,B1,C2; ETC.... a priori non so chi sta con chi. Nelle popolazioni naturali solo l’analisi della progenie mi dice quale era l’aplotipo dei parentali e solo nei grandi numeri. Le cose si complicano ulteriormente quando non disponendo di “fenotipi codominanti” come i polimorfismi posso seguire i loci solo con caratteri soggetti alla dominanza e recessivita’. In alternativa al termine aplotipo si usa spesso il termine fase Ricordate fase cis e trans? Accoppiamento e repulsione? Sono sinonimi di aplotipo sopratutto quando si parla di locus corrispondenti a caratteri dominanti e recessivi By NA

14 Probabilita’ di trovare ricombinanti
NB non si conosce la loro posizione reciproca quindi ci sono due possibilita’ A B a b SE I LOCI NON SONO ASSOCIATI LA PROBABILITA’ E’ 1/2 X 1/2 X 1/2 X1/2 = 1/16=0.0625 SE I LOCI SONO ASSOCIATI LA PROBABILITA DIPENDE DA QUANTO SONO DISTANTI SE LA FREQUENZA DI RICOMBINAZIONE E’ 10% RICOMBINANTE LA P DI 3 NR E 1R= 0.1X0.9X0.9X0.9=0.073=7.3% NON RICOMBINANTI Non ho la possibilita’ di scegliere fra le due ipotesi: solo un gran numero di osservazioni mi potrebbe permettere di riconoscere quale e’ la situazione piu’ probabile NON ESISTE NULLA CHE POSSA SOSTITUIRE I GRANDI NUMERI….COME POSSIAMO OTTENERE GRANDI NUMERI NELL’UOMO??? By NA

15 Linkage:fase ATTENZIONE ALLA RICOSTRUZIONE DELLA FASE
Fase : combinazione degli alleli di una regione che deriva da ciascun genitore. Se la fase non e’ nota bisogna sommare il lod score che si ottengono ipotizzando le possibili fasi. Meiosi informative: sono quelle che danno informazioni sulla ricombinazione. a1a a2a2 a1a a1a2 a1a a1a2 a1a a3a4 a1a a1a a1a a1a4 non infor. non infor. infor. infor. By NA

16 Linkage:fase di piu locus
Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle famiglie. E’ necessario risalire alla fase e identificare i ricombinanti Ricomb A B C D E F 7 5 4 6 2 A B C D E F 8 6 3 2 1 A B C D E F 6 5 2 A B C D E F 2 1 9 5 A B C D E F 2 5 A B C D E F 1 4 3 7 5 A B C D E F 6 5 2 A B C D E F 2 1 9 5 A B C D E F 3 6 5 7 8 A B C D E F 7 4 2 5 A B C D E F 2 5 6 A B C D E F 1 4 3 7 5 A B C D E F 6 5 2 A B C D E F 2 1 9 5 8 8 3 2 7 10 A B C D E F 10 4 6 1 8 3 2 7 10 A B C D E F 10 3 2 5 8 8 3 2 7 10 A B C D E F 5 3 1 7 A B C D E F 8 3 4 2 A B C D E F 10 3 2 5 8 Possedere un particolare polimorfismo non vuol dire avere la malattia, lo studio di linkage e’ a livello di popolazione, serve ad individuare una regione non la mutazione patologica(tutti hanno il locus alcuni hanno l’allele mutato in patologico) A B C D E F 2 1 6 A B C D E F 8 6 3 2 1 A B C D E F 6 5 2 A B C D E F 7 5 4 6 2 A B C D E F 6 5 2 A B C D E F 3 6 5 7 8 A B C D E F 6 5 2 A B C D E F 7 4 2 5 By NA

17 Linkage possibili inconvenienti
Ci possono essere inconvenienti che complicano la possibilita’ di assegnare un locus malattia a una regione definita da marcatori: Errori umani: errata lettura dei dati, scambio di campioni, paternita’…… Errori diagnostici: un falso ricombinante.Se i marcatori sono molti e vicini la presenza di un doppio ricombinante fa sospettare un errore Eterogeneita’ genetica: famiglie con fenotipo simile vengono accorpate e non si riesce a trovare il linkage. Sclerosi tuberosa: due loci distinti Nelle recessive il problema e’ la necessita’ di utilizzare solo le famiglie piccole. E’ importante disporre di numerosi siti polimorfici By NA

18 I polimorfismi Oggi si dispone di una serie di nuovi
polimorfismi del DNA che permettono di aumentare l’informativita’ degli incroci By NA

19 Polimorfismo RFLP esempio
Lunghezza dei frammenti Alleli identificati dall’ibridazione su Southern I1 I2 II1 II2 I3 I4 III1 III2 III3 III4 III5 III6 III7 III8 Possibile interpretazione dei risultati Polimorfismo RFLP esempio I II III By NA

20 A, B, C, D,E sono indiziati di stupro chi e’ il padre del bambino?
RFLP e Paternita’ A B C D E F G F e’ la madre di G A, B, C, D,E sono indiziati di stupro chi e’ il padre del bambino? E By NA

21 due individui, tre enzimi
B=BamHI E= EcoRI H=HindIII H E B B*E H B 10KB 13KB 3.7KB 2.8 Evidentemente c’e’ un sito B polimorfico perche’ un soggetto e’ omozigote per 2.8 e l’altro per 13. La lunghezza dei frammenti mi permette di costruire una mappa di restrizione e di mappare la sonda rispetto ai siti. La differente quantita’ di DNA fra i due campioni e’ evidente dalle diverse dimensioni del segnale Gel Filtro corrispondente E’ quindi presente un polimorfismo, probabilmente frequente nella popolazione: infatti se prendendo due individui a caso nella popolazione trovo due omozigoti e’probabile che gli eterozigoti siano frequenti. Per gli altri due siti non si puo’ dire se siano polimorfici o no: due individui sono troppo pochi per escluderlo. By NA

22 Polimorfismo PCR Mini e micro satelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con PCR By NA

23 SSCP : Single Strand Conformational Polymorphism
Omozigote Wild-type OmozigoteMutante PCR Eterozigote C C A G G T C A A G T T Denaturazione C A C G T G A A C T Caricamento su gel G T Reverse Forward Reverse Forward G T A VARIAZIONI ANCHE DI 1 SOLA BASE PROVOCANO UNA DIFFERENZA NELLA CORSA SU GEL C Omo WT etero Omo mut Questo test si utilizza per identificare la variazione di una base senza dover ricorrere al sequenziamento. Si possono identificare il 70%-95% delle mutazioni di singola base in frammenti di lunghezza inferiore alle 200pb. By NA

24 SNPs dopo digestione con TaqI.
La sostituzione di una base puo’ provocare la perdita o l’insorgenza di un sito di restrizione, utilizzando PCR e digestione dell’amplificato si puo’ rapidamente evidenziare l’avvenuto cambiamento senza utilizzare il southern, il radioattivo etc.. Gene qualunque: non e’ importante chi e’ e’ il concetto che conta 1241bp L’allele XT e XC sono distinguibili dopo digestione con TaqI. L’amplificato e’ di 1241 bp dopo digestione se e’ presente la sostituzione si hanno 2 bande 750bp 491bp XCXC XCXT XCXC XCXC By NA

25 SNPs Gene qualunque: non e’ importante chi e’ e’ il concetto che conta L’allele XT e XG sono distinguibili dopo digestione con PvuII. L’amplificato e’ di 1392 bp dopo digestione se e’ presente la sostituzione si hanno 2 bande: 1163 e 229 1392bp 1163bp La banda di 229 non si vede 1, 2, 4, 7, 8 sono eterozigoti XTXG 3,9, 12 sono omozigoti XTXT 5,6,10, 11 sono omozigoti XGXG By NA

26 SNPs Gene qualunque: non e’ importante chi e’ e’ il concetto che conta
L’allele YT e YC sono distinguibili dopo digestione con HgaI. YT non si digerisce e rimane di 220 bp, YC origina due bande 180bp e 40bp (che non si vede) C 220bp 180bp C0 controllo senza DNA :il bianco e’ importante nella PCR come il marker 3 omozigote YTYT - 1, 4, 6, 7, omozigoti YCYC - 2, 5 eterozigoti YC YT By NA

27 Gli STS: Sequence Target Site
L’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (300pb) clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui . Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche che fisiche e permettono di legarle fra loro H F* Q A* C B* D G* mappa fisica:contiguo 1 2 A C B D G H F Q DNA genomico A+,B-,C+.. A-,B+,C+.. B+,D+,G+ H+,F+,T-.. F+,T-,Q+.. Clonaggio mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e’ F-A-G Sequenziamento A C B D G H F Q I due contigui sono sullo stesso cromosoma e via cosi.... screening library con PCR GACTTAG CATAGCA ~300bp scelta dei primers x A,B,C.. STS A,B,C.. By NA

28 Come fare il linkage Si ricorre al lod score
Il calcolo del linkage e’ quindi statistico: occorre una progenie numerosa e bisogna conoscere la fase (aplotipo) dei parentali. come si fa visto che le famiglie umane sono di solito piccole? Si ricorre al lod score By NA

29 Linkage-lod score Il linkage e’ una relazione di vicinanza fra due loci ed e’ funzione della loro distanza. La definizione di un linkage fra due loci si basa su calcoli statistici che permettono di quantizzare la probabilta’ che i risultati ottenuti non siano dovuti al caso . Nel caso dell’uomo l’analisi della progenie di una singola famiglia raramente fornisce informazioni sia per lo scarso numero di meiosi sia per la difficolta’ di risalire alla fase. Bisogna mettere insieme i dati provenienti da piu’ famiglie. (1-n r P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati Odds ratio= (1/2)n+r P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti Lod score: logaritmo in base 10 dei singoli rapporti di ogni famiglia, si possono cosi sommare. Un valore di 3 indica linkage. By NA