La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza aminoac.Mappatura genetica con marcatori polimorfici.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza aminoac.Mappatura genetica con marcatori polimorfici."— Transcript della presentazione:

1 Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza aminoac.Mappatura genetica con marcatori polimorfici Deduzione sequenza nucleotidicaIdentificazione cloni genomici che coprono il sito mappato Sintesi sonda oligonucleotidicaRicerca del gene (varie tecniche) Isolamento clone di cDNADeduzione della struttura aminoac. Isolamento clone genomicoRicerca mutazioni nucleotidiche nelle famiglie affette Caratterizzazione clone genomicoRicerca funzione proteica Ricerca di mutazioni nucleotidiche

2 MARCATORI GENETICI Un marcatore genetico è paragonabile ad un cartellino colorato che serve a marcare gli individui in un pedigree. Un marcatore genetico per essere tale deve essere polimorfico ed i suoi diversi alleli possono essere utilizzati per seguire la segregazione di alleli per un altro gene quando si effettuano incroci.

3 TIPI DI MARCATORI POLIMORFICI - Polimorfismi immunologici (es: gruppi sanguigni, rilevabili con tecniche sierologiche) - Polimorfismi genetici a livello proteico (rilevabili attraverso lelettroforesi ed altre tecniche di caratterizzazione degli isozimi) - Polimorfismi genetici a livello del DNA

4 VARIABILITA GENETICA SEMPLICE POLIMORFISMO: presenza di 2 o più fenotipi alternativi (morfi) a trasmissione mendeliana MORFI: generalmente determinati da alleli diversi ereditati in modo mendeliano POLIMORFISMO GENETICO Carattere monogenico presente in una popolazione con una frequenza 1% ETEROZIGOSITA (H) f(A) = p f(B) = q H = 2pq H aumenta in relazione al numero di alleli del locus

5 TIPI DI MARCATORI GENETICI NELLUOMO Tipo di marcatoren° lociCaratteristiche Gruppi sanguigni 20sangue fresco, dominanza Varianti proteiche 30siero fresco, saggi specialistici, polimorfismo limitato RFLP del DNA> alleli, eterozigosità massima 0, VNTR del DNA>10 4 Molti alleli, altamente informativi (minisatelliti) VNTR del DNA>10 5 Molti alleli, altamente informativi (microsatelliti) SNP del DNA>10 6 Meno informativi dei microsatelliti 1998-

6 LIVELLO DI POLIMORFISMO - Eterozigosità - Contenuto dinformazione del polimorfismo (Polymorphism Information Content = PIC) TASSO DI MUTAZIONE Singola Sostituzione Nucleotidica (SNS): Variable Number of Tandem Repeat (VNTR): minisatelliti microsatelliti Il genoma è un serbatoio potenziale di polimorfismi così vasto da consentire di individuare i marcatori più adatti per affrontare un ampio spettro di problematiche della genetica delle popolazioni umane.

7 Analisi della segregazione degli alleli per il locus A e degli alleli del locus B Dalle meiosi di II-1 è possibile stabilire: 5 combinazioni parentali e 2 ricombinanti 12 MAPPAGGIO GENETICO DEI CARATTERI MENDELIANI Dopo quante meiosi si può stabilire se i loci A e B sono associati o indipendenti?

8 LA MAPPATURA GENETICA PRIMA DEI MARCATORI MOLECOLARI DEL DNA Gruppi di associazione con loci (marcatori proteici) noti: ABO - adenilatochinasi ABO - sindrome unghia- rotula Duffy - cataratta congenita Rh - ellissocitosi Collinesterasi - transferrina Lutheran - secretore G6PD - emofilia G6PD - daltonismo A 1 Y A 1 /A 2 c A 2 Y A 2 = Allele enzimopenia G6PD D/d D D D A 1 Y d d = allele daltonismo

9 A 1 A 2 A 1 A 2 A) NON INFORMATIVA Gli alleli del marcatore in omozigosi nel padre non possono essere distinti B) NON INFORMATIVA A 1 A 2 La figlia può aver ereditato A 1 dal padre e A 2 dalla madre o viceversa MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE

10 C) INFORMATIVA A 1 A 2 A 1 La figlia ha ereditato A 1 dal padre (fratria A 1 A 1 alternativa a A 1 A 2 della famiglia B) D) INFORMATIVA A 1 A 2 A 3 A 4 A 1 A 4 La figlia ha ereditato A 1 dal padre

11 UNA MEIOSI E INFORMATIVA, OVVERO UTILE PER GLI STUDI DI ASSOCIAZIONE (LINKAGE), QUANDO SI PUO IDENTIFICARE LA FASE DEI 2 LOCI E QUINDI STABILIRE SE IL GAMETE E O MENO RICOMBINANTE PERCHE LA MEIOSI SIA INFORMATIVA IL GENITORE DEVE ESSERE DOPPIO ETEROZIGOTE PER I DUE LOCI Es: locus malattia: Allele normale (+)/Allele mutato (-) marcatore: A 1 /A 2

12 MarcatoreAlleli (Frequenze H PIC alleliche) A1 0 0 A 2 (0,5; 0,5) 0,50 0,375 A 2 (0,4; 0,6) 0,48 0,365 A 2 (0,3; 0,7) 0,42 0,332 A 2 (0,1; 0,9) 0,18 0,164 A 4 (0,25;0,25;0,25; 0,25) 0,75 0,703 A 10 (tutti = 0,1) 0,90 0,891 X 2 (0,5; 0,5) 0,5 0,5 X 4 (0,25;0,25;0,25; 0,25) 0,75 0,75

13 1) Raccolta famiglie con diagnosi certa di una specifica malattia il cui locus genico è ignoto 2) Costruzione degli alberi genealogici di tutte le famiglie 3) Determinazione del genotipo di tutti gli individui per uno o più marcatori polimorfici 4) Se la famiglia è informativa, si classificano gli individui in ricombinanti o non ricombinanti tra il locus della malattia ed il marcatore analizzato ……… MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI

14 1 2 MAPPAGGIO GENETICO DEI CARATTERI MENDELIANI Dalle meiosi paterni: i loci A e B sono indipendenti o associati? Non si possono classificare II-2 e tutti gli individui della III generazione rispetto a II-2 (omozigote A 1 A 1 B 1 B 1 )

15 Sacchetto con monete di tre possibili tipi: TT (monete con T su entrambe le facce), oppure TC, oppure CC 4 lanci: T, T, T, T E possibile capire da che tipo di monete è fatto il sacchetto? Ipotesi che siano CC = Scartata Ipotesi possibili: A: che siano TT B: che siano TC Se non si fossero fatti lanci Ipotesi A: Ipotesi B 1:1 Si intende per VEROSIMIGLIANZA di unipotesi A, rispetto ad una serie di fatti che costituiscono il risultato R, la probabilità con cui si sarebbe verificato R se A fosse stata vera.

16 Si confrontano le VEROSIMIGLIANZE di tutte le ipotesi per accertare se una è risultata MOLTO PIU VEROSIMILE delle altre Verosimiglianza dellIpotesi A = 1 (che siano TT) Verosimiglianza dellipotesi B = (1/2) 4 = 1/16 1 Rapporto = 16 :1 1/16 Quanti lanci bisogna fare prima di assumere che siano TT? Si decide una soglia per 2 motivi: 1) ridurre al minimo i casi in cui si accetta per buona unipotesi che invece è sbagliata; 2) ridurre al minimo i casi in cui si lascia senza risposta il problema in esame

17 Rapporto della verosimiglianza = (1- ) 5 x 1 / (1/2) 6 (1- ) 5 x 1 Lod score Z = log (1/2) 6 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Z - 0,577 0,623 0,509 0,299 0 UN ESEMPIO DI CALCOLO DI LOD SCORE NR R Probabilità di meiosi ricombinante = Probabilità di meiosi non ricombinante = (1- ) Probabilità 5 NR e 1R = (1- ) 5 x 1 Probabilità totale in assenza di associazione = (0,5) 6 = (1/2) 6 Caso in cui II 1 ha fase nota

18 Z = lod score 1000 Z = log = 3 (p=0,05) 1 Z > 3 EVIDENZA DI LINKAGE 1 Z = log = Z < - 2 ESCLUSIONE DI LINKAGE 3 > Z > - 2 NON CONCLUSIVI PER IL LINKAGE SENZA RICOMBINANTI MASSIMO DI LOD SCORE E PER = 0 INTERVALLO DI CONFIDENZA (95%): LOD SCORE - 1 es. curva 2 max lod score = 3.7 per = 0.23 limiti fiduciali: LE CURVE DEI LOD SCORE

19 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Z - 0,577 0,623 0,509 0,299 0 (1- ) 5 x 1 Lod score Z = log (1/2) 6

20 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Z - 0,276 0,323 0,222 0,074 0 (1- ) 5 x 1 (1- ) 1 x 5 Z = log (1/2) 6 (1/2) 6

21 1) Raccolta famiglie con diagnosi certa di una specifica malattia il cui locus genico è ignoto 2) Costruzione degli alberi genealogici di tutte le famiglie 3) Determinazione del genotipo di tutti gli individui per uno o più marcatori polimorfici 4) Se la famiglia è informativa, si classificano gli individui in ricombinanti o non ricombinanti tra il locus della malattia ed il marcatore analizzato ……… MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI

22 5) Nel caso di meiosi non informative non è possibile stabilire con certezza gli individui ricombinanti e non ricombinanti e quindi se i due loci sono associati 6) Estensione della tipizzazione a più famiglie Come si stabilisce se i due loci sono associati? 7) Analisi dellassociazione tra il marcatore ed il locus attraverso il calcolo del lod score per ogni singola famiglia 8) Valutazione del lod score complessivo e utilizzazione del criterio statistico per decidere lassociazione o lesclusione di associazione MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI......

23 Rispetto alla combinazione parentale (II-1): 5 NR, 2 R Frequenza di ricombinazione = 2/7 = 28,6% 12 STIMA DELLA DISTANZA GENETICA TRA MARCATORI

24 Esempio di analisi di associazione tra marker M e malattia AD Stima della frequenza di ricombinazione = 2/6 = 0,33

25 IL LINKAGE A DUE O PIU PUNTI E ESSENZIALE PER LA COSTRUZIONE DELLE MAPPE MARCATORE - MARCATORE QUESTO E STATO OTTENUTO CON: - COLLEZIONE DI FAMIGLIE CON STRUTTURA IDEALE RACCOLTE A QUESTO SCOPO DAL CEPH DI PARIGI (CENTRE POUR LETUDE DES POLYMORPHISMES HUMAINES): 40 famiglie con 3 generazioni e almeno 6 figli) - ANALISI DI MARCATORI POLIMORFICI (SOPRATTUTTO MICROSATELLITI) LOCALIZZATI SU TUTTI I CROMOSOMI IN FAMIGLIE CEPH ED ISTITUZIONE DI UNA BANCA DATI - DETERMINAZIONE DELLORDINE DEI LOCI NELLE MAPPE MARCATORE – MARCATORE E DEFINIZIONE DELLE DISTANZE IN CENTIMORGAN

26 ESEMPIO DI FAMIGLIA CEPH

27 IL PROGETTO GENOMA UMANO PER LA MAPPATURA DEL GENOMA UMANO SONO STATI UTILIZZATI NUMEROSISSIMI MARCATORI POLIMORFICI (RFLP E VNTR), NON NECESSARIAMENTE CORRELATI A GENI ESPRESSI, CON MODALITA DI TRASMISSIONE MENDELIANA Utilizzi: 1) Mappatura genetica di loci sconosciuti responsabili di malattie genetiche; 2) Clonaggio genico; 3) Diagnosi prenatale e presintomatica. 23 GRUPPI DI ASSOCIAZIONE (22 AUTOSOMI E CROMOSOMA X)

28 Mappatura genetica Mappatura fisica bassa risoluzione Mappatura fisica alta risoluzione Mappatura del trascritto Sequenziamento del gene

29 A1A2 Dd A1 D D A2 d d d A3 dd A2 d A3A2 Dd A3 D D A2 d d d A3 dd A2 d A4 Dd A2 D D A4 d d d A2A3 dd A2 d Associazione (linkage) tra il locus A e il locus ignoto in 3 famiglie con la stessa patologia A4 d A2 d

30 STIMA DELLA RELAZIONE TRA DISTANZA GENETICA E FISICA Stima della distanza genetica totale nella specie umana: somma della lunghezza totale dei cromosomi ottenuta dalla mappatura genetica attraverso meiosi di origine paterna o materna = 2644 cM (maschio) = 4481 cM (femmina) Per 3000 Mb = 3 x 10 9 bp di genoma Maschio 1 cM = 1.13 Mb = 1.13 x 10 6 bp Femmina 1 cM = 0.67 Mb = 0.67 x 10 6 bp Media : 1 cM = 0.9 Mb = 0.9 x 10 6 bp

31 Il tasso di ricombinazione non è identico lungo il cromosoma

32 La distribuzione dei ricombinanti lungo il cromosoma non è casuale e dipende dal sesso


Scaricare ppt "Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza aminoac.Mappatura genetica con marcatori polimorfici."

Presentazioni simili


Annunci Google